高效降解巨龍竹白腐菌株篩選及降解機制研究

楊 雄 史正軍 趙長林

（1. 西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學化學工程學院，云南 昆明 650233）

木質素在自然界中含量非常豐富，它是一種擁有極其復雜結構的天然高分子化合物，在高等植物細胞壁中木質素廣泛存在，是僅次于纖維素的一種生物多聚體化合物[1-2]，微生物難以降解木質素的原因在于木質素中各種生物學穩(wěn)定的復雜鍵型[3]。如何高效率的利用這類作物資源為目前所研究的熱點課題，傳統(tǒng)工業(yè)制備纖維素材料的方法不僅浪費大量的化學資源和能源，產生的制漿廢液也污染環(huán)境[4-5]；白腐真菌是目前應用廣泛的、公認安全環(huán)保且無公害的可以將木質素降解為簡單無機物的一類微生物[6]。木材腐朽真菌主要包括白色腐朽菌和褐色腐朽菌2種[7-8]，其中白色腐朽真菌是木材腐朽真菌中最大的類群，包括大部分木生擔子菌、少數(shù)子囊菌和半知菌[9-13]，大多白腐菌可產生漆酶和錳過氧化物酶，極少數(shù)能產生木質素過氧化物酶[14-16]，使木質素發(fā)生側鏈氧化斷裂、β-芳醚鍵斷裂、芳香環(huán)氧化開裂以及苯環(huán)上脫甲氧基或甲基化反應而降解[17]；同時木材腐朽真菌也是森林生物多樣性的重要組成部分，在森林生態(tài)系統(tǒng)中起著關鍵的降解還原作用，能維持森林生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動[18-20]。

巨龍竹（Dendrocalamus sinicus）屬禾本科竹亞科牡竹屬竹種，熱帶巨大型叢生竹，為我國特有物種，發(fā)現(xiàn)于云南省西南部臨滄、西雙版納地區(qū)，其生長速度快、經濟用途廣、生態(tài)效益顯著，作為一種特色明顯的資源植物具有很大的開發(fā)潛力和廣泛的應用前景[21-26]；因該物種發(fā)現(xiàn)時間較晚，分布地區(qū)科研資金投入不足、科研水平相對落后，對巨龍竹深入開發(fā)應用欠缺，尤其在巨龍竹木質素降解研究方面還遠遠不夠[27-28]，如巨龍竹在制漿造紙、人造板材和生物精煉工業(yè)領域有極高的開發(fā)潛力，但由于木質素的存在導致纖維素在分離過程中呈現(xiàn)耗能高、污染大、耗時多、產量低、其不僅浪費資源同時污染環(huán)境[4-5,29]。因此，針對目前存在木質素限制竹資源高效深度開發(fā)利用，傳統(tǒng)物理化學預處理方法既不經濟又不環(huán)保的問題，本研究提出利用生物方法降解竹材中的木質素觀點，并利用固體發(fā)酵法和化學測定法篩選高效降解巨龍竹木質素的菌株；采用形態(tài)學與分子系統(tǒng)學相結合方法將該菌株鑒定；通過主成分分析揭示存在的降解類型；運用紫外掃描法揭示木質素初步降解機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

野外調查并采集白色腐朽真菌，并記錄采集編號、采集地點、寄主信息，將新鮮標本帶回實驗室進行分離純化，將分離純化出的白色腐朽真菌菌株保存于4 ℃冰箱備用。本研究共分離純化出可用于巨龍竹竹材降解的菌株30號（表1），現(xiàn)保藏于西南林業(yè)大學真菌標本館（SWFC）。巨龍竹材料采自于云南省臨滄市的滄源地區(qū)。

