酒精性肝病患者血漿外泌體差異蛋白的分析

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，初期通常表現(xiàn)為單純性脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展成酒精性肝炎(alcoholic steatohepatitis，ASH)、肝纖維化和肝硬化，嚴(yán)重酗酒時(shí)可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死，甚至肝功能衰竭。ALD是全球范圍內(nèi)慢性肝病的主要原因之一，占肝硬化相關(guān)死亡的48%

，酒精也是其他類型肝病患者的常見輔助因素，如丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染會(huì)加速肝纖維化

；大多數(shù)ALD患者在出現(xiàn)黃疸或肝硬化并發(fā)癥后才就診

，因此，早期識(shí)別ALD顯得尤為重要，并隨后進(jìn)行行為干預(yù)，但與病毒性肝炎的最新進(jìn)展相比，在ALD患者的治療方面藥理學(xué)進(jìn)展很少，迄今為止，最有效的縮短ALD臨床病程甚至逆轉(zhuǎn)肝損傷的療法仍是長期戒酒

，因此，新穎的非侵入性檢測方法來早期診斷ALD并開發(fā)可行的ASH藥物成為了治療ALD的新希望；近10年來，關(guān)于外泌體的病理生物學(xué)得到了顯著的發(fā)展

，在描述外泌體的組裝和釋放機(jī)制及它隨后與靶細(xì)胞的膜融合方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展

，此外，強(qiáng)大的分析技術(shù)已經(jīng)證實(shí)外泌體表面存在無數(shù)分子，包括生長因子、代謝酶、microRNA和轉(zhuǎn)錄因子、某些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物及其他調(diào)節(jié)細(xì)胞間和器官間的通信

，另外，泌體生物學(xué)研究新進(jìn)展表明，其調(diào)節(jié)關(guān)鍵的生物學(xué)功能，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，可能作為新的生物學(xué)標(biāo)志物，此外，在治療方面，外泌體也有可能作為一種獨(dú)特的給藥工具

。查閱肝臟學(xué)領(lǐng)域新進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)外泌體已經(jīng)作為疾病發(fā)生發(fā)展的參與者引起了人們的關(guān)注

，包括世界上最常見的肝病：ALD

，在ALD進(jìn)展中調(diào)節(jié)損傷、擴(kuò)大炎癥和促進(jìn)肝纖維化

，這些生物學(xué)功能明確了其潛在的診斷和治療肝臟疾病的影響。本研究利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag，TMT)標(biāo)記聯(lián)合高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法(liquid chromatography-tandemmass spectrometry，LC-MS/MS)對(duì)ALD患者和健康者血漿中外泌體蛋白進(jìn)行鑒定及定量分析，篩選出差異蛋白，通過生物信息學(xué)分析差異蛋白的功能及生物學(xué)過程，為尋找ALD的治療靶點(diǎn)和無創(chuàng)診斷標(biāo)志物提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

選取2021年5月至2021年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院住院確診的ALD患者與健康體檢者各3例，年齡16～65歲，性別不限，納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2018年發(fā)布的《酒精性肝病防治指南》

：(1)有長期飲酒史，一般超過5年，折合乙醇量男性≥40 g/d，女性≥20 g/d；或2周內(nèi)有大量飲酒史，折合乙醇量>80 g/d；(2)臨床癥狀為非特異性，可無癥狀，或有右上腹脹痛、食欲不振、乏力、體質(zhì)量減輕、黃疸等，隨著病情加重，可有神經(jīng)精神癥狀、蜘蛛痣、肝掌等表現(xiàn)；(3)血清AST、ALT、GGT、TBil、PT等指標(biāo)升高，其中AST/ALT>2、GGT升高為ALD的特點(diǎn)，禁酒后這些指標(biāo)可明顯下降，通常4周內(nèi)基本恢復(fù)正常(但GGT恢復(fù)較慢)，有助于診斷；(4)肝臟B型超聲、CT、MRI或瞬時(shí)彈性成像檢查有典型表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嗜肝病毒現(xiàn)癥感染、藥物和中毒性肝損傷、自身免疫性肝病等；收集入組者靜脈血10 ml置于血漿收集管中(含EDTA)，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上層血漿于-80 ℃保存；該研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：京佑科倫字[2021]001號(hào))且患者及家屬簽署知情同意書。

