T淋巴細(xì)胞在新生隱球菌感染中的防御作用

李肅靜 皇幼明 唐慧 崔虹 滕艷 陶小華 樊一斌，

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系研究生院，蚌埠 233000；2.浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院皮膚科，杭州 310014)

新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)是一種具有多糖莢膜的機(jī)會(huì)致病性酵母菌。全球每年超過100萬人感染，致死人數(shù)過65萬[1]。干燥的酵母細(xì)胞通過呼吸進(jìn)入肺部產(chǎn)生感染，免疫功能正常的宿主具有自限性，而免疫功能低下者(如艾滋病、免疫力低下的孕婦、X連鎖免疫缺陷、肝病、特發(fā)性CD4+T細(xì)胞缺乏等)則會(huì)增加感染新生隱球菌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。T細(xì)胞來源于骨髓并在胸腺中發(fā)育成熟[3]，可以在免疫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)因子的作用，不同的T細(xì)胞亞群參與了對(duì)新生隱球菌感染的免疫應(yīng)答。

固有免疫是宿主抵御新生隱球菌入侵機(jī)體的第一道防線，單核細(xì)胞被趨化到肺部并分化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[4]。新生隱球菌為逃逸巨噬細(xì)胞的吞噬機(jī)制，通過特洛伊木馬策略、細(xì)胞吞噬和細(xì)胞旁穿越在宿主中擴(kuò)散[5]。樹突狀細(xì)胞除吞噬和破壞入侵的隱球菌，還可以上調(diào)趨化因子受體及共刺激分子并提呈給初始T細(xì)胞，根據(jù)在樹突狀細(xì)胞上表達(dá)的共刺激分子的類型，其可以誘導(dǎo)不同的輔助T細(xì)胞。共分為三類：①輔助性T細(xì)胞1(Th1)，產(chǎn)生促炎反應(yīng)，殺死細(xì)胞內(nèi)病原體。②輔助性T細(xì)胞2(Th2)與促進(jìn)抗體分泌、嗜酸性粒細(xì)胞增多以及抗炎免疫反應(yīng)相關(guān)。③輔助性T細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞與自身免疫性疾病相關(guān)[6]。除了輔助性T細(xì)胞以外，CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞也在宿主的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。

1 CD4+T細(xì)胞(CD4+ T cell)

CD4+T細(xì)胞是宿主介導(dǎo)細(xì)胞免疫的重要組成部分，根據(jù)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子和效應(yīng)細(xì)胞的特征可以將其分為Th1、Th2和Th17亞群[7]。三種類型的細(xì)胞免疫應(yīng)答之間的平衡會(huì)對(duì)感染產(chǎn)生影響。有研究表明在小鼠中，CD4+T細(xì)胞促進(jìn)宿主的抗新生隱球菌作用以及相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。CD4+T細(xì)胞缺失的小鼠存活時(shí)間明顯縮短[8]。有研究表明隱球菌甘露糖蛋白(MP)的糖基化明顯提高其抗原性以及刺激保護(hù)性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生。CD4+T細(xì)胞缺乏是人類隱球菌感染的主要誘發(fā)因素，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)小于100個(gè)細(xì)胞/μL和可檢測(cè)到的血清隱球菌多糖莢膜抗原(CrAg)預(yù)示著HIV相關(guān)隱球菌病患病風(fēng)險(xiǎn)的增加。隱球菌也可在沒有HIV感染的情況下，出現(xiàn)在特發(fā)性CD4+T細(xì)胞減少癥中。然而近年來同時(shí)有實(shí)驗(yàn)表明，盡管CD4+T細(xì)胞可以控制真菌生長，但也可能會(huì)提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染新生隱球菌期間的免疫病理反應(yīng)和死亡率[9]。

1.1 輔助性T細(xì)胞1(T helper cells 1，Th1)