表 1 供試白腐菌株Table 1 The information for the test strain of white rot fungi

續(xù)表 1

1.2 竹材降解試驗

1.2.1竹材的固體發(fā)酵

1）將新鮮的巨龍竹切成約3 cm×1 cm×0.3 cm的竹片，放入烘箱105 ℃烘干至恒質量。

2）將上述烘干后的竹片取出5 g（精確到0.000 1 g）分別放入培養(yǎng)皿中寫上標簽，依次加入適量的水，充分淹沒浸泡12 h。

3）到達規(guī)定時間后，瀝干表面水分，121 ℃滅菌30 min備用。

4）取供試菌株菌柄餅（約1 cm2）接種在裝有2%麥芽浸粉培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃濕度75%靜置培養(yǎng)。

5）待菌絲長滿培養(yǎng)基表面，放入上述滅菌的5 g竹片，用接種針將其均勻分布于培養(yǎng)基表面，放入恒溫恒濕箱培養(yǎng)箱，溫度28 ℃、濕度75%靜置培養(yǎng)30 d；每個菌種2個重復，未接種的2組竹片作為空白對照組。

6）30 d后取出樣品，洗去木片表面的菌絲（洗的過程應防止竹材的細小部分掉落，影響失重率的測定），105 ℃風干至恒質量[30]。

1.2.2竹材化學組分的測定

用定性濾紙將上述風干后的樣品包好并用棉線捆牢，參照國標GB/T 2677.6—1994[31]加入苯醇混合液進行抽提，每小時約4次循環(huán)，抽提時間為6 h，然后將抽提好的樣本放入烘箱105 ℃烘至恒質量，參照國標GB/T 2677.10—1995[32]測定綜纖維素含量，參照國標GB/T 2677.8—1994測定Klason木素含量[30]。

1.2.3失重率、木質纖維素降解率及選擇系數(shù)的計算

1.3 分析方法

1.3.1主成分分析方法

利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，將竹材失重率及各化學變量提取2個主成分并計算其主成分得分系數(shù)。根據(jù)得分系數(shù)計算出每株菌的主成分得分，并做出主成分分析散點圖[30]。

1.3.2紫外掃描分析方法

1）取1 g過40目標準篩的竹粉與適量的質量體積分數(shù)2%的麥芽浸粉培養(yǎng)基裝入到三角瓶中（250 mL）滅菌備用；

2）向上述滅菌后的三角瓶中接入供試菌株的菌餅（約1 cm2），放入培養(yǎng)箱恒溫恒濕靜置培養(yǎng)20 d。未接種的作為對照組，處理同上；

3）培養(yǎng)20 d后，向每個三角瓶中加入50 mL 95%乙醇，瓶口覆蓋上錫箔紙，50 ℃發(fā)酵1 h；

4）發(fā)酵結束后放入冰箱中冷卻至室溫；

5）取2 mL菌液放于離心管中，10 000 r/min離心2 min；

6）取上清液以1∶10的比例與95%乙醇混合稀釋；

7）室溫下測220～400 nm的光譜值[30]。

1.4 菌株鑒定方法

1.4.1DNA提取、PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

OMEGA HP Fungal DNA Kit試劑盒用于SWFU 000072菌株DNA基因組提取[33]。本研究選用ITS基因片段完成系統(tǒng)發(fā)育分析，引物ITS5/ITS4[34]，訂購在生工生物工程（上海）股份有限公司。ITS片度PCR程序參考木腐菌系統(tǒng)發(fā)育研究[33]，產物純化和測序均送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司。

DNA序列用MAFFT version 7（http://mafft.cbr.jp/alignment/server）進行比對，手工校正和去掉兩端參差排列后保存為NBRF/PIR格式文件，再用ClustalX 1.83[35]將NBRF/PIR格式文件轉化為NEXUS格式文件以及PHYLIP格式文件；經過編輯后用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。系統(tǒng)發(fā)育樹構建采用PAUP* 4.0b10[36]中的最大簡約法（maximum parsimony analysis）；設置如下：1）非模糊排列的缺失位點處理為新特征（new state）；2）模糊排列位點不予采用；3）進行1 000次自持分析[37]；4）所有特征等權；5）采用啟發(fā)式搜索方式（heuristic search）;（6）Max-trees設為5 000，其他參數(shù)采用默認值[37]。

