Exo-miRNA在慢性心力衰竭患者中的表達(dá)及其臨床意義

蔡新勇 邵靚 劉員員 葉文兵 王桂根 王洪 賴(lài)珩莉 洪浪

摘要：目的 探討外泌體微小RNA（Exo-miRNA）在慢性心力衰竭（CHF）中的表達(dá);方法 選取CHF患者95例（CHF組）和健康自愿者90例（對(duì)照組），采集外周血液，提取外泌體中miRNA，采用PCR法測(cè)定Exo-miRNA表達(dá)情況。結(jié)果 相較于對(duì)照組，CHF組Exo-miR-126、LVEF降低，Exo-miR-210、LVESD、LVEDD增高，P<0.001;隨著NYHA分級(jí)增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐漸減小，P<0.05;血清Exo-miR126與LVEF呈正相關(guān)，與LVESD、 LVEDD、Exo-miR210呈負(fù)相關(guān)，P<0.05;而血清Exo-miR210與LVEF呈負(fù)相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈正相關(guān)，P<0.05;血清Exo-miR-126、Exo-miR-210聯(lián)合檢測(cè)診斷CHF的敏感度、特異度為80.25%、91.34%;結(jié)論 CHF患者血清Exo-miR-126表達(dá)下調(diào)，而Exo-miR-210表達(dá)增強(qiáng)，二者表達(dá)水平與CHF的心功能密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：外泌體;慢性心力衰竭;心功能;miR-126;miR-210

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R541.6 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）05--03

Abstract：Objective To investigate the expression of exosomal microRNA （Exo-miRNA） in chronic heart failure （CHF）;Methods 95 CHF patients （CHF group） and 90 healthy volunteers （control group） were selected， peripheral blood was collected， miRNA in exosomes was extracted， and the expression of Exo-miRNA was determined by PCR method.Results Compared with the control group， the CHF group had decreased Exo-miR-126 and LVEF， and increased Exo-miR-210， LVESD and LVEDD， P<0.001; with the increase of NYHA grade， serum Exo-miRNA-126 and LVEF gradually decreased ， P<0.05; serum Exo-miR126 was positively correlated with LVEF， and negatively correlated with LVESD， LVEDD， Exo-miR210， P<0.05; while serum Exo-miR210 was negatively correlated with LVEF， and positively correlated with LVESD， LVEDD， P <0.05; the sensitivity and specificity of combined detection of serum Exo-miR-126 and Exo-miR-210 in the diagnosis of CHF were 80.25% and 91.34%;Conclusion The expression of Exo-miR-126 in serum of CHF patients is down-regulated， while the expression of Exo-miR-210 is enhanced， and the expression levels of the two are closely related to the cardiac function of CHF.

Key words： exosomes; chronic heart failure; cardiac function; miR-126; miR-210

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，目前全球范圍內(nèi)CHF的死亡率居高不下，再住院率逐年增加，其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后引起了學(xué)者的高度關(guān)注，成為臨床研究熱點(diǎn)。近年來(lái)學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控在CHF的發(fā)病機(jī)制發(fā)揮著重要作用，并有研究指出[1]，外泌體微小RNA（Exo-miRNA）參與了心肌纖維化、心肌細(xì)凋亡、心肌重塑等多個(gè)CHF基本病理過(guò)程，其中外泌體miR-126和miR-210的作用尤為突出，二者具有促進(jìn)血管新生和介導(dǎo)心臟祖細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激的抵抗力增強(qiáng)的作用[2，3]，并對(duì)心血管事件風(fēng)險(xiǎn)具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值[4]。但目前外周血外泌體miR-126、miR-210與CHF的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討CHF患者外周血外泌體中miR-126、miR-210表達(dá)情況，并分析其與CHF發(fā)病的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年3月～2021年12月本院心內(nèi)科收治的慢性心力衰竭（CHF）患者95例（CHF組），其中男52例，女43例，年齡46～75（61.20±8.75）歲，病程6個(gè)月～5年，平均（3.85±1.04）年，美國(guó)紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）分級(jí)Ⅰ級(jí)25例，Ⅱ級(jí)27例，Ⅲ級(jí)22例，Ⅳ級(jí)21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2018》[5]中CHF診斷標(biāo)準(zhǔn);NYHA心功能分級(jí)為I～I(xiàn)V級(jí);同意參與本項(xiàng)研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎功能?chē)?yán)重?fù)p害;合并先天性心臟病、心肌梗死、心臟瓣膜病變等心臟疾病;有惡性腫瘤、自身免疫性疾病及心臟手術(shù)史者;有精神異常及依從性差者。同期選取本院健康體檢自愿者（心電圖檢查正常，且無(wú)心血管疾病）90例為對(duì)照組，其中男49例，女性41例，年齡45～78（59.73±8.41）歲。CHF組與對(duì)照組受試者的性別（x2=0.002，P=0.968）、年齡（t=1.171，P=0.243）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

