小反芻獸疫免疫抗體檢測(cè)與分析

趙金彩，張秀衛(wèi)

（河北省趙縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 051530）

小反芻獸疫也稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要感染小反芻動(dòng)物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為主要特征，潛伏期多數(shù)為4～5d，最長(zhǎng)21d，多數(shù)羊發(fā)病10d 內(nèi)死亡，急性暴發(fā)時(shí)發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%，溫和發(fā)病時(shí)發(fā)病率也很高，但死亡率一般不超過50%，自然發(fā)病僅見于山羊和綿羊。山羊發(fā)病嚴(yán)重，綿羊也偶有嚴(yán)重病例發(fā)生，幼齡動(dòng)物發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，發(fā)病率和死亡都很高，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。目前，該病尚無有效的治療方法，主要預(yù)防措施是做好小反芻獸疫疫苗的免疫接種工作，國(guó)家要求所有羊只強(qiáng)制免疫小反芻獸疫疫苗。

為切實(shí)了解小反芻獸疫疫苗的免疫效果，科學(xué)評(píng)價(jià)小反芻獸疫抗體持續(xù)時(shí)間，我疫控中心在三個(gè)羊場(chǎng)采集免疫羊血清，用小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的方法檢測(cè)小反芻獸疫抗體，對(duì)免疫結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為今后我縣羊小反芻獸疫的研究防治提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)羊場(chǎng)

隨機(jī)選擇三個(gè)羊場(chǎng)做實(shí)驗(yàn)，分別用A、B、C 場(chǎng)表示，3 個(gè)羊場(chǎng)均采用自繁自養(yǎng)、封閉圈舍的飼養(yǎng)模式。A 場(chǎng)存欄150 只、B 場(chǎng)存欄120 只，C 場(chǎng)存欄300 頭。

1.2 疫苗接種情況

三個(gè)羊場(chǎng)均在2020 年10 月份免疫一次小反芻獸疫、山羊痘二聯(lián)活疫苗，每瓶50 頭份，批號(hào)2020004-1，成都華派生物工程集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。按照疫苗說明書，羊場(chǎng)獸醫(yī)用25mL 滅菌生理鹽水稀釋疫苗，對(duì)羊場(chǎng)1 月齡以上的羊均進(jìn)行了尾根內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射0.5mL（1 頭份），接種后羊只未出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

1.3 檢測(cè)方法

用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法檢測(cè)免疫羊血清小反芻獸疫抗體，

檢測(cè)試劑盒為蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)。

2 樣品前處理

隨機(jī)采集三個(gè)羊場(chǎng)免疫羊的全血，采集A 場(chǎng)血樣10份，B 場(chǎng)10 份、C 場(chǎng)18 份，共38 份血樣，用高速離心機(jī)分離出血清，血清清亮無溶血，對(duì)血清樣品進(jìn)行編號(hào)，A 場(chǎng)樣品編號(hào)1-10 號(hào)，B 場(chǎng)樣品編號(hào)11-20 號(hào)，C 場(chǎng)樣品編號(hào)21-38 號(hào)。

3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及試劑

3.1 儀器設(shè)備

100mL 量筒、250mL 燒杯，96 孔離心管架、1.5mL 離心管、蒸餾水、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微型振蕩器、酶標(biāo)分析儀、10-100uL 和100～1000uL 單道移液器、30～300uL 的8 道移液器、不同型號(hào)的槍頭、玻璃棒、貯液槽、吸水紙等。

3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑為蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)的小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)20210609118-2，用于檢測(cè)羊血清中的小反芻獸疫抗體，2℃～8℃保存。

3.3 試劑盒組成

3.3.1 已包被小反芻獸疫抗原酶標(biāo)板 2 塊（96 孔/塊）

3.3.2 25 倍PBST 濃縮液1 瓶（60mL/瓶 ）

3.3.3 小反芻獸疫陰性對(duì)照血清1 管（500uL/管）

3.3.4 小反芻獸疫陽性對(duì)照血清1 管（500uL/管）

3.3.5 單克隆抗體工作液1 瓶 （12mL/瓶）

3.3.6 兔抗鼠酶標(biāo)工作液1 瓶（12mL/瓶）

3.3.7 底物溶液（TMB）1 瓶（12mL/瓶）

3.3.8 終止液 1 瓶 （12mL/瓶）

3.3.9 封板膜2 張

3.3.10 說明書1 份

4 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

所用試劑提前2h 從冰箱取出恢復(fù)至室溫，放置1h 以上，使用前充分搖勻，實(shí)驗(yàn)完畢后放回2℃～8℃保存。

5 操作步驟及方法

5.1 溶液配制

將25 倍濃縮液用蒸餾水做1∶25 倍稀釋，配制成1 倍PBST 溶液，根據(jù)酶標(biāo)板加樣孔數(shù)和洗板次數(shù)，計(jì)算出1 倍PBST 溶液用量約130mL，用100mL 量筒準(zhǔn)確量取132mL 蒸餾水加到250mL 燒杯中，用100～1000uL 移液器吸取5.5mL 25 倍濃縮液加入到盛有132mL 蒸餾水的燒杯中，用玻璃棒輕輕攪拌溶液使其均勻備用。

5.2 加樣

5.2.1 取出已包被酶標(biāo)板，根據(jù)加樣數(shù)量，計(jì)算使用6 列酶標(biāo)板即可，剩下6 列拆下放2℃～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2.2 對(duì)照：酶標(biāo)板上依次設(shè)陰性對(duì)照血清2 孔、陽性對(duì)照血清2 孔，每孔加入相應(yīng)血清50uL；空白對(duì)照孔2 孔，每孔加100uL 1 倍PBST；單克隆抗體工作液對(duì)照4 孔，每孔加50uL 1倍PBST。