試劑：碳酸氫銨(Sigma-Aldrich)、尿素(Amresco)、蛋白定量染液(Huaxingbio)、二硫蘇糖醇DTT(Amresco)、碘代乙酰胺IAM(Amresco)、胰蛋白酶(Promega)、乙腈(J.T.Baker)、甲酸(Sigma-Aldrich)、XBridge Peptide BEH 5 μm C18色譜柱(waters)、TMT6plex

Isobaric Label Reagent Set(Thermofisher，貨號(hào)90111)；儀器：超速離心機(jī)(Beckman，Optima

XPN-100)、高效液相色譜系統(tǒng)(8600RIGOL L-3000)、超聲破碎儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)、離心機(jī)(Eppendorf)、酶標(biāo)儀(DR200B)，電泳系統(tǒng)(bio-rad)。

今后外保溫防火研究的重點(diǎn)應(yīng)是通過對(duì)大量外保溫火災(zāi)案例的精準(zhǔn)分析，與現(xiàn)有技術(shù)規(guī)定進(jìn)行逐一比對(duì)，以論證現(xiàn)有防火規(guī)定的科學(xué)性并發(fā)現(xiàn)其不足之處，逐漸修正、完善外保溫防火技術(shù)要求，不斷提高外保溫防火的技術(shù)安全水平。

血漿標(biāo)本從-80 ℃取出，于離心機(jī)上4 ℃ 2 000×

10 min去除死細(xì)胞，吸取上清至新的EP管中，繼續(xù)4 ℃ 10 000×

30 min去除細(xì)胞碎片及大分子雜質(zhì)，將上清移至超速離心管中，4 ℃ 110 000×

超速離心70 min提純外泌體，PBS 200 μl重懸后，加入適量尿素(8 mol/L)及蛋白酶抑制劑混勻，超聲裂解，4 ℃ 14 000×

離心20 min后取上清進(jìn)行蛋白定量，并行SDS-PAGE電泳質(zhì)控。

TMT的質(zhì)譜分析是由Orbitrap Fusion型質(zhì)譜完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用PowerDesigner 2.4處理，檢索homo_sapiens_uniprot_2020_08_13.fasta數(shù)據(jù)庫，并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析，最后以倍數(shù)上調(diào)>1.2倍或下調(diào)>1.2倍且

<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白質(zhì)。

取上述提取的蛋白100 μg，加入二硫蘇糖醇(10 mmol/L)，30 ℃ 1 h后加入碘代乙酰胺(40 mmol/L)，室溫45 min，隨后用碳酸氫銨(25 mmol/L)將樣本稀釋4倍，以胰酶∶蛋白=1∶50的比例加入胰酶，37 ℃過夜，加入50 μl 0.1%的甲酸終止酶解，將酶解后的肽段用C18柱除鹽后進(jìn)行真空冷凍干燥，取干凈EP管，每管加入TMT試劑0.8 mg和無水乙醇41 μl震蕩5 min，加入酶切好的樣本100 μg，室溫孵育1 h，將標(biāo)記好的樣本真空冷凍干燥進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用Persuse軟件平臺(tái)

(http://www.perseus-framework.org蛋白組學(xué)分析軟件平臺(tái))進(jìn)行蛋白組學(xué)前期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以

(

,

)表示，兩組間比較符合正態(tài)分布采用

檢驗(yàn)，

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了獲得較為準(zhǔn)確的車輛行駛速度，本試驗(yàn)采用了波形曲線分析與現(xiàn)場實(shí)時(shí)錄像測試相結(jié)合的方法?？缰袚隙茸畲笾等∽?0 Hz低頻濾波后曲線。由于試驗(yàn)數(shù)據(jù)較多且各試驗(yàn)梁規(guī)律相同，此處只給出FCB梁、PCB梁跨中最大動(dòng)撓度與速度的關(guān)系，見圖9。

