牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)及中藥抑菌試驗(yàn)

劉小冬

（北京市順義區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 100300）

牙齦卟啉單胞菌是擬桿菌屬的一種革蘭氏陰性球桿菌，嚴(yán)格厭氧環(huán)境下生存，并且有很強(qiáng)的致病性。在血瓊脂培養(yǎng)基上形成黑色凸起，光滑有光澤的菌落。對于臨床常見的一些藥物，克林霉素，四環(huán)素等對牙齦卟啉單胞菌有比較強(qiáng)的抑制作用，而青霉素等藥的作用很小。本次研究將著重于中藥對牙周病的主要致病菌之一的牙齦卟啉單胞菌的抑菌作用。臨床上有很多關(guān)于中藥能有效抑制Pg 的成果，其中單味中藥、中藥提取物和復(fù)方藥液都有一定作用，并且已經(jīng)有試驗(yàn)說明其在臨床方面的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示厚樸、茶多酚、菊花、桑葉、川芎嗪、金銀花、丁香、香薷、烏梅、荷葉、黃芩、丹皮、紫蘇葉、廣藿香、黃連、五倍子、白芍、五味子、佩蘭、龍膽苦甙、山姜、大黃、連翹、普通綠茶、龍井茶、紅茶、茉莉花茶、紫陽茶、烏龍茶、艾葉、側(cè)柏葉、蒲黃、三七、仙鶴草、桂皮醇、銀杏等含有小檗堿、黃芩素、大黃酸、厚撲酚等有效成分的中藥對牙齦卟啉單胞菌在一定濃度下都具有十分明顯的抑菌作用[2]。

1 牙齦卟啉單胞菌的培養(yǎng)

1.1 材料與方法

1.1.1 材料

涂布器，牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ACCT33277（由廣東省微生物保存中心提供），普通血瓊脂平板，巧克力平板，BHI 培養(yǎng)基粉，氯化血紅素，酵母提取物，5%無菌脫纖維羊血，2.5L厭氧培養(yǎng)袋（愛普銳晟試劑耗材公司提供），厭氧產(chǎn)氣袋，厭氧指示劑（日本三菱），維生素K1（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院提供）。

1.1.2 儀器

超凈臺，高壓蒸汽滅菌鍋，光學(xué)顯微鏡（DM500，Leica），37℃恒溫箱。

1.1.3 培養(yǎng)條件

37℃，厭氧環(huán)境（78%N2，21%CO2）。厭氧環(huán)境由厭氧產(chǎn)氣袋和厭氧密封袋組成，環(huán)境溫度由恒溫箱控制。因此，環(huán)境控制存在一定的波動變化，厭氧產(chǎn)氣袋需要一些時間去創(chuàng)造一個良好的厭氧環(huán)境，此期間會在一定程度上影響厭氧菌的生長繁殖。

1.1.4 菌種復(fù)蘇

凍干粉全部用完，用0.2mL 的無菌水溶解，接種在2 個血瓊脂平板上。因凍干菌種處于休眠狀態(tài)，故不接種多個平板，以免因接種量不足而導(dǎo)致復(fù)蘇不成功。

1.1.5 菌種初步鑒定

眼觀：瓊脂板上形成棕色或灰色菌落，后轉(zhuǎn)為黑色菌落，紫外照射有紅色熒光。顯微鏡鏡檢：革蘭陰性球桿菌，大小為（0.8～1.5μm）×（1.5～3.5μm），兩端圓，染色不均。

生化特性：吲哚試驗(yàn)陽性，脂酶試驗(yàn)陰性，不發(fā)酵葡萄糖等糖類，觸酶試驗(yàn)陰性，α巖藻糖苷酶，α半乳糖苷酶，β半乳糖苷酶試驗(yàn)陰性。

1.1.6 后續(xù)培養(yǎng)

洗脫：移液槍吸取1mL 的無菌蒸餾水，按壓移液槍將蒸餾水快速擠出到培養(yǎng)基平板表面，將培養(yǎng)基傾斜，吸取培養(yǎng)基表面的液體反復(fù)洗脫培養(yǎng)基表面菌落，反復(fù)洗脫操作10 次。將洗脫液用移液槍吸取后裝入無菌EP 管里靜置3～5min，除去肉眼可見的黑色沉淀（黑色小菌落），放入另外一個無菌EP 管里混勻備用。

取初代復(fù)蘇的細(xì)菌，在傳代 3 代之后用洗脫液50μL 分別涂布在普通血平板，巧克力平板，改良BHI 血平板上培養(yǎng)。（根據(jù)菌種說明，在傳代3 代后達(dá)到穩(wěn)定生長繁殖的狀態(tài)。）