1.4.2形態(tài)學研究方法

宏觀研究方法：肉眼直接觀察及在體視顯微鏡下觀察林木腐朽真菌標本以下主要特征并拍照記錄：

1）一般特征：一年生/多年生，有柄/菌蓋/平伏反轉/平伏，大小，形狀，厚度，質地；

2）菌蓋表面：顏色，光滑/粗糙，絨毛/粗毛，環(huán)溝/環(huán)帶，邊緣薄/厚，銳/鈍，孔口形狀及大小。

顯微研究方法：所有顯微研究均在Nikon Eclipse E 100顯微鏡和Leica DM2500（375582）生物正置熒光顯微鏡下進行。利用Melzer試劑（簡寫為IKI）、棉藍試劑（簡寫為CB）和5%氫氧化鉀試劑（簡寫為KOH）作為浮載劑。真菌定名人名稱的縮寫基于國際縮寫標準Authors of Plant Names[38]；有關子實體的顏色術語則依據(jù)文獻[39]。

2 結果與分析

2.1 竹材降解試驗結果

采用30株白腐菌對巨龍竹竹片開展降解試驗，經過30 d培養(yǎng)后，竹片失重率、綜纖維素降解率、酸不溶木質素降解率發(fā)生變化（表2），其中失重率表示白腐菌對巨龍竹的分解力，其失重率越高表明其對巨龍竹的分解能力越強；由表2可知，巨龍竹竹片的失重率從0.45%至18.36%不等，竹材失重率差距較大，其中SWFU 000096的失重率最高為18.36%，表明其對巨龍竹的降解能力最強，兩菌株SWFU 000089，SWFU 000013次之，失重率依次為15.53%，15.45%。當Klason木素降解率與綜纖維降解率的比值（脫木質素選擇系數(shù)SI）大于1時，則可以判斷木腐菌產生了選擇性脫木質化作用[30]。根據(jù)表2中的選擇系數(shù)SI表明，30個菌株中有10株白腐菌對巨龍竹進行了選擇性脫木質化作用，其菌株編號分別為SWFU 000072、SWFU 000094、SWFU 000013、SWFU 000084、SWFU 000028、SWFU 000086、SWFU 000074、SWFU 000073、SWFU 000097、SWFU 000080，其SI依次為3.10、2.71、2.04、1.80、1.70、1.66、1.25、1.22、1.09、1.05；盡管SWFU 000096對巨龍竹的分解能力最強，但其沒有發(fā)生脫木質化作用，它不加選擇地降解了木質素和綜纖維素，其綜纖維降解率高達19.16%；本研究的目的在于篩選高效選擇性降解巨龍竹木質素的白腐真菌，所以該菌株不滿足條件。失重率相對于SWFU 000096稍低的3個菌株SWFU 000072、SWFU 000094、SWFU 000013，SI依次為3.10、2.71、2.04，表明這3個株菌對巨龍竹的選擇性脫木質化作用更顯著。其中菌株SWFU 000072對酸不溶木素的降解率高達19.65%，對綜纖維素的降解率僅有6.39%，且對巨龍竹綜纖維損失極少，綜合供試菌株降解巨龍竹的數(shù)據(jù)分析，通過SPSS軟件分析了失重率和選擇性系數(shù)兩者的相關性，其相關性系數(shù)為0.450 12，其表明30株白腐菌降解巨龍竹的能力與其選擇性系數(shù)之間沒有明顯的相關關系。

表 2 30株白腐菌降解巨龍竹30 d后各組分情況Table 2 Degradation of different component of D. sinicus treated by 30 white rot fungi for 30 days

2.2 主成分分析結果

為進一步解析30株白腐真菌對巨龍的降解類型，利用竹材失重率及各化學變量提取2個主成分（PC），第1主成分和第2主成分分別解釋了85.43%和12.54%的變量，其表明2個主成分能解釋3個指標總計97.97%的數(shù)據(jù)量。組分降解率的3個指標的數(shù)據(jù)做主成分分析（PCA），其結果顯示上述3個指標。