2.3.2 差異蛋白KEGG通路分析結(jié)果：將篩選出的差異蛋白進(jìn)行KEGG通路的富集分析(見圖3)，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要集中于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性免疫缺陷、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、FcγR-介導(dǎo)的吞噬作用等信號(hào)通路。

本報(bào)告采用Orbitrap Fusion型質(zhì)譜采集LC-MS/MS數(shù)據(jù)，配制流動(dòng)相A液(100%水、0.1%甲酸)和B液(100%乙腈、0.1%甲酸)，使用A液10 μl溶解上述凍干粉末，4 ℃ 14 000×

離心 20 min，取上清1 μg樣品進(jìn)樣，液質(zhì)檢測，液相色譜洗脫條件如表1所示，使用Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀，Nanospray Flex

(NSI)離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為2.2 kV，離子傳輸管溫度為350 ℃，質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，質(zhì)譜全掃描范圍為350～1 550 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為120 000(200 m/z)，C-trap最大容量為4×10

，C-trap最大注入時(shí)間為50 ms，選取全掃描中離子強(qiáng)度TOP20的母離子使用高能碰撞裂解(high energy collision dissociation,HCD)方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測，二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為60 000(200 m/z)，C-trap最大容量為1×10

，C-trap最大注入時(shí)間為118 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為28%，閾強(qiáng)度設(shè)為5×10

，動(dòng)態(tài)排阻范圍設(shè)為15 s，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

經(jīng)篩選后最終納入ALD患者和健康體檢者各3例，兩組在性別、年齡、WBC、RBC及PLT計(jì)數(shù)方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

均>0.05)，但ALT、AST、GGT、TBil、PT、MCV等指標(biāo)在ALD患者中明顯升高(

<0.05)(見表2)。

本研究共鑒定到3 419個(gè)肽段，387種蛋白，通過蛋白質(zhì)定量分析，共篩選出27種差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)的蛋白15種、下調(diào)的蛋白12種(見圖1)，表3～4分別列出了上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白的基因名稱。

2.3.1 差異蛋白GO功能富集分析結(jié)果：對(duì)篩選出的差異蛋白進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白的功能主要集中在蛋白質(zhì)的代謝、膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體的激活、Fc受體信號(hào)通路、自噬的調(diào)節(jié)、受體結(jié)合的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、溶酶體、細(xì)胞膜、質(zhì)膜、神經(jīng)元胞體、受體復(fù)合物等細(xì)胞組分；鋅離子結(jié)合、信號(hào)受體活性調(diào)節(jié)、脂蛋白顆粒受體結(jié)合調(diào)節(jié)、聚合免疫球蛋白受體活性調(diào)節(jié)、載脂蛋白受體活性調(diào)節(jié)等分子功能(見圖2)。

做人要做“正常人”?！罢闭?，“中”也。“正常人”立身處世不偏不倚，待人接物不亢不卑，言語舉止不左不右。處處拿捏分寸，時(shí)時(shí)注意適度。

通過Uniprot的注釋信息對(duì)差異蛋白進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋，通過Fisher精確檢驗(yàn)，對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能GO富集分析，利用R-3.5.1軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行層次聚類分析。

盡管迄今為止在肝臟疾病的研究方面取得了很大的進(jìn)展，但肝臟病理學(xué)的診斷仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，由于成像等方法并不完全可靠，因此，侵入性肝活檢仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是ALD不管在診斷還是治療上均需要新的突破，因此，開發(fā)新穎、可靠且無創(chuàng)的診斷方法和治療方法已成為人們的主要研究方向，并且隨著技術(shù)的發(fā)展，生物樣品的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析成為非常有吸引力的領(lǐng)域，因?yàn)樘囟ǖ鞍踪|(zhì)表達(dá)水平的改變可以反映生理或病理狀態(tài)，并且可以洞察蛋白質(zhì)功能，基于質(zhì)譜的技術(shù)具有較高的靈敏度、質(zhì)量準(zhǔn)確度和分辨率性能，當(dāng)與液相色譜分離技術(shù)相結(jié)合時(shí)，可以識(shí)別復(fù)雜生物樣品中的數(shù)千種蛋白質(zhì)，包括我們非常感興趣的外泌體蛋白，介于LC-MS/MS是進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異分析的最有前途的方法之一，本次實(shí)驗(yàn)我們利用TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出ALD患者血漿外泌體匯總差異蛋白27種，其中上調(diào)蛋白15種，下調(diào)蛋白12種。