免疫正常的宿主對(duì)吸入的新生隱球菌主要產(chǎn)生Th1型反應(yīng)，既可以直接接觸并殺傷新生隱球菌，介導(dǎo)被感染部位肉芽腫的形成，阻止新生隱球菌的進(jìn)一步擴(kuò)散[10]。也可以在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受到隱球菌刺激產(chǎn)生IL-12后，細(xì)胞因子誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1軸的方向分化。Th1軸主要通過細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α對(duì)新生隱球菌進(jìn)行有效的細(xì)胞免疫。每種細(xì)胞因子的作用機(jī)制又各不相同。IL-2 是一種具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的生長因子，通過激活、增殖、分化T細(xì)胞和NK細(xì)胞，直接抑制新生隱球菌的生長[11]。除此之外，IL-2還可以誘導(dǎo)血清中IFN-γ的升高，并進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞，防止新生隱球菌感染的播散[12]。IL-12主要由活化的抗原提呈細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并在TNF-α的作用下調(diào)節(jié)原始Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化和生成。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-12缺陷型小鼠致使免疫反應(yīng)從保護(hù)性Th1型向非保護(hù)性Th2型轉(zhuǎn)換[13]。IFN-γ作為驅(qū)動(dòng)細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子具有介導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞有效殺傷病原菌的作用。IFN-γ通過STAT1信號(hào)將未成熟的巨噬細(xì)胞活化為M1型巨噬細(xì)胞，并表達(dá)大量的一氧化氮合成酶(iNOS)，介導(dǎo)L-精氨酸產(chǎn)生一氧化氮后消滅新生隱球菌[14]。同時(shí)有研究表明，STAT1缺失阻抑Th1的分化而使Th2的分化占優(yōu)勢(shì)[15]。TNF-α是一種在新生隱球菌感染早期由單核巨噬細(xì)胞釋放的單核因子，具有促進(jìn)淋巴樣細(xì)胞增殖分化及減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞激活的生物活性[16-17]。有研究表明，艾滋病患者在感染受到隱球菌感染后，通過調(diào)控NF-kB的激活和潛在的TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄和調(diào)控來抑制TNF-α的表達(dá)[18]。對(duì)于接受抗TNF-α治療的膿毒癥、癌癥和自身免疫性疾病的患者，新生隱球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[19-21]。在體外試驗(yàn)中，IL-2、IL-12、IFN-γ的減少會(huì)增加肺部及腦部真菌的感染風(fēng)險(xiǎn)[22-23]。對(duì)于艾滋病合并新生隱球菌腦膜腦炎患者，IL-2、IL-12、IFN-γ可以降低患者腦脊液真菌的負(fù)荷量提高，改善患者的預(yù)后[24]。

1.2 輔助性T細(xì)胞2(T helper cells 2，Th2)

Th2細(xì)胞及其表達(dá)的IL-4、IL-5和IL-13通過產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞因子也是巨噬細(xì)胞的活化介質(zhì)，通過介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞活化并表達(dá)精氨酸酶-1，進(jìn)而消耗L-精氨酸，不能產(chǎn)生NO，機(jī)體抵抗真菌的能力下降[25]。IL-4是一種抗炎因子，通過調(diào)控T細(xì)胞分化誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞活化對(duì)宿主的保護(hù)過程起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)IL-4水平的增加與新生隱球菌細(xì)胞清除減慢和感染小鼠死亡增加有關(guān)，同樣，在人類的艾滋病和隱球菌腦膜腦炎患者中，高血清IL-4水平與HIV和免疫重建炎性反應(yīng)綜合征(IRIS)的發(fā)生及死亡相關(guān)[6]。IL-5是一種與細(xì)胞因子特異性亞基受體IL-5Rα結(jié)合，促進(jìn)IgE產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞增加的非特異性細(xì)胞因子[26]。在動(dòng)物模型中，IL-5促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞在肺部隱球菌感染部位的聚集和活化[27]。IL-13通過抑制Th1型細(xì)胞反應(yīng)和啟動(dòng)巨噬細(xì)胞替代途徑的激活，促進(jìn)新生隱球菌的持續(xù)感染[28]。

新生隱球菌的毒力因子會(huì)破壞宿主的免疫系統(tǒng)，引發(fā)疾病，其作用機(jī)制也與Th2型免疫反應(yīng)密切相關(guān)。幾丁質(zhì)通過殼三糖苷酶誘導(dǎo)CD11b+樹突狀細(xì)胞應(yīng)對(duì)肺部新生隱球菌的感染，刺激IL-4和IL-13的產(chǎn)生并介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞活化[29-30]。葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖作為莢膜的主要成分錨定于新生隱球菌的細(xì)胞壁上，通過CD14和Toll受體4(TLR-4)刺激細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生TNF-α的通路被抑制[31]。脲酶作為新生隱球菌的主要毒力因子，可以促進(jìn)未成熟樹突狀細(xì)胞的積聚并引發(fā)非保護(hù)性的Th2型免疫應(yīng)答[32]，漆酶通過誘導(dǎo)Th2型反應(yīng)促進(jìn)新生隱球菌向宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播[33]，黑色素則誘導(dǎo)IL-4的產(chǎn)生，產(chǎn)后患者Th2型反應(yīng)的增強(qiáng)引起隱球菌感染，表現(xiàn)為無肉芽腫形成的肺炎[34-35]。