改良BHI 血平板（100mL）：3.6gBHI 培養(yǎng)基粉末+0.5g 酵母粉+1.5g 瓊脂粉，加入100mL 水溶解后高壓滅菌20min，等待其溫度降到不燙手時加入5mL 5%無菌脫纖維羊血，500μL 氯化血紅素，100μL 維生素K1，混勻后倒平板。

1.2 培養(yǎng)結(jié)果

1.2.1 復(fù)蘇用了14d 長出成片的黑色團(tuán)塊，復(fù)蘇成功。

1.2.2 傳代3 次之后能平穩(wěn)生長繁殖后洗脫后接種血平板，早上接種，第6d 晚上血平板開始變色，第12d 晚上長出肉眼可見菌落。巧克力平板培養(yǎng)基顏色變化不明顯，但是長出菌落的時間提前了平均半天。改良后的BHI 血平板菌落長出最快，在第10d 晚上可長出小的肉眼可見菌落。

1.3 分析與討論

牙齦卟啉單胞菌的生長周期較同期試驗(yàn)的變形鏈球菌來說，形成菌落的時間很慢。由于沒辦法做到文獻(xiàn)中厭氧的氣體條件，對于牙齦卟啉單胞菌的生長會產(chǎn)生影響。培養(yǎng)基中加入氯化血紅素和維生素K1 后加快細(xì)菌的生長以及黑色素的產(chǎn)生這點(diǎn)符合文獻(xiàn)記載[3]。

2 中藥抑菌性的探究

2.1 材料與方法

2.1.1 材料

6 種中藥的中藥配方顆粒。黃芩（1∶10，三九醫(yī)藥），黃芪（1.5∶10，江陰天江藥業(yè)有限公司），連翹（1∶10，三九醫(yī)藥），金銀花（2∶10，三九藥業(yè)），五倍子（2.5∶5，三九醫(yī)藥），五味子（1.5∶6，三九醫(yī)藥）。

2.1.2 儀器

96 孔板，超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000C，Thermo Scientific），37℃恒溫箱，電磁爐和鍋，0.22μm 濾器（密理博）。

2.1.3 方法

2.1.3.1 中藥液的配制

（1）稱取中藥免煎顆粒

藥物名稱黃芩黃芪連翹金銀花 五倍子 五味子取樣重量（g）0.502.501.251.000.500.75

（2）配制中藥配方顆粒0.5g/mL 的10mL 中藥液。在5g 中藥配方顆粒加入5mL 加熱后的蒸餾水在恒溫80℃狀態(tài)下溶解，轉(zhuǎn)移到相應(yīng)編號的試管內(nèi)，再加入5mL 蒸餾水混勻。

（3）高壓蒸汽滅菌。

（4）用0.22μm 濾器過濾后備用（避免藥渣沉淀影響試驗(yàn)結(jié)果觀察）。

藥物名稱黃芩 黃芪連翹金銀花 五倍子 五味子過濾后收集到的藥液量（mL） 647.5899

2.1.3.2 中藥抑菌試驗(yàn)

（1）探究抑菌濃度：取100μL 中藥液和100μL 增菌到105-6 菌液加到96 孔板內(nèi)混勻，設(shè)置對照組（菌液+蒸餾水，中藥+培養(yǎng)液）。培養(yǎng)24h 觀察結(jié)果。由于變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌都是牙周疾病主要致病菌且適宜生長條件相似，但變形鏈球菌的生長周期更短，用于探索可以抑菌的濃度的預(yù)實(shí)驗(yàn)。

判定標(biāo)準(zhǔn):

MIC：最小抑菌濃度 (Minimum Inhibitory Concentration)，96孔板底部無菌落生長的最小稀釋孔對應(yīng)中藥濃度為MIC。

MBC：最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration），用96 孔板底部無菌落生長的混合液涂布平板，若一定時間培養(yǎng)之后未見細(xì)菌生長的，則為MBC。

（2）牙齦卟啉單胞菌中藥抑菌效果試驗(yàn)

將洗脫液100μL 均勻涂布在培養(yǎng)基表面培養(yǎng)10d，測量培養(yǎng)基表面的菌落數(shù)后計(jì)算需要稀釋原洗脫液的倍數(shù)。按照比例稀釋原洗脫液后分裝備用。