5.2.3 待檢樣品：在待檢樣品孔，每孔加入待檢血清樣品50uL。加樣順序如下圖：

5.2.4 除空白對(duì)照孔外，其他各孔加單克隆抗體工作液50uL。

5.3 加樣完畢后將酶標(biāo)板置于平板振蕩器上輕柔振蕩混勻，用封板膜封板，置于37℃溫箱內(nèi)溫育60min。

5.4 取出酶標(biāo)板甩干，用1 倍PBST 洗滌4～5 次，在吸水紙上拍干。

5.5 每孔加入兔抗鼠酶標(biāo)工作液50uL。

5.6 加樣完畢后，將酶標(biāo)板置于平板振蕩器上輕柔振蕩混勻，用封板膜封板，置于37℃溫箱內(nèi)溫育60min。

5.7 取出酶標(biāo)板甩干，用1 倍PBST 洗滌4～5 次，在吸水紙上拍干。

5.8 每孔加入底物溶液50uL，置37℃避光靜置反應(yīng)15min。

5.9 每孔加入50uL 終止液。

5.10 用酶標(biāo)儀讀取酶標(biāo)板OD450nm值，OD450nm值如下圖：

6 判定標(biāo)準(zhǔn)

6.1 計(jì)算同一酶標(biāo)板上單抗對(duì)照孔，陰、陽性血清對(duì)照孔和每份待檢血清孔在450nm 波長(zhǎng)處的平均吸光值（OD450nm），根據(jù)以下公式計(jì)算陰、陽性血清及待檢血清樣品的抑制率（PI值）：

PI=[1－（樣品孔的OD450nm/單抗對(duì)照孔的OD450nm）]×100%。

當(dāng)陰性對(duì)照孔PI ＜40%，陽性對(duì)照孔PI ＞60%時(shí)，檢測(cè)結(jié)果成立，否則該次檢測(cè)結(jié)果無效。

6.2 進(jìn)行抗體效價(jià)評(píng)估時(shí)，待檢血清PI ≥45%，抗體陽性；PI ＜40%，抗體陰性；40%＜PI ＜45%，則判定可疑。

6.3 診斷或流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，待檢血清PI ≥50%，陽性；PI ＜50%，陰性。

7 檢測(cè)結(jié)果及分析

7.1 本實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照血清PI 為32.18%＜40%，陽性對(duì)照血清PI 為80.59%＞60%，本次試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果有效。

7.2 檢測(cè)結(jié)果：經(jīng)過計(jì)算，待檢血清PI 如下表：

樣品編號(hào)PI（%）樣品編號(hào)PI（%） 樣品編號(hào)PI（%） 樣品編號(hào)PI（%）173.501183.592156.433143.32 286.661280.082256.923281.86 389.641379.772364.433378.92 485.241465.052472.303440.78 576.171580.442563.363578.17 671.231674.972677.413680.39 790.171787.242755.673742.25 890.531881.412875.863857.45 983.461945.672960.79 1083.322040.033074.66

檢測(cè)結(jié)果顯示：樣品1-19 號(hào)、21-30 號(hào)、32、33、35、36、38 號(hào)PI ＞45%， 判為抗體陽性；20、31、34、37 號(hào)40%＜PI＜45%，判為可疑。樣品共38 份，抗體陽性34 份，抗體陽性率89.47%，超過了國(guó)家規(guī)定的大于70%的標(biāo)準(zhǔn)，免疫效果較好。

三個(gè)羊場(chǎng)檢測(cè)效果：A 場(chǎng)樣品10 份，陽性10 份，抗體陽性率100%；B 場(chǎng)樣品10 份，陽性9 份，抗體陽性率90%，C場(chǎng)樣品18 份，陽性15 份，抗體陽性率83.33%，三個(gè)場(chǎng)抗體陽性率均超過了國(guó)家規(guī)定的大于70%的標(biāo)準(zhǔn)，整體免疫效果比較好。

8 結(jié)論

通過檢測(cè)三個(gè)羊場(chǎng)免疫羊小反芻獸疫抗體，抗體合格率均超過國(guó)家規(guī)定的大于70%的標(biāo)準(zhǔn)，抗體持續(xù)時(shí)間達(dá)到12 個(gè)月以上，整體免疫效果比較理想，說明疫苗接種是預(yù)防小反芻獸疫的有效和重要手段。今后繼續(xù)推行國(guó)家要求的所有羊只強(qiáng)制免疫小反芻獸疫疫苗政策，做到所有羊場(chǎng)（包括散養(yǎng)戶）免疫全覆蓋。羊場(chǎng)建立健全防疫制度，消毒滅源，規(guī)范引種，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，采取綜合防控措施，控制小反芻獸疫的發(fā)生。加強(qiáng)動(dòng)物疫病檢測(cè)機(jī)構(gòu)建設(shè)，加大對(duì)羊場(chǎng)小反芻獸疫抗體檢測(cè)力度，增加抽樣檢測(cè)點(diǎn)，對(duì)免疫結(jié)果進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，進(jìn)而強(qiáng)化羊場(chǎng)措施落實(shí)，對(duì)抗體不足、免疫失敗的羊場(chǎng)進(jìn)行疫苗補(bǔ)免，為縣域羊小反芻獸疫的研究防治提供系統(tǒng)技術(shù)支持。