氣相色譜法測定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度評定

金雅慧，俞華芬，李羅飛，秦 麗*

（1.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢驗檢測站，杭州 311100；2.寧波工程學院，奉化研究院，浙江寧波 315500）

黃精（Polygonatirhizoma）是百合科黃精屬植物滇黃精、黃精、多花黃精的干燥植物根莖[1]。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，黃精的化學成分主要有多糖類、甾體皂苷、三萜皂苷類、黃酮類和蒽醌類、木脂素類、植物甾醇類、氨基酸以及金屬元素類等，其中黃精多糖為主要藥效成分[2-4]?！吨腥A人民共和國藥典》（2020年版）在通則0212《藥材和飲片檢定通則》中增訂了針對控制農(nóng)藥殘留污染的內容，要求藥材和飲片（植物類）中不得檢出33種禁用農(nóng)藥[5]。甲胺磷（Methamidophos），化學式為C2H8NO2PS，屬于廣譜緩釋有機磷類殺蟲劑，具有良好的內吸、胃毒和觸殺作用，廣泛用于各種農(nóng)作物病蟲害防治[6]，是通則0212中規(guī)定的不得檢出的禁用農(nóng)藥之一。

測量不確定度是一種對測量/檢測結果可疑程度的定量表述方法，能反映檢測人員、測量儀器設備和檢測實驗室環(huán)境條件等的測量能力、水平。我國GB/T 27025—2019《檢測和校準實驗室能力的通用要求》[7]和RB/T 214—2017《檢驗檢測機構資質認定能力評價檢驗檢測機構通用要求》[8]中規(guī)定：檢測和校準實驗室都必須進行測量不確定度的評定，且應在具體的檢測和校準工作中應用這些程序來進行測量不確定度的評定，并能運用測量不確定度評定的結果來判定檢測結果是否符合規(guī)定要求以及對檢測數(shù)據(jù)或測量過程實施監(jiān)控。目前，已有相關文獻[9-12]采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》[13]測定蔬菜、水果中有機磷農(nóng)藥殘留量的不確定度，如采用氣相色譜測定鮮枸杞中農(nóng)藥氧樂果殘留的不確定度評定[14]；采用氣相色譜-串聯(lián)質譜測定三七中農(nóng)藥腐霉利含量的不確定度評定[15]等，而采用《中國藥典》（2020年版）通則2341《農(nóng)藥殘留測定法》[16]測定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度評定未見報道。本文按照《中國藥典》通則2341《農(nóng)藥殘留測定法》中《第二法有機磷農(nóng)藥殘留量測定法（色譜法）》[16]，并參照JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[17]及JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[18]，對黃精中甲胺磷殘留檢測過程中各不確定度分量進行來源分析和計算評定，以期為提升檢測結果的準確性和可靠性提供有效依據(jù)，同時為使用氣相色譜測定黃精中其他有機磷農(nóng)藥殘留量的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸乙酯、無水硫酸鈉、正己烷，以上均為分析純，無錫市晶科化工有限公司；濾膜（0.22μm），北京萊博潤科生物科技有限公司；石墨化炭黑固相萃取SPE小柱（250 mg/3 mL），廣州太瑋生物科技有限公司；甲胺磷標準品1 000μg/mL（純度99.9%），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

1.2 儀器與設備

K-600型商用食品加工器，德國博朗公司；PL 202-L型電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；S10200-A型超聲波清洗器，天津奧特塞恩斯公司；AR-200型旋轉蒸發(fā)儀，瑞士布奇公司；MS-3漩渦混合器，德國艾卡公司；N-EVAP 12位氮吹儀，美國Organomation公司；Agilent 7890A型氣相色譜儀（FPD檢測器），美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

準確移取0.5 mL甲胺磷標準品1 000μg/mL，用乙酸乙酯定容于50 mL玻璃容量瓶中，得到甲胺磷標準儲備液10.0 mg/L。準確移取0.5 mL上述甲胺磷標準儲備液，用乙酸乙酯定容于50 mL玻璃容量瓶中，得到0.1 mg/L甲胺磷標準溶液，再分別移取0.5、1.0、2.0、5.0 mL上述甲胺磷標準儲備液，用乙酸乙酯定容于10 mL玻璃容量瓶中，得到0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L甲胺磷標準溶液。甲胺磷標準曲線系列質量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5（30 mm×0.32 mm×0.25μm）；載氣：N2（純度99.99%）；進樣口溫度：220℃；進樣模式：不分流進樣；進樣體積：1.0μL；恒流模式：流速3.53 mL/min；檢測器溫度：250℃；尾吹60 mL/min，燃氣75 mL/min，助燃氣100 mL/min；程序升溫：60℃（保持2 min），5℃/min升溫至250℃（保持2 min）。