配置預(yù)試驗(yàn)MIC 濃度以及前后兩個梯度的中藥液，用濾器過濾后先取100μL 均勻涂布在培養(yǎng)基表面，在接入100μL 牙齦卟啉單胞菌洗脫液。培養(yǎng)10d 之后觀察抑菌效果?？瞻讓φ諡橹挥屑?xì)菌洗脫液涂布的平板。

2.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不用濾器過濾之前中藥沉淀嚴(yán)重，看不到細(xì)菌生長的情況。用分光光度計(jì)測量，沉淀對測量的影響大于細(xì)菌在混懸液中生長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不具有參考價值。

2.2.2 用了濾器之后，得到基本穩(wěn)定的數(shù)據(jù)（換算成中藥飲片的濃度）。

MIC：黃芩1.66g/mL，五倍子0.125g/mL，五味子0.125g/mL，金銀花1.25g/mL，連翹1.25g/mL，黃芪3.33g/mL。

MBC 黃芩未測得完全抑菌濃度，五倍子1g/mL，五味子1g/mL，金銀花2.5g/mL，連翹5g/mL，黃芪未測得完全抑菌濃度。

2.2.3 對牙齦卟啉單胞菌有抑菌作用的濃度是黃芩1.66g/mL，五倍子0.078g/mL，五味子0.078g/mL，金銀花0.78g/mL，連翹0.78g/mL，黃芪3.33g/mL。在不同藥液的不同濃度下表現(xiàn)的抑制作用各有不同。表現(xiàn)為測得的抑制濃度下有不同的抑制效果，其中抑制濃度下五倍子和五味子的平板上菌落密度最小，呈較好的抑制效果。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)濃度1g/mL 和0.5g/mL 作用下，五倍子和五味子的抑菌作用最明顯。表現(xiàn)為五味子＞五倍子＞金銀花＞連翹＞黃芩＞黃芪。

2.3 分析和討論

中藥配方顆粒的溶解會帶來很多沉淀，沒有用中藥飲片煎制過濾之后濃縮做出的結(jié)果具有說明意義[4]。對變形鏈球菌，五味子和五倍子對細(xì)菌的抑制作用明顯強(qiáng)于另外幾種中藥，黃芩和黃芪兩種中藥對其的抑制作用最低。在抑制變形鏈球菌的藥物濃度下，牙齦卟啉單胞菌呈很好的抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為平板上沒有長出肉眼可見的菌落或者很少的菌落。接下來幾天菌落大小的變化是由中藥抑菌作用和培養(yǎng)基營養(yǎng)等因素共同影響。菌落密度的變化在接下來的時間表現(xiàn)不明顯，說明在抑制濃度下中藥成分的抑菌性在一定時間內(nèi)能長時間發(fā)揮作用，抑制作用持續(xù)一段時間后會漸漸減弱。在實(shí)驗(yàn)室有了更多厭氧菌培養(yǎng)的裝置和經(jīng)驗(yàn)之后可以嘗試有機(jī)溶劑制作中藥液并提取有效成分。并且為了減少沉淀，試驗(yàn)中嘗試用了濾器進(jìn)行過濾，雖然很有效地減少了沉淀的產(chǎn)生，但是也過濾了一些有效物質(zhì)，對抑菌作用有很大影響。不過，還是依舊能測出來具有穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本次試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中所述一致，五倍子和五味子的抑菌效果比其他幾味中藥更好，不管是控制了中藥濃度情況下還是從抑菌濃度方面來說。此次試驗(yàn)說明了中藥確實(shí)對牙周疾病致病菌牙齦卟啉單胞菌有明顯抑制作用，可以為以后制造中藥抑菌制劑提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

如文獻(xiàn)所說，中藥的成分的多種多樣，這樣的好處是能更好的起到作用，壞處是對于研究的定量來說，各種物質(zhì)的不同作用能力讓中藥不能更精確的定量分析。這也是中藥研究的一大難點(diǎn)。近年來，中藥在腫瘤，抑菌等領(lǐng)域都有確實(shí)的數(shù)據(jù)說明中藥在治療方面確實(shí)起到了一定作用，但是對于其中的作用物質(zhì)和作用機(jī)制研究還不夠深入，并且試驗(yàn)方法單一，缺乏創(chuàng)新性。中藥研究的重點(diǎn)應(yīng)該向更精確方面發(fā)展。在臨床方面，根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，加上中藥能減少產(chǎn)生耐藥性的方面，中藥能很好抑制牙周致病菌的生長和菌膜的形成，可以考慮制作中藥配方制劑用于犬的牙周病防治。