腫瘤免疫研究新平臺(tái)
——腫瘤組織微環(huán)境類器官研究進(jìn)展

羅建華 綜述；劉秋燕 審閱（海軍軍醫(yī)大學(xué) 免疫學(xué)研究所暨醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433）

以CAR-T 和PD-1/PD-L1 阻斷治療為代表的免疫療法已經(jīng)成為繼手術(shù)、放化療和靶向治療之外的腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者治療的重要手段[1-2]?；A(chǔ)研究及臨床前的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)荷瘤動(dòng)物模型是腫瘤免疫治療策略篩選的重要平臺(tái)，當(dāng)前的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)大都采用腫瘤細(xì)胞系單獨(dú)或與免疫細(xì)胞2D（two-dimensional）培養(yǎng)或共培養(yǎng)模式，這類培養(yǎng)模式雖然使用便利，但腫瘤細(xì)胞系在傳代培養(yǎng)過程中，不可避免存在染色體、基因組甚至表型的突變或變異；另外，2D培養(yǎng)模式不能準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)立體生長(zhǎng)模式及腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)空上的分布特征和互作模式[3]。對(duì)于體內(nèi)動(dòng)物腫瘤模型，人源的細(xì)胞系僅能接種于免疫缺陷小鼠，免疫缺陷小鼠因免疫細(xì)胞亞群缺失，無法評(píng)價(jià)某療法對(duì)免疫系統(tǒng)的影響；而基于腫瘤患者腫瘤組織所建立的患者來源移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型則存在制模周期較長(zhǎng)、腫瘤樣本需求量大、免疫相容性和移植成功率低[4-5]，以及腫瘤患者來源的腫瘤細(xì)胞本身的異質(zhì)性、多樣性和個(gè)體化特性等限制，因而免疫細(xì)胞亞群以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性在上述模型中均不能得到有效體現(xiàn)，故目前常規(guī)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均不足以概括人類腫瘤的復(fù)雜生物學(xué)特征，且無法完全模擬腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的復(fù)雜性，以及對(duì)藥物反應(yīng)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性并不高、腫瘤學(xué)臨床試驗(yàn)的成功率也偏低[6]。因此，急需構(gòu)建新的具有免疫細(xì)胞和免疫功能完整的體內(nèi)外組織培養(yǎng)模型，以便開發(fā)新的免疫療法、解決當(dāng)前治療方案的局限性和耐藥機(jī)制等問題。

類器官（organoid）是利用干細(xì)胞、成體細(xì)胞或者腫瘤組織細(xì)胞模擬其在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境并在體外進(jìn)行3D（three-dimensional）培養(yǎng)得到的具有一定空間結(jié)構(gòu)以及組織形態(tài)的器官樣結(jié)構(gòu)[7-10]。腫瘤患者來源的類器官（patient-derived organoid，PDO）根據(jù)其培養(yǎng)模式的不同主要可分為兩種，一種是不含免疫細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞類器官；另一種是包含浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群的腫瘤組織微環(huán)境類器官[11-16]。第二種腫瘤組織類器官保留了患者腫瘤組織和癌旁組織的腫瘤微環(huán)境特征[17]，應(yīng)用優(yōu)勢(shì)明顯，如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞可以完全來自同一患者、可以實(shí)現(xiàn)在體外增殖傳代、能夠較為完整地保留腫瘤的異質(zhì)性，以及有利于個(gè)體新抗原的發(fā)現(xiàn)等[18]；還可以體外進(jìn)行基因敲除、過表達(dá)、突變，甚至可進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控等操作而用于大規(guī)模藥物和精準(zhǔn)治療的篩選等[19-20]，凸顯其在腫瘤免疫治療領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)[21]。該模型體外大規(guī)模擴(kuò)增后可進(jìn)一步接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如免疫缺陷小鼠或人源化小鼠體內(nèi)，雖然也存在PDX模型的短板，但構(gòu)建成功率、制備周期及所需資金成本均大為改善和降低[22]。因此，PDO模型為研究免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用提供了可行方案，未來能夠極大地推進(jìn)和提升腫瘤免疫治療的進(jìn)程[23-25]。本文主要聚焦包含浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群的腫瘤組織微環(huán)境類器官，對(duì)其培養(yǎng)方法及應(yīng)用進(jìn)行梳理，并對(duì)其當(dāng)前存在的問題以及未來可能的發(fā)展前景進(jìn)行初步探討，以期為該領(lǐng)域的研究提供參考。

