HPLC法測(cè)定桑葉1-脫氧野尻霉素（DNJ）含量的方法學(xué)研究＊

鐘 石，吳偉杰，霍進(jìn)喜，陳慧芝，孫雨晴，牛 犇，馬煥艷，潘美良，李有貴＊

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021； 2. 浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310020）

浙江是我國(guó)傳統(tǒng)的栽桑養(yǎng)蠶地區(qū)，擁有桑園面積達(dá)80000 hm2。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，蠶農(nóng)養(yǎng)蠶效益明顯下滑，浙江養(yǎng)蠶面積逐年銳減，大量桑園廢棄，造成資源浪費(fèi)。而桑葉是一種藥食兩用的植物資源[1]，含有多種活性物質(zhì)[2]，如生物堿、黃酮、多糖、甾醇等，具有降血糖[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]和抗腫瘤[6]等多種功效。其中桑葉降血糖早在《本草綱目》等古代醫(yī)書中就有記載“能止消渴”，而現(xiàn)代研究表明桑葉中的1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是其起到降血糖作用的主要活性成分之一，它是一種天然α-糖苷酶抑制劑[7，8]，是唯一國(guó)際公認(rèn)的零傷害生物制劑[9]，具有降糖脂[10～14]、抗腫瘤[15]、抗病毒[16]、抗炎[17]等多種藥理活性，受到全世界的廣泛關(guān)注。

本研究在參考已有方法的基礎(chǔ)之上[8]，采用單因素考察試驗(yàn)，逐一優(yōu)化了桑葉DNJ 的提取測(cè)定方法，并考察該提取測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性、回收率、中間精密度等參數(shù)，最后利用該方法測(cè)定不同品種桑葉中DNJ 的含量，從而可為桑葉DNJ 含量測(cè)定提供方法依據(jù)，為后續(xù)從不同品種桑葉中篩選高含量的桑葉材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試桑葉品種

桑葉DNJ提取方法優(yōu)化研究中所用桑樹品種為“農(nóng)桑14號(hào)”，供測(cè)試的24個(gè)品種（表1）桑葉樣品于2022年5月采摘自浙江省農(nóng)科院桑園試驗(yàn)區(qū)，40 ℃烘干粉碎后備用。

表1 供試桑品種Table 1 List of mulberry leaves species

1.1.2 儀器與耗材

WATERS600 液相色譜儀，SunFireTMC18 色譜柱，2414 檢測(cè)器，烘箱，ML-204 分析天平（MET?TLER-TOLEDO，上海），HH-6 恒溫水浴鍋（晶玻實(shí)驗(yàn)儀器公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），DNJ標(biāo)準(zhǔn)品（sigma），F(xiàn)MOC-CL（sig?ma），乙腈（Tedia），硼酸鉀，甘氨酸，醋酸，乙醇，甲醇等均為AR。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取25 mg DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，加適量純水溶解，定容于25 mL 容量瓶中，配成1 mg/mL 的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)液。

精密吸取12.5、25、50、100、200 μL 的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)液入試管中，分別用0.05 mol/L HCl液補(bǔ)足至1 mL，混勻，得到12.5、25、50、100、200 μg/mL 的DNJ 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取10 μL試液，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在30 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析。

HPLC 分析條件為：分離柱SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相0.05%醋酸與乙腈的體積比為65∶35，柱溫為室溫，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，采用2414檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，測(cè)定峰面積。

1.2.2 桑葉DNJ提取方法優(yōu)化

1.2.2.1 粉碎粒度考察

取本品分別過50 目篩、65 目篩的粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入50 mL 0. 05 mol/L HCl溶液為提取劑，超聲波（40 KHz）提取60 min，10000 rpm 離心10 min，保留上清液，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟，重復(fù)三次。

1.2.2.2 提取液考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入50 mL 純水、50%乙醇、50%甲醇溶液為提取劑，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟。

1.2.2.3 提取液pH值

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入50 mL pH=1.0、pH=2.0、pH=4.0、pH=6.0、pH=8.0、pH=10.0 緩沖液為提取液，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟。

1.2.2.4 提取液體積

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入25、50、100、150、200 mL提取溶液為提取劑，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟。

1.2.2.5 超聲提取時(shí)間考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超聲波提取20、40、60、80、100 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟。

1.2.2.6 衍生化溫度

精密量取供試品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在25、30、40、50、60 ℃的條件下反應(yīng)30 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應(yīng)，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟。

1.2.2.7 衍生化時(shí)間

精密量取供試品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應(yīng)0、10、20、30、40、50、60 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應(yīng)，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟。

1.2.2.8 精密度考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，加入200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液。

精密量取同一供試品溶液10 μL 6份，置1.5 mL離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應(yīng)10 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進(jìn)高效液相，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中DNJ的含量，計(jì)算，即得。

含量RSD不大于3%，說明精密度良好。

1.2.2.9 重復(fù)性考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，加入200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液。各平行操作6份。

精密量取同一供試品溶液10 μL置1.5 mL離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應(yīng)10 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進(jìn)高效液相，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中DNJ的含量，計(jì)算，即得。

含量RSD不大于3%，說明重復(fù)性良好。

1.2.2.10 回收率考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，加入一定量的DNJ（相當(dāng)0.1 g樣品含量的80%、100%、120%，各平行操作3份），用200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液超聲波提取60 min，10000 rpm 離心10 min，保留上清液。

精密量取供試品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應(yīng)10 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液終止反應(yīng)。反應(yīng)液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進(jìn)高效液相，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中DNJ的含量，計(jì)算，即得。

各回收率在92%～105%之間，RSD 不大于3%，說明準(zhǔn)確度良好。

1.2.2.11 中間精密度試驗(yàn)