1.3.3 樣品前處理

采用《中國藥典》（2020年版）通則2341中第二法的前處理方法[16]，稱取粉末黃精試樣5 g，加入無水硫酸鈉5 g、乙酸乙酯50 mL，于冰浴中超聲3 min，靜置15 min后收集上層濾液，加入乙酸乙酯30 mL至固體部分，于冰浴中超聲2 min，靜置15 min后收集上層濾液；合并上述上層濾液，使用少量乙酸乙酯沖洗濾紙及固體部分，并入上述濾液。將濾液于40℃以下濃縮近干，轉移至5 mL玻璃試管中，使用乙酸乙酯稀釋至5 mL；吸取上述溶液1 mL，上樣至石墨化炭黑固相萃取SPE小柱（乙酸乙酯5 mL預淋）；使用正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合液5 mL進行洗脫；收集洗脫液，氮吹濃縮近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，渦旋混勻后，過0.22μm有機濾膜至進樣瓶，供氣相色譜儀測定。

1.3.4 數(shù)學模型的建立

構建的數(shù)學模型為乘除形式，可用相對不確定度評定，無需計算靈敏度系數(shù)。樣品中被測農(nóng)藥甲胺磷的殘留量按式（1）計算。

式中：x為黃精中甲胺磷的殘留量，mg/kg；Va為提取溶劑（乙酸乙酯）的總體積，mL；Vb為用于檢測的提取溶液的體積，mL；Vc為樣品溶液處理后定容的體積，mL；cref為標準溶液中甲胺磷質量濃度，μg/mL；A、As分別為樣品溶液和標準溶液中甲胺磷峰面積的平均值，mAU·s；m為樣品的質量，g；R為樣品加標回收率，%；fr為樣品均勻性校正因子，取值為1。

黃精中甲胺磷殘留量相對標準不確定度的合成按式（2）計算。

式中：urel（rep）為檢測過程總重復性產(chǎn)生的相對不確定度，是由氣相色譜儀峰面積A、As、稱量、移取溶液、定容等操作的重復性分量合并而成的一個總檢測過程中的分量，利用X重復測量數(shù)據(jù)計算的標準偏差；urel（crep）為甲胺磷標準溶液配制過程中產(chǎn)生的相對不確定度；urel（sv）為甲胺磷標準曲線擬合產(chǎn)生的相對不確定度；urel（m）為黃精樣品稱量產(chǎn)生的相對不確定度；urel（Va）、urel（Vb）、urel（Vc）分別為樣品提取液、用于檢測的提取液、樣品溶液處理后定容產(chǎn)生的相對不確定度；urel（R）為方法回收率產(chǎn)生的相對不確定度；urel（fr）為黃精樣品的均勻性校正因子fr產(chǎn)生的相對不確定度；urel（A）為氣相色譜峰面積測量值產(chǎn)生的相對不確定度。

2 結果與分析

2.1 測量不確定度來源分析

從數(shù)學模型、前處理過程、檢測原理等方面分析，用氣相色譜法測定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度來源，如圖1所示。

圖1 不確定度來源

2.2 不確定度分量評定

2.2.1 檢測過程總重復性產(chǎn)生的相對不確定度urel（rep）

分別稱取10份黃精樣品，按1.3試驗方法進行測定殘留量x，按貝塞爾公式，即式（3）計算x的相對標準偏差s（x），重復測定檢測結果見表1。

表1 重復測定檢測結果（n=10）

實際測量時，一般將對樣品測定2次作為測量結果，則檢測過程總重復性產(chǎn)生的相對不確定度urel（rep）按式（4）計算。

2.2.2 甲胺磷標準溶液配制過程中產(chǎn)生的相對不確定度urel（crep）

2.2.2.1 甲胺磷標準品濃度cs產(chǎn)生的相對不確定度urel（cs）

使用有證標準品，甲胺磷質量濃度標準值為1 000μg/mL，標準品證書記錄甲胺磷不確定度為3%，即±30μg/mL（k=2），甲胺磷標準品產(chǎn)生的相對標準不確定度為