1 腫瘤組織微環(huán)境類器官培養(yǎng)模型

TME除了腫瘤細(xì)胞本身（包括休眠的腫瘤細(xì)胞、增殖/活化的腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞等），還包含大量多種非腫瘤細(xì)胞成分，如基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、駐留或侵襲的血管結(jié)構(gòu)和種類繁多的免疫細(xì)胞亞群網(wǎng)絡(luò)[17]。TME中各種細(xì)胞之間相互制衡決定著腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移結(jié)局，是影響腫瘤免疫治療策略是否有效的關(guān)鍵[26-28]。模擬腫瘤免疫微環(huán)境以求最真實(shí)、最快速、最簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)免疫治療效果并從中篩選出臨床可能受益的靶向人群是腫瘤免疫治療領(lǐng)域亟待解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)。此外，免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在TME 中相互作用的模式、介導(dǎo)腫瘤發(fā)生器官定向轉(zhuǎn)移機(jī)制、調(diào)控轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成的關(guān)鍵細(xì)胞亞群和調(diào)控分子的篩選和鑒定亦需要可靠的體外共培養(yǎng)平臺(tái)支撐[28]。根據(jù)是否需要添加外源免疫細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞可以將模擬TME 的類器官模型分為初始TME類器官培養(yǎng)模型（native TME model）和重建TME 類器官培養(yǎng)模型（reconstituted TME model）兩種[16]，下面將從培養(yǎng)方案、特點(diǎn)及適用性等角度對(duì)兩種模型進(jìn)行介紹。

1.1 初始TME類器官培養(yǎng)模型

初始TME 類器官培養(yǎng)模型的建立是基于“腫瘤組織整體培養(yǎng)”，即保留經(jīng)消化或切碎的原始腫瘤組織中的全部細(xì)胞用于培養(yǎng)[29]。其特點(diǎn)是培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊中也包含除腫瘤細(xì)胞以外的所有內(nèi)源性的免疫細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞。該模型目前已建立了微流控培養(yǎng)和氣液界面培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方案[16]。

1.1.1 微流控培養(yǎng)方案 微流控（microfluidic）是將微納米級(jí)別的生物反應(yīng)器和化學(xué)反應(yīng)器相組合，通過精確操控流體，以實(shí)現(xiàn)將樣品的培養(yǎng)、分離及檢測(cè)集成在幾平方厘米芯片上的科學(xué)技術(shù)[30]。微流控類器官培養(yǎng)是腫瘤微球利用特殊的3D微液流培養(yǎng)設(shè)備（來自不同實(shí)驗(yàn)室的3D 微液流培養(yǎng)設(shè)備因?qū)＠暾?qǐng)故有所不同，但基本原理大致一樣，即利用生物樹脂材料為腫瘤微球提供支架，將腫瘤微球吸附或者半流動(dòng)培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)小室，外側(cè)通過進(jìn)樣管路輸送培養(yǎng)基，小室和培養(yǎng)基由選擇性半透膜相隔，進(jìn)樣管路滿足控制培養(yǎng)基換液、添加其他細(xì)胞因子及試劑的需求），在膠原蛋白凝膠中以3D方式生長(zhǎng)增殖，凝膠外側(cè)充盈不同組織類器官特異性培養(yǎng)基，在提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)帶走細(xì)胞代謝廢物的同時(shí)為腫瘤類器官的培養(yǎng)提供合適pH環(huán)境和生長(zhǎng)壓力。具體操作是將腫瘤組織消化或者切碎后的微球體與膠原蛋白混合后注入微流控中央凝膠區(qū)，培養(yǎng)基添加到液流管路中[31]。