2.3.3 差異蛋白互作分析結(jié)果：將所得差異蛋白進(jìn)一步進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有11個(gè)差異蛋白被互作網(wǎng)絡(luò)覆蓋(見圖4)，說明具有較好的生物學(xué)聯(lián)系，其余集中游離于互作網(wǎng)絡(luò)之外，可能功能較為獨(dú)立或與其他差異蛋白功能較疏遠(yuǎn)導(dǎo)致。

3 討論

選取最優(yōu)的CNN模型與傳統(tǒng)模型評(píng)測結(jié)果繪制P-R曲線和ROC曲線，其中圖8為各模型P-R曲線對(duì)比圖，圖9為各模型ROC曲線對(duì)比圖。

脂肪細(xì)胞膜相關(guān)蛋白(adipocyte plasma membrane associated protein，APMAP)是一種46 kDa的糖基化Ⅱ型跨膜蛋白，我們知道賴氨酰氧化酶和賴氨酰氧化酶樣蛋白1～4(LOX和LOXL1～4)介導(dǎo)膠原和/或彈性蛋白的交聯(lián)，因此與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑有關(guān)

，在肥胖的脂肪組織中，LOX表達(dá)以缺氧依賴的方式上調(diào)，并與組織纖維化有關(guān)

，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，在分子水平上，APMAP與細(xì)胞外膠原交聯(lián)基質(zhì)蛋白LOXL-1和LOXL-3相互作用，在高脂飲食動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，APMAP敲除小鼠中LOXL-1和LOXL-3的表達(dá)大大降低，附睪白色脂肪組織中原纖維化膠原蛋白的表達(dá)減少和總膠原蛋白含量降低，表明纖維化潛力降低，表明APMAP是細(xì)胞外基質(zhì)成分的新型調(diào)節(jié)劑

。因此，在ALD患者中發(fā)現(xiàn)APMAP的上調(diào)預(yù)示著患者肝纖維化的形成，可以為尋找ALD的早期診斷方法提供方向。

載脂蛋白A4(apolipoprotein A4，ApoA4)是一種脂質(zhì)結(jié)合蛋白，相關(guān)研究顯示，肝脂肪變性會(huì)刺激肝ApoA4的表達(dá)，進(jìn)而通過促進(jìn)脂蛋白顆粒的膨脹來減輕肝臟的脂質(zhì)負(fù)擔(dān)

，過多的肝脂質(zhì)會(huì)使肝細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)和纖維化的激活

敏感，此外，增加的ApoA4還可以充當(dāng)急性期蛋白，在炎癥過程中所需的宿主防御中發(fā)揮作用

，在這方面，ApoA4的表達(dá)升高應(yīng)與脂質(zhì)的代謝異常以及肝功能不全引起的炎癥過程有關(guān)，相關(guān)研究表明，ApoA4與TGF-β1結(jié)合可提高α-SMA、COL1A1和c-Myc的水平

，而活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)可以增加膠原蛋白的產(chǎn)生

，從這些方面來看，我們認(rèn)為ApoA4可能由于刺激HSC而增強(qiáng)了TGF-β1引起的肝纖維化，因此，血漿ApoA4水平的測定似乎在肝纖維化的早期和快速診斷中起著關(guān)鍵作用。

壩體填筑分兩期施工，一期施工左岸灘地，二期施工右岸河床。一、二期瀝青心墻接頭設(shè)計(jì)采用擴(kuò)大接頭型式，縱向1∶3斜坡。實(shí)際施工過程中高程4 046 m以上一期瀝青心墻未能預(yù)留擴(kuò)大接頭，擴(kuò)大接頭無法實(shí)現(xiàn)。

另外，我們知道先天性免疫系統(tǒng)是ALD發(fā)病機(jī)理的重要參與者，先天性免疫反應(yīng)的多個(gè)組件，包括肝的巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子/趨化因子的網(wǎng)絡(luò)，由于受酒精的影響，出現(xiàn)先天免疫環(huán)境的失調(diào)