1.3 輔助性T細(xì)胞17(T helper cell17,Th17)

IL-17、IL-22、IL-23和TGF-β是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和 IL-6共同誘導(dǎo)初始(naive)T細(xì)胞分化為Th17表型[36]。IL-17通路通過上調(diào)促炎性細(xì)胞因子、抗菌肽及中性粒細(xì)胞趨化因子來啟動(dòng)和調(diào)節(jié)真菌免疫[37-38]。IL-17A在先天性免疫階段產(chǎn)生，新生隱球菌感染早期IL-17A并不能發(fā)揮作用，反而導(dǎo)致Th1免疫應(yīng)答降低，并減弱宿主對(duì)新生隱球菌感染的防御作用[39-40]。感染后期則通過白細(xì)胞募集，活化和產(chǎn)生γ干擾素調(diào)節(jié)宿主對(duì)隱球菌的遏制和清除[41]。在動(dòng)物模型中，IL-17針對(duì)隱球菌感染起到了保護(hù)性免疫作用[42]。在人類研究中，IL-17的提高可以增強(qiáng)真菌清除率和改善臨床療效[43]。JAK2/STAT3信號(hào)通路和半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)在Th17細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵作用，活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，刺激JAK2/STAT3通路，從而誘導(dǎo)譜系特異性主調(diào)控因子RORgt的表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[38]。半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)是小鼠樹突狀細(xì)胞的有效激活劑，當(dāng)與T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞因子反應(yīng)[36]?，F(xiàn)階段研究表明MAPK信號(hào)通路與巨噬細(xì)胞抗新生隱球菌的免疫過程存在顯著關(guān)聯(lián)。IL-17通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化因子(c-c基序)配體7(CCL7)表達(dá)上調(diào)，CCL7水平的增加誘導(dǎo)隱球菌感染初期 INF-γ 的產(chǎn)生。IL-23為IL-17 重要上游分子，可促進(jìn)Th17細(xì)胞活化、增殖和炎性細(xì)胞因子的分泌。IL-23通過IL-17非依賴性抑制嗜酸性粒細(xì)胞募集和IL-17依賴性調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生和嗜酸性晶體(YM1和YM2)沉積來抑制對(duì)隱球菌感染的過敏反應(yīng)[44]。在動(dòng)物模型中，IL-23細(xì)胞因子對(duì)隱球菌感染發(fā)揮保護(hù)作用，IL-23的缺失會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的趨化和細(xì)胞因子反應(yīng)減弱，為新生隱球菌感染免疫提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

1.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg cells)

Treg是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)特殊子集，可以抑制自身免疫反應(yīng)，其發(fā)育依賴于轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的表達(dá)[45]。Treg細(xì)胞和Th17來源于相同的前體T淋巴細(xì)胞，在特定細(xì)胞因子調(diào)控下向不同方向分化。Treg細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-10抑制肺Th2細(xì)胞反應(yīng)[46]。Treg在真菌的感染過程中既可以發(fā)揮有益也可以發(fā)揮有害作用。Treg細(xì)胞可以打破Th1/Th2/Th17的動(dòng)態(tài)平衡，降低Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制Th17的分化。在Treg缺失的小鼠中，IgE、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的產(chǎn)生增加，小鼠體內(nèi)的真菌負(fù)荷量顯著增加[47]。Treg通過共定位C-C趨化因子受體5型(CCR5)和IFN調(diào)節(jié)因子4(IRF4)與肺實(shí)質(zhì)中的Th2效應(yīng)細(xì)胞，抑制Th2型免疫反應(yīng)[48]。此外, Treg細(xì)胞的生長因子IL-2抑制Th17細(xì)胞的分化[49]。