該培養(yǎng)模式極大程度上保留了腫瘤組織內(nèi)源性的免疫細(xì)胞亞群，有研究[30]將具有器官特征的腫瘤細(xì)胞球體（直徑為40～100 μm）和膠原蛋白凝膠一起在微流控設(shè)備中培養(yǎng)5～9 d 后，用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞亞群譜發(fā)現(xiàn)，腫瘤類器官中依然留存包括B細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC、髓源抑制性細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等多種類型免疫細(xì)胞亞群，為研究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用提供了可能性。此外，還可以利用該類器官培養(yǎng)體系，向該體系的培養(yǎng)基中外源性地加入擬研究的靶向免疫細(xì)胞亞群，如CAR-T細(xì)胞，用以研究和探討CAR-T 對(duì)腫瘤細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的影響，以評(píng)價(jià)CAR-T 的抗瘤效應(yīng)和免疫調(diào)控機(jī)制[32]。微流控類器官共培養(yǎng)體系提供可控量化的操作模式，在實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞各亞群共生的基礎(chǔ)上，甚至還可以外源性建立血管膜層，增強(qiáng)組織免疫細(xì)胞血管相互作用，更利于研究腫瘤免疫微環(huán)境模擬真實(shí)腫瘤情況。但該培養(yǎng)方案需要特殊微液流裝置，在應(yīng)用上也受到一定程度的限制[16,30]。

1.1.2 氣液界面（air liquid interface，ALI）培養(yǎng)方案ALI 培養(yǎng)方案無需使用特殊裝置，因此實(shí)用性更高。ALI 培養(yǎng)模式的特點(diǎn)是將腫瘤組織包埋在含有膠原蛋白凝膠的Transwell小室中，小室放置在器皿內(nèi)，器皿中加入類器官特異性培養(yǎng)基，培養(yǎng)基通過可滲透的小孔擴(kuò)散到小室內(nèi)，而包埋腫瘤組織的膠原蛋白凝膠層暴露在氣體中，使細(xì)胞能夠得到足夠的氧氣供應(yīng)，因此稱為ALI 培養(yǎng)法[33]。該方案在培養(yǎng)初期，小室和器皿都需要添加培養(yǎng)基，當(dāng)腫瘤類器官數(shù)量擴(kuò)增后，移除小室培養(yǎng)基，使得膠原凝膠暴露在氣體中[34]。

目前，ALI方法已經(jīng)廣泛用于腫瘤患者活檢來源的癌組織細(xì)胞的培養(yǎng)，如黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌等。ALI 腫瘤類器官不僅保留了原始腫瘤的遺傳與組織學(xué)特征，還保留了TME中的腫瘤實(shí)質(zhì)、間質(zhì)、成纖維細(xì)胞以及多種腫瘤組織浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞亞群，其中包括輔助性T細(xì)胞（helper T cell,Th）、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cell,Treg）和耗竭T 細(xì)胞（exhausted T cell，Tex）、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[17]。有研究[23]利用該培養(yǎng)模式，培養(yǎng)了來自71例腫瘤患者的110份活檢腫瘤樣本類器官，TCR 組分析結(jié)果顯示類器官中T 細(xì)胞的TCR 譜與原始腫瘤一致，證明該培養(yǎng)模式能夠有效地模擬腫瘤微環(huán)境的體生長(zhǎng)環(huán)境。此外，TREGUNNA 等[35]利用該培養(yǎng)模式評(píng)估免疫檢查點(diǎn)（checkpoint blockade，ICB）抑制劑如派姆單抗（pembrolizumab）的治療效果，與臨床試驗(yàn)結(jié)果一致，也進(jìn)一步證實(shí)了該培養(yǎng)方案用于免疫治療方案評(píng)估的真實(shí)性和可行性。初始TME 類器官培養(yǎng)模式見圖1。