2.2.2.2 甲胺磷標準溶液稀釋配制過程中由玻璃量器、液體體積膨脹產(chǎn)生的相對不確定度urel（Vi）（i=1～5）

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[19]規(guī)定：1、2、5 mL玻璃分度移液管（A級）的最大允許誤差（MPE）分別為±0.008、±0.012、±0.025 mL，按照均勻分布處理玻璃單標線容量瓶的MPE值分別為±0.020、±0.050 mL，按照三角分布處理查詢本實驗室當日環(huán)境控制記錄，實驗室環(huán)境溫度在（20±5）℃，與常用玻璃量器的檢定校準溫度（20℃）[19]不同，溫度變化產(chǎn)生的不確定度可通過估算溫度變化范圍，體積膨脹系數(shù)來計算。因常用有機溶劑的體積膨脹系數(shù)遠高于常用玻璃量器的體積膨脹系數(shù)，故只須考慮常用有機溶劑的體積膨脹。乙酸乙酯體積膨脹系數(shù)為1.38×10-3/℃，按照均勻分布處理

使用分度移液管、單標線容量瓶等稀釋配制甲胺磷標準溶液過程中，有2個主要不確定度來源：最大允許誤差和溫度影響，且這2個分量互不相關，其合成標準不確定度可以采用方和根方法合成，其相對標準不確定度可采用合成標準不確定度除以所量取體積進行估算。結果如下：

2.2.2.3 甲胺磷標準溶液配制過程中產(chǎn)生的相對不確定度urel（crep）

在甲胺磷標準溶液配制過程中，使用1 mL分度移液管（A級）吸取0.5 mL（V1-0.5）液體2次，吸取1 mL（V1-1）液體1次；使用A級2、5 mL分度移液管吸取2 mL（V2）液體1次、5 mL（V3）液體1次；使用10 mL（V4）、50 mL（V5）單標線容量瓶次數(shù)分別為4、1次，合成甲胺磷標準溶液配制過程中產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（crep）按式（5）計算。

2.2.3 甲胺磷標準曲線擬合產(chǎn)生的相對不確定度urel（sv）

對質量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的甲胺磷標準溶液進行測定，以甲胺磷質量濃度c為橫坐標，氣相色譜測得的峰面積y為縱坐標，采用最小二乘法進行線性擬合，得到擬合直線方程y=ac＋b為y=5 037.1c＋57.954（R2=0.999 9）（表2）。

表2 標準曲線校正引入的相對不確定度

標準溶液峰面積的余差標準偏差Sy按式（6）計算。

標準曲線擬合引入的相對不確定度urel（sv）按式（7）計算。

式中：c0為被測樣品質量濃度的平均值，取值為0.213 mg/L；cˉ為甲胺磷標準溶液中各質量濃度的平均值，取值為1.72 mg/L；ci為甲胺磷標準溶液中的一系列質量濃度值，mg/L；a為擬合直線方程中的斜率，取值為5 037.1；b為直線截距，取值為57.954；n為作擬合直線方程時甲胺磷標準溶液的測定次數(shù)（每個濃度測定2次），取值為10；p為黃精樣品測定次數(shù)，取值為2。

2.2.4 樣品稱量產(chǎn)生的相對不確定度urel（m）

用電子天平稱量黃精樣品，電子天平檢定合格。經(jīng)查詢該天平MPE值為±0.05 g，按均勻分布處理，稱量采用去皮法，則樣品稱量產(chǎn)生的相對不確定度urel（m）按式（8）計算。

2.2.5 樣品提取液、用于檢測的提取液、樣品溶液處理后定容產(chǎn)生的相對不確定度urel（Va）、urel（Vb）、urel（Vc）

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃器檢定規(guī)程》[19]規(guī)定：5 mL刻度試管、1 mL分度移液管（A級）的MPE值分別為±0.100、±0.008 mL，按照均勻分布處理，實驗室溫度在（20±5）℃，乙酸乙酯體積膨脹系數(shù)為1.38×10-3/℃，按照均勻分布處理

使用分度移液管吸取樣品提取液、用于檢測的提取液、樣品溶液處理后定容等過程中，有2個主要不確定度來源：最大允許誤差和溫度影響，且這2個分量互不相關，其合成標準不確定度可以采用方和根方法合成，其相對標準不確定度可采用合成標準不確定度除以所量取體積進行估算。結果如下：

式中：因樣品溶液處理后是在5 mL刻度試管中定容至1 mL，故MPE取值為0.100，并以此計算urel（Vc）。

2.2.6 方法回收率產(chǎn)生的相對不確定度urel（R）

使用5份陰性樣品做加標試驗，甲胺磷添加濃度為0.010 mg/kg，得回收率（R）分別為102.2%、101.4%、99.0%、100.6%、99.8%，平均回收率（R）為100.6%。