（1）外周血Exo-miRNA表達(dá)水平測(cè)定：①樣本采集與預(yù)處理：使用EDTA-K2 抗凝管采集CHF患者入院時(shí)及對(duì)照組人群晨起空腹靜脈血5mL，離心處理（離心半徑10cm，離心速度：3000r/min，時(shí)間：5min），分離血漿，-70℃保存待測(cè)。②血漿外泌體分離與裂解：取樣本解凍后，取500uL加入Exo Quick試劑（美國(guó) SBI公司）120uL，振蕩充分混勻，4℃下放置3h;再10000r/min離心3min，移液槍吸取上清液棄去，下層即為外泌體顆粒;然后滴加350uL裂解緩沖液，渦流震蕩30s，4℃靜置10min，使其完全溶解。③外泌體RNA提取與純化：向上述外泌體液加入200ul無(wú)水乙醇，混勻，按miRcute miR親和柱（日本TIANGENS公司）試劑說(shuō)明書(shū)提取、純化外泌體總RNA，并應(yīng)有Nanodrop檢測(cè)總RNA質(zhì)

量與濃度;③ Exo-miRNA檢測(cè)：將上述純化的Exo-miRNA+20uL無(wú)菌雙蒸水溶解+12?LmiRNA反轉(zhuǎn)錄試劑（日本Takara公司），按反轉(zhuǎn)錄程序（45℃ 1h，95℃ 5min）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并設(shè)計(jì)引物（金斯瑞公司合成，具體序列見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃20 s，退火60℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束使用熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-RAD公司）測(cè)定miRNA相對(duì)表達(dá)量，以2-△△ct表示。

（2）心臟超聲檢測(cè)：使用HI VISION Ascendus勒超聲儀（日立公司）對(duì)受試對(duì)象行超聲心動(dòng)圖檢查，探頭頻率為2. 5 MHz，測(cè)定左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑 （ LVESD）、 左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD） 等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 20.00 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料（x±s）以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)，使用Pearson法分析Exo-miRNA表達(dá)與心功能參數(shù)的相關(guān)性，并繪制ROC曲線分析Exo-miRNA對(duì)CHF發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清Exo-miRNA表達(dá)及心功能參數(shù)比較 見(jiàn)表2，CHF組Exo-miR-126、LVEF低于對(duì)照組，而Exo-miR-210、LVESD、LVEDD明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001。

2.2 不同NYHA分級(jí)CHF患者血清Exo-miRNA表達(dá)及心功能參數(shù)比較 見(jiàn)表3，不同NYHA分級(jí)CHF患者血清Exo-miRNA-126、Exo-miRNA-210水平及心功能參數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05;且隨著NYHA分級(jí)增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐漸減小，而LVESD、 LVEDD逐漸增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

2.3 CHF患者血清Exo-miRNA表達(dá)與心功能參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表4，血清Exo-miR126與LVEF呈顯著正相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈負(fù)相關(guān)，P<0.05;血清Exo-miR210與LVEF呈負(fù)相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈正相關(guān)，P<0.05;血清Exo-miR126與Exo-miR210呈負(fù)相關(guān)，P<0.05。

2.4 血清Exo-miRNA表達(dá)對(duì)CHF發(fā)生的診斷效能 血清Exo-miR-126、Exo-miR-210預(yù)測(cè)CHF發(fā)生的ROC曲線結(jié)果，血清Exo-miR-126最佳截?cái)嘀等?5.34時(shí)診斷CHF的AUC為0.905（95%CI：0.826～0.913，P<0.001），Exo-miR-210最佳截?cái)嘀等?7.12時(shí)診斷CHF的AUC為0.848（95%CI：0.712～0.853，P<0.05），二者聯(lián)合檢測(cè)診斷CHF的AUC為0.953（95%CI：0.759～0.916，P<0.001），敏感度和特異度依次為80.25%、91.34%，見(jiàn)表5。