2 CD8+T細(xì)胞(CD8+T cells)

CD8+T細(xì)胞在新生隱球菌宿主的免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮著重要的作用，CD8+T細(xì)胞通過直接接觸殺傷、產(chǎn)生TNF-γ限制新生隱球菌細(xì)胞。在體外，CD8+T細(xì)胞可以直接抑制隱球菌的生長繁殖，利用顆粒素直接殺傷新生隱球菌[50]。CD8+T細(xì)胞的增殖、趨化及產(chǎn)生IFNγ細(xì)胞因子的作用不依賴于CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ限制了新生隱球菌在巨噬細(xì)胞中的生長和存活[51]。同時(shí)，CD4+T細(xì)胞的缺失會(huì)導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的增殖。CD8+T細(xì)胞在隱球菌感染期間可以產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α等Th1型細(xì)胞因子，而Th2型細(xì)胞因子則只能由CD4+T細(xì)胞分泌[52]。

3 自然殺傷T細(xì)胞(NKT cells)

自然殺傷T細(xì)胞是一類來源于胸腺的天然T淋巴細(xì)胞，在其抗感染的免疫過程中，活化的NKT細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN-γ和IL-4活化自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[53]。NKT細(xì)胞在誘導(dǎo)保護(hù)性Th1免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。新生隱球菌感染后，Vα14 NKT細(xì)胞在肺部聚集，具有單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)趨化因子依賴性[54]，DCs可以激活NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞遞呈隱球菌脂質(zhì)抗原，誘導(dǎo)延遲型超敏反應(yīng)，并在Th1型免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[54-56]。此外，用α-半乳糖神經(jīng)酰胺激活的Vα14 NKT細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致Th1免疫應(yīng)答[56]。NKT細(xì)胞也分泌IL-4，這表明該亞群同時(shí)調(diào)節(jié)Th1和Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[57]。

4 γδT細(xì)胞(γδT cells)

依據(jù)T細(xì)胞表面抗原受體(T cell receptor,TCR)不同，可將T細(xì)胞分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞。γδT細(xì)胞可能通過作為黏膜水平的第一道防線，在抗真菌宿主防御中發(fā)揮重要作用[58]。γδT細(xì)胞在外周血中百分比很低，早前被認(rèn)為是一種沒有記憶能力的原始T細(xì)胞，卻在白細(xì)胞趨化和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[54,59]。γδT細(xì)胞主要產(chǎn)生 IL-17(γδT17)和 IFN-γ(γδT1)，γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17不需要抗原的誘導(dǎo)，然而產(chǎn)生 IFN-γ需要抗原的誘導(dǎo)。與NKT細(xì)胞不同，新生隱球菌感染早期γδT細(xì)胞在肺部積累的過程中不依賴MCP-1趨化因子。IL-17A主要由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生[60]，然而，中性粒細(xì)胞對(duì)γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A進(jìn)行負(fù)調(diào)控，在中性粒細(xì)胞缺失時(shí)，γδT細(xì)胞可以產(chǎn)生與保護(hù)性免疫反應(yīng)相關(guān)的IL-17A細(xì)胞因子[61]。

5 小 結(jié)

T細(xì)胞在宿主對(duì)新生隱球菌的防御中起著關(guān)鍵作用。Th1、Th2和Th17在宿主中通常處于平衡狀態(tài)，三種類型細(xì)胞因子與新生隱球菌病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。此外，Treg細(xì)胞在協(xié)調(diào)T細(xì)胞各亞群之間的平衡中很重要。雖然CD8+T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞和γδT細(xì)胞對(duì)真菌的防御過程的作用尚未完全了解，但一些研究表明，它們也有助于宿主對(duì)真菌的防御。

目前在新生隱球菌病治療領(lǐng)域中還沒有公認(rèn)有效的免疫治療方案，但有研究表明細(xì)胞因子可用于靶向治療新生隱球菌病的新方向，包括免疫治療靶細(xì)胞和抗真菌的疫苗開發(fā)，隱球菌甘露糖蛋白MP誘導(dǎo)了Th1型反應(yīng)，為基于MP制備新生隱球菌疫苗提供了可能[62]。IL-12治療感染隱球菌的小鼠，防止了全身隱球菌病和隱球菌腦膜腦炎的發(fā)生[63]。這些可能在未來成為常規(guī)抗真菌治療外的重要輔助治療方案[64]。