，酒精對(duì)先天性免疫系統(tǒng)的持久激活進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死性肝細(xì)胞過度死亡，并進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)肝組織損傷，反復(fù)的細(xì)胞損傷和對(duì)先天性免疫反應(yīng)的進(jìn)一步刺激導(dǎo)致ASH患者無法恢復(fù)的炎癥

；最近的研究也表明，補(bǔ)體是乙醇誘導(dǎo)肝損傷的重要病理生理學(xué)因素，補(bǔ)體是先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，在微生物防御和凋亡細(xì)胞清除中起至關(guān)重要的作用，但補(bǔ)體的異常不受控制的激活會(huì)導(dǎo)致廣泛的組織損傷

，補(bǔ)體由3種途徑激活，經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑，補(bǔ)體C4調(diào)節(jié)經(jīng)典和凝集素途徑，補(bǔ)體因子D(complement factor D，CFD)調(diào)節(jié)替代途徑，我們發(fā)現(xiàn)CFD和C4在慢性乙醇誘發(fā)的傷害中的作用相反，F(xiàn)D

小鼠具有更大的乙醇誘導(dǎo)的損傷，而經(jīng)典和凝集素途徑均缺乏的C4

小鼠受到乙醇誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)，F(xiàn)D

小鼠的另一個(gè)特征是脂肪變性增加

，其機(jī)制尚不清楚，補(bǔ)體與脂肪組織和肝臟的免疫系統(tǒng)及新陳代謝之間的相互作用

有關(guān)，兩者均是酒精的重要靶標(biāo)

，F(xiàn)D也稱為脂肪酶，主要由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，是具有直接和間接免疫代謝特性的脂肪因子

，實(shí)際上，F(xiàn)D足以誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞中PPARγ(一種參與脂質(zhì)同化的轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)

，脂肪-肝軸的調(diào)節(jié)是FD可以保護(hù)免受乙醇誘導(dǎo)的脂肪變性的一種潛在機(jī)制；另外免疫球蛋白也可激活和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，效應(yīng)細(xì)胞的激活導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放或基于細(xì)胞的反應(yīng)(如吞噬作用和內(nèi)吞作用)的激活，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，也可能參與到ASH的炎癥反應(yīng)中，因其所處生理階段的不同而出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，因此，補(bǔ)體、免疫球蛋白也可能成為ALD診斷和治療的突破點(diǎn)。

電商服務(wù)平臺(tái)直接面對(duì)種植大戶做C端，勢頭迅猛。這些新型農(nóng)業(yè)服務(wù)平臺(tái)定位終端，瞄準(zhǔn)終端種植大戶需求，精準(zhǔn)定位平臺(tái)發(fā)展的方向。特別是作為互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)平臺(tái)，通過線上農(nóng)技推廣服務(wù)，聚集了近百萬的線上流量和幾十萬的忠實(shí)粉絲，并借助點(diǎn)擊量、流量釋放活力。他們組織一些種植專家在線講解作物管理方法，結(jié)合當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境特點(diǎn)以及對(duì)作物生長、肥水需求、病蟲害發(fā)生等規(guī)律，給農(nóng)民朋友總結(jié)出科學(xué)的管理套餐，為農(nóng)民答疑解惑。更為接地氣的是，給農(nóng)民梳理出一整套便于記憶、便于掌握、簡單易懂的操作方法?！胺桨盖袑?shí)可行、成本易于接受，能幫助種植戶控制好病蟲害，生產(chǎn)出更高品質(zhì)的作物，達(dá)到增產(chǎn)增收的目的。”他們這樣定位服務(wù)方式。

綜上所述，本研究通過對(duì)ALD患者血漿中的外泌體進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，并根據(jù)結(jié)果對(duì)得出的差異蛋白進(jìn)行分析，根據(jù)其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)他們與肝臟的脂肪變、炎癥反應(yīng)及肝纖維化有明顯的關(guān)系，為尋找ALD早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物提供了參考依據(jù)，并可進(jìn)一步在探討疾病發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上尋找ALD的治療靶點(diǎn)，為未來ALD患者的治療提供了希望。

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