主成分分析（PCA）結果為：Klason木質素降解率主成分得分系數(shù)PC1=0.345、PC2=1.221，綜纖維降解率主成分得分系數(shù)PC1=0.354、PC2=1.074，失重率主成分得分系數(shù)PC1=0.382、PC2=0.107根據(jù)上述得分系數(shù)利用數(shù)據(jù)處理軟件計算出每株菌的主成分得分，再以表2中30株白腐菌的編號后2位為序號，得出主成分分析散點圖（圖1），其表明當PC1的得分越高，失重率、綜纖維素降解率、木質素降解率就越大；當PC2的得分越高，菌株降解巨龍竹時選擇系數(shù)就越高，結果表明PC2所反映的是菌株對木質素的選擇性降解。本研究主成分分析數(shù)據(jù)變化規(guī)律與微生物在其他植物降解應用研究結果分析趨勢相似[30, 40]。

圖 1 3種指標的主成分散點圖Fig. 1 Main dispersion point diagram of 3 indexes

根據(jù)主成分分值高低劃分類型（圖1），30株白腐菌可分為3種主要的降解類型：類型A包含選擇性降解木質素的菌株，菌株的選擇系數(shù)也越大，PC2分值也相應增高。類型B和C都代表選擇性降解綜纖維素的菌株，但B類型中的菌株對木質纖維素的降解能力極其微弱，C類型中的菌株對巨龍竹綜纖維素和木質素的降解能力都較強，尤其對綜纖維素的降解能力非常強烈，其降解的強烈程度反映在PC1的分值上，PC1分值越大的菌株則綜纖維素降解率越高。圖1顯示SWFU 000072的PC1得分較低，PC2得分最高，其揭示該菌株擇性降解木質素能力在30株白腐菌中最強。

2.3 紫外掃描分析結果

將選擇性系數(shù)大于1的3個菌株SWFU 000072、SWFU 000013、SWFU 000086接種于過40目篩的巨龍竹粉，發(fā)酵20 d后用95%乙醇對的竹粉進行提取，對其提取液進行紫外光譜掃描，其紫外掃描光譜圖（圖2）表明空白對照組的在260 nm有明顯的吸收峰，該吸收峰代表木質素中芳香環(huán)的吸收[41]；而其他組別在260 nm處無明顯的吸收峰。

圖 2 乙醇提取液的紫外光譜圖Fig. 2 UV spectrum of ethanol extract

2.4 菌株鑒定結果

形態(tài)學鑒定結果：如圖3a所示：擔子果1年生，菌蓋表面具粗毛和輪紋，菌肉異質；如圖3b所示：子實層體初期為孔狀，后期撕裂為齒狀；如圖4所示：菌絲系統(tǒng)三體系，生殖菌絲具索狀聯(lián)合，菌絲在Melzer試劑中無反應，在棉藍試劑中無反應，在KOH試劑中無變化。

圖 3 白腐真菌SWFU 000072擔子果形態(tài)特征Fig. 3 Basidiomata of specimen SWFU 000072

圖 4 白腐菌株SWFU 000072菌落形態(tài)Fig. 4 Colony characters of white rot fungi strain SWFU 000072

基于宏觀生境特征（圖3）、培養(yǎng)菌落性狀及顯微菌絲數(shù)據(jù)（圖4），鑒定其為Cerrena屬水平。

分子系統(tǒng)學鑒定結果：如圖5所示，基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株SWFU 000072（GenBank no. MK809429）在系統(tǒng)發(fā)育樹中與分子序列Dai 7 872、Dai 7 359、JXSB1742聚為一個支系，且具有高支持率（100% MP）。因此，該菌株鑒定為Cerrena zonata。

圖 5 白腐菌株SWFU 000072系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 The phylogenetic tree of white rot fungi strain SWFU 000072