采用A類不確定定評定中的極差法進行評定回收率產(chǎn)生的相對不確定度urel（R）。查詢JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[18]中極差系數(shù)及自由度表可知，當測量次數(shù)n=5時，極差系數(shù)C=2.33，按式（9）計算urel（R）。

通過t檢驗，判斷回收率（R）是否與100%存在顯著差異。查詢t值表，在置信率P=95%，t0.95（4）=2.780，按式（10）計算檢驗值t。

由此說明，回收率（R）不必在測量模型中采用修正測定結果，但其對不確定度的貢獻需考慮。

2.2.7 樣品的均勻性校正因子（fr）產(chǎn)生的相對不確定度urel（fr）

根據(jù)本文所采用的檢測方法，平行配制3份黃精樣品，在氣相色譜儀上進行測定，得到測定數(shù)據(jù)x′為0.506、0.510、0.503 mg/kg，xˉ′為0.506 mg/kg。

采用A類不確定度評定中的極差法進行評定。查詢JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[18]中極差系數(shù)及自由度表可知，當測量次數(shù)n=3時，極差系數(shù)C=1.69。

因樣品測定以2次測量平均值為其測量結果，則樣品的均勻性校正因子產(chǎn)生的相對不確定度urel（fr）按式（11）計算。

2.2.8 氣相色譜峰面積測量值產(chǎn)生的相對不確定度urel（A）

2.2.8.1 氣相色譜進樣體積產(chǎn)生的相對不確定度urel（Ve）

由1.3.2氣相色譜條件可知，氣相色譜進樣體積為1.0μL，查詢氣相色譜儀進樣微量注射器說明書，其定量重復性為1.0%，即其重復性相對標準不確定度為

2.2.8.2 氣相色譜FPD檢測器產(chǎn)生的相對不確定度urel（A）1

查詢氣相色譜檢定證書可知，定量重復性為1.3%，按照矩形分布處理采用B類不確定度評定，則氣相色譜FPD檢測器產(chǎn)生的相對標準不確定度為

2.2.8.3 氣相色譜峰面積響應值產(chǎn)生的相對不確定度urel（A）2

儀器對在相同色譜條件下所測樣品和甲胺磷標準溶液的影響是一致的，因此氣相色譜峰面積響應值產(chǎn)生的相對不確定度urel（A）2可忽略不計，氣相色譜峰面積的重復性已在檢測過程總重復性中納入考慮。

2.2.8.4 氣相色譜峰面積測量值產(chǎn)生的相對不確定度urel（A）

峰面積測量值產(chǎn)生的相對不確定度urel（A）按式（12）計算。

2.3 合成標準不確定度

上述各項相對標準不確定度分量統(tǒng)計結果見表3，通過各項相對標準不確定度合成得到黃精樣品中甲胺磷殘留量的合成相對標準不確定度為：

表3 相對標準不確定度分量統(tǒng)計結果

黃精樣品中甲胺磷殘留量在實際2次測量的平均值x為0.213 mg/kg，則合成標準不確定度按式（13）計算。

2.4 擴展不確定度U（X）和測量結果表示

根據(jù)JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[17]，在95%置信概率下，包含因子k=2，則擴展不確定度按式（14）計算。

當測得黃精中甲胺磷殘留量為0.213 mg/kg時，其測量結果表示為0.213±0.017 mg/kg，k=2。

3 結 論

本研究采用氣相色譜法測定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度，并對整個定量檢測過程中可能產(chǎn)生的各種不確定度分量進行來源分析、計算評定。由分析結果可知，甲胺磷標準曲線擬合、甲胺磷標準溶液配制的不確定度分量相對貢獻較大，黃精樣品稱量、前處理過程中各所涉液體體積、方法的回收率、樣品的均勻性校正因子等不確定度分量貢獻相對較小。因此，在進行農(nóng)藥殘留定量檢測過程中，可通過判斷選擇合適的玻璃量具，并定期做好各玻璃量具的檢定和校準工作。同時，應控制好檢測實驗室的環(huán)境條件，以及通過質量監(jiān)督、能力驗證、人員比對等質量管理措施，不斷提高實驗操作人員的操作能力水平，以期達到降低檢測結果測量不確定度的目的，確保檢測結果的準確、可靠。