3 討論

CHF可導(dǎo)致心排出量下降、心室充血，繼而導(dǎo)致組織血供不足和循環(huán)淤血，對(duì)心臟造成不可逆損害[6]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)[7]，我國(guó)CHF患病率為1.3%，患病人數(shù)約1370萬(wàn)人，5年內(nèi)死亡率達(dá)50%。早期發(fā)現(xiàn)并評(píng)估病情嚴(yán)重程度對(duì)改善CHF患者預(yù)后具有重要意義。外泌體是細(xì)胞間信息交流的工具，也是miRNA的重要載體，由于外泌體內(nèi)miRNA因被雙層膜狀結(jié)構(gòu)包裹，相較于血清miRNA，其具有更好的穩(wěn)定性、更高的靈敏度和特異性[8-9];這也使得外泌體miRNA成為CHF早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。

心肌細(xì)胞間進(jìn)行信息交流期間，細(xì)胞會(huì)富集特異性miRNA，并包裝進(jìn)外泌體，然后釋放至細(xì)胞間隙，參與心臟的心臟病理生理學(xué)變化[10]。miR-126在調(diào)控血管新生和血管內(nèi)皮損傷修復(fù)方面均發(fā)揮重要作用，與心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，CHF患者外周血中miR-126表達(dá)較健康人群顯著下調(diào)，但將miR-126轉(zhuǎn)染入CHF患者體內(nèi)后，其心臟功能能迅速改善。而miR-210是缺氧調(diào)控的重要基因，其在缺氧生理狀態(tài)下明顯升高[13];并有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-210在心肌細(xì)胞凋亡與增殖、心肌細(xì)胞再生及缺血心肌組織血管新生等方面的調(diào)控中均發(fā)揮著重要的作用[14-15]?？梢?jiàn)，miR-126、miR-210在心臟疾病發(fā)病中的重要作用，本研究通過(guò)測(cè)定血清外泌體miRNA發(fā)現(xiàn)，CHF組Exo-miR-126、LVEF低于對(duì)照組，而Exo-miR-210、LVESD、LVEDD明顯高于對(duì)照組，表明CHF患者血清外泌體miR-126、miR-210表達(dá)異常，與類(lèi)似研究報(bào)道結(jié)果相符[16-17]，由此推測(cè)miR-126、miR-210參與了CHF的發(fā)生。CHF發(fā)病后心臟負(fù)荷增加、心肌缺血缺氧損傷，繼而導(dǎo)致心室重構(gòu)，LVESD、LVEDD 增大，LVEF減小，心功能逐漸變差[18]，同時(shí)缺氧環(huán)境會(huì)刺激miR-210增加，而內(nèi)皮細(xì)胞分泌miR-126則受到抑制，由此導(dǎo)致了CHF外泌體miR-210、miR-126表達(dá)異常。此外，本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同NYHA分級(jí)CHF患者血清Exo-miRNA-126、Exo-miRNA-210水平及心功能參數(shù)存在顯著差異，且隨著NYHA分級(jí)增加，血清Exo-miRNA-126、LVEF逐漸減小，而LVESD、 LVEDD逐漸增大;相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Exo-miR126與LVEF呈顯著正相關(guān)，而與LVESD、 LVEDD呈負(fù)相關(guān);而血清Exo-miR210與心功能參數(shù)的關(guān)系與Exo-miR126正好相反，Exo-miR126與Exo-miR210呈顯著負(fù)相關(guān)，這提示外泌體miR126、miR210參與調(diào)控了CHF的疾病進(jìn)展，可作為CHF病情判斷的參考指標(biāo)，與研究報(bào)道結(jié)果相符[19-20]。

另外，本研究結(jié)果顯示，Exo-miR-126、Exo-miR-210診斷CHF發(fā)生的特異度和靈敏度依次為73.10%和 88.51%、70.92%和89.24%，二者聯(lián)合檢測(cè)的特異度和靈敏度可提升至80.25%、91.34%，提示Exo-miR-126、Exo-miR-210在CHF的臨床診斷中具有較高的特異度和敏感性，二者聯(lián)合檢測(cè)可提升CHF的診斷效能，為CHF的早期臨床治療提供參考。

綜上所述，CHF患者血清Exo-miR-126表達(dá)下調(diào)，而Exo-miR-210表達(dá)增強(qiáng)，二者表達(dá)水平與CHF的心功能密切相關(guān)，可作為CHF臨床早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。

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第一作者：蔡新勇，男、碩士;副主任醫(yī)師、江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西省南昌市豐和北大道266號(hào)，cxyandcxy@163.com，研究方向：冠心病、缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化

通訊作者：邵靚，男、博士;副主任醫(yī)師、江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西省南昌市豐和北大道266號(hào)，E-mail： shaoliang021224@hotmail.com 研究方向：心衰、心肌病、腫瘤心臟病學(xué)

基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃課題項(xiàng)目合同號(hào)202130031