3 結論與討論

本研究從30株白腐真菌中篩選出1株高效降解巨龍竹木質素的菌株SWFU 000072，經過形態(tài)學與分子系統(tǒng)學鑒定為Cerrena zonata。基于主成分分析（PCA），揭示30株白腐菌存在3種降解類型：選擇性降解木質素、選擇性降解綜纖維素、強烈地選擇性降解綜纖維素。通過對巨龍竹粉乙醇提取液進行紫外掃描分析表明木質素中的芳香環(huán)結構遭到了破壞，進而揭示了白腐菌通過破壞木質素中的芳香環(huán)結構完成高效降解巨龍竹木質素的降解機制。降解木材及農林廢棄物木質素的真菌在國內外相繼報道，如Ceriporiopsis subvermispora，Ganoderma australe，Lentinus edodes，Phanerochaete chrysosporium，Phlebia radiata，Pleurotus ostreatus，Stereum hirsutum，Trametes versicolor，其降解類型屬白色腐朽[30,42-49]。本研究篩選菌株物種為Cerrena zonata，該種隸屬于Cerrenaceae科，Polyporales目，與國內已報道多種林木腐朽真菌均為Polyporales目，表明該目物種在降解木材及農林廢棄物木質素方面具有獨特性，且該種為新整合種類[50]，為未來的深入研究提供了特殊材料。利用白腐真菌降解木質素研究結果揭示白腐菌在木材預處理階段具有節(jié)約資源、減少污染物的排放、提高產能的優(yōu)勢[51-53]。王偉[54]從23株白腐真菌中篩選出3個高效降解黑楊木質素的物種，F(xiàn)unalia trogii，Trametes orientalis，Truncospora ochroleuca，并提出了3株白腐真菌降解黑楊的初步降解機制。本研究采用巨龍竹為研究對象，研究表明竹材失重率比木材失重率較低，分析其主要原因為竹材與木材木質素不同，竹材屬于典型的禾草類木質素[28]。盡管真菌降解木質素已研究多年，但研究成果從實驗室走到大田、生產車間還處在瓶頸期，從成果產出到實際轉化、產生效益還有待繼續(xù)開展深入研究和探索，盡管困難重重，始終堅信通過創(chuàng)新的、嚴謹?shù)?、科學的試驗研究必定能開發(fā)出適合工業(yè)生產的高活性白腐菌株和培養(yǎng)體系，解決木質纖維素材料高效利用的瓶頸問題[27,29]。我國竹林面積居世界第一[55]，竹資源及其豐富，其孕育了竹資源加工利用及產業(yè)化高效快速發(fā)展的格局，但選擇性去除竹材中的木質素極大地限制了竹資源深度利用，已成為竹生物制漿、竹纖維素制備、竹材綜合開發(fā)與利用的卡脖子問題，因此如何高效且有選擇性的去除竹材中木質素是一項集基礎科學研究與產業(yè)應用轉化于一體亟待解決的問題[28,56]。本研究盡管已篩選出高效降解巨龍竹白腐菌株，但是將其從實驗室研究轉移至產業(yè)應用轉化還需要篩選出適應性較強的菌株。

隨著化石資源枯竭，生物質資源利用研究日益突顯。對于巨龍竹這種在制漿造紙、人造板材和生物煉制等工業(yè)領域表現(xiàn)出極高的研究開發(fā)價值的可再生資源開發(fā)利用刻不容緩[57]，竹木質素的去除還是一個未攻克的難題，由于工業(yè)制備纖維素材料時主要靠傳統(tǒng)的高溫高壓、強堿法等方法去除木質素，這樣不僅浪費大量的資源和能源也污染環(huán)境。本研究篩選出了能夠選擇性高效降解巨龍竹木質素白腐菌株并對其進行了鑒定，同時對其初步降解機制進行了揭示，為后續(xù)的研究提供一定的理論支持。在后續(xù)的研究中可選定木腐菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件；運用2個或以上菌株同時或先后培養(yǎng)來進行預處理，補足木腐菌在不同降解階段的不同酶系，優(yōu)化共生條件使其脫木質程度更高[54]。