由不同實(shí)驗(yàn)人員于不同時(shí)間取本品粉末約0.2 g，按重復(fù)性考察試驗(yàn)，平行操作6 份，于不同儀器上測(cè)定，12份樣品含量RSD不大于3%，說明中間精密度良好。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 粉碎粒度對(duì)DNJ含量測(cè)定的影響

從圖1 中可以看出，經(jīng)過50 目篩、65 目篩后的樣品，測(cè)得的桑葉DNJ含量分別為0.17%、0.08%，因此選擇桑葉DNJ含量較高的50目篩作為粉碎粒度。

圖1 粉碎粒度對(duì)桑葉DNJ含量測(cè)定的影響Fig. 1 Effect of Grinding Size on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.2 提取溶劑考察

從圖2 中可以看出，不同的提取溶劑對(duì)桑葉DNJ含量影響較大，利用H2O、50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑，桑葉DNJ 含量分別為0.15%、0.04%、0.08%，因此選擇DNJ 含量較高的超純水作為提取液溶劑。

圖2 提取溶劑對(duì)桑葉DNJ含量測(cè)定的影響Fig. 2 Effect of Extraction Solvent on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.3 提取液pH考察

不同提取液pH 對(duì)桑葉DNJ 含量影響如圖3 所示。從結(jié)果中可以明顯看出當(dāng)提取液pH=2 時(shí)，桑葉DNJ 含量較高。因此選擇DNJ 含量較高的pH=2緩沖液作為提取液。

圖3 pH對(duì)桑葉DNJ含量測(cè)定的影響Fig. 3 Effect of pH on DNJ Content in Mulberry leaves

2.4 提取液體積考察

從圖4 中可以看出隨著提取液體積的增加，桑葉DNJ 含量隨之升高，但是提取液體積增加到一定程度后，DNJ含量趨于平穩(wěn)。因此，最終選擇的提取液體積為200 mL。

圖4 提取液體積對(duì)桑葉DNJ含量測(cè)定的影響Fig. 4 Effect of Extraction Volume on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.5 提取時(shí)間考察

從圖5中可以明顯看出隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)桑葉DNJ 含量影響不顯著，超聲20 min～100 min，DNJ 含量分別為0.21%、0.21%、0.22%、0.22%、0.23%?？紤]到提取效率，選擇用時(shí)短的為超聲時(shí)間，即超聲時(shí)間為20 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)桑葉DNJ含量測(cè)定的影響Fig. 5 Effect of Extraction Time on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.6 衍生化溫度考察

DNJ 是一種對(duì)溫度比較敏感的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)溫度達(dá)到一定程度后，DNJ 會(huì)發(fā)生降解。從圖6 可以看出隨著衍生化溫度的升高，桑葉DNJ 含量隨之下降，從0.20%降至0.08%。因此，在DNJ衍生時(shí)，選擇在25 ℃下進(jìn)行。

圖6 衍生化溫度對(duì)桑葉DNJ含量的影響Fig. 6 Effect of Derivative Temperature on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.7 衍生化時(shí)間考察

從圖7 中可以看出，當(dāng)衍生化時(shí)間在10 min～60 min 之間，桑葉DNJ 含量沒有明顯變化。因此選擇衍生化10 min作為反應(yīng)條件。

圖7 衍生化時(shí)間對(duì)桑葉DNJ含量測(cè)定的影響Fig. 7 Effect of Derivative Teme on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.8 精密度考察

對(duì)同一樣品進(jìn)行6 次測(cè)定，桑葉DNJ 的含量分別為0.26%、0.27%、0.27%、0.26%、0.27%、0.27%，RSD=1.81（n=6），結(jié)果表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.9 重復(fù)性考察

測(cè)定6 個(gè)桑葉樣本中DNJ 含量，結(jié)果分別為0.25%、0.26%、0.25%、0.24%、0.25%、0.25%，RSD=2.20（n=6），結(jié)果表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率考察

表1 顯示，本方法的加標(biāo)回收率在95.89%～103.65%之間，RSD 為2.76%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 DNJ加樣回收率（n=9）Table 1 Recovery Rate of DNJ (n=9)

2.11 中間精密度試驗(yàn)

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的12 份樣品含量RSD 為2.83%，結(jié)果表明中間精密度良好（表2）。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Intermediate Precision Test

2.12 不同品種桑葉DNJ含量測(cè)定

在確定了本研究?jī)?yōu)化的方法具有良好的精密度、重復(fù)性、回收率等之后，本研究測(cè)定了桑樹資源圃中24 種桑葉DNJ 含量（采摘時(shí)間2022 年5 月27日）。結(jié)果（見表3）顯示，24份樣品DNJ含量在0.08%～0.57%之間，不同品種桑葉DNJ含量差異較大。

表3 不同桑葉品種DNJ含量的測(cè)定Table 3 DNJ Content in Mulberry Leaves of Different Species

3 結(jié)論

本文開展了桑葉DNJ 含量測(cè)定的方法學(xué)研究。依次考察了桑葉樣品的粉碎粒度、提取溶劑、提取時(shí)間、衍生化溫度、衍生化時(shí)間等提取條件對(duì)DNJ 含量的影響，最后確定桑葉樣品的最優(yōu)提取測(cè)定方法為：桑葉粉碎過50目篩，0.2 g樣品加200 mL pH=2.0 緩沖液，超聲提取20 min，10000 rpm 離心10 min，保留上清液；精密吸取樣品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合，加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應(yīng)10 min，加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應(yīng)。同時(shí)，對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，完成了精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和中間精密度等試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法專屬性好，方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。測(cè)定20多個(gè)品種桑葉中DNJ含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種差異較大，可為后續(xù)桑葉DNJ的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。