1.2 重建TME類器官培養(yǎng)模型

與上述初始TME 類器官培養(yǎng)模型不同，重建TME 類器官培養(yǎng)模型僅包含腫瘤細(xì)胞，缺乏基質(zhì)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞；需要外源性的添加免疫細(xì)胞如PBMC、原代淋巴細(xì)胞、TIL、CAR 細(xì)胞和DC 才能研究腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用[22]。但該培養(yǎng)方案操作簡(jiǎn)單，腫瘤組織類器官組成單一且易于富集培養(yǎng)、成功率較高[5]。具體操作是在培養(yǎng)基下方的3D基質(zhì)膠內(nèi)培養(yǎng)腫瘤組織細(xì)胞，培養(yǎng)基根據(jù)腫瘤組織特異性補(bǔ)充各種生長(zhǎng)因子或信號(hào)通路抑制劑以維持腫瘤細(xì)胞的自我更新和分化，通常包括Wnt3a、R-spondin、EGF 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）抑制劑Noggin 等[27,36]。通過外周血淋巴細(xì)胞與腫瘤類器官共培養(yǎng)可獲得腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。該重建TME 類器官培養(yǎng)模式較初始TME培養(yǎng)模式操作簡(jiǎn)單，如初始TME培養(yǎng)模式中的培養(yǎng)基既要考慮到器官特異性腫瘤組織細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)所需，還要添加免疫細(xì)胞存活和增殖所需的營(yíng)養(yǎng)因子。但是，該重建TME 類器官培養(yǎng)模式中免疫細(xì)胞會(huì)隨著時(shí)間逐漸丟失，即使補(bǔ)充了IL-2、IL-7和IL-15等細(xì)胞因子，CD45+淋巴細(xì)胞活力的維持時(shí)間也不會(huì)超過2個(gè)月[16,37]。重組TME類器官培養(yǎng)模式見圖2。

2 腫瘤微環(huán)境類器官在腫瘤免疫研究中的應(yīng)用

隨著研究的進(jìn)展，患者來源的各類腫瘤組織（切除的原位癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)移瘤、活檢組織、腹水及胸水等）樣本均可以用于構(gòu)建腫瘤組織微環(huán)境類器官[38]，當(dāng)前已成功建立了前列腺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌等組織的類器官培養(yǎng)體系，不但能夠進(jìn)行擴(kuò)增、傳代、凍存和復(fù)蘇等體外操作構(gòu)建類器官生物銀行[34,39]，還能通過原位、皮下或靜脈接種構(gòu)建荷瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫研究中[25]?；蚪M學(xué)外顯子測(cè)序結(jié)果[11,19,40]表明，不同來源的腫瘤類器官均保留了原發(fā)腫瘤組織的基因型特征，體外培養(yǎng)的TME 類器官可以充分反映腫瘤組織的異質(zhì)性，為TME 類器官的基礎(chǔ)研究和臨床前應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。下面將從生物標(biāo)志物鑒定、聯(lián)合治療策略評(píng)估及免疫治療新方法篩選等幾個(gè)方面對(duì)TME類器官在腫瘤免疫研究中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

2.1 用于生物標(biāo)志物的鑒定

腫瘤的發(fā)生是大量突變不斷累積的結(jié)果，少數(shù)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)突變由于腫瘤異質(zhì)性難以識(shí)別[41]。同時(shí)建立來源于腫瘤患者的正常組織類器官和腫瘤組織類器官，其中正常組織類器官遺傳信息相對(duì)穩(wěn)定，適合作為研究腫瘤突變對(duì)照模型，通過比較腫瘤類器官和相應(yīng)組織類器官基因表達(dá)情況即可推斷出可能的驅(qū)動(dòng)突變[42]。患者對(duì)于腫瘤免疫治療的響應(yīng)存在差異，多種生物標(biāo)志物包括PD-L1 表達(dá)、CD8+TIL 密度[43]、錯(cuò)配修復(fù)缺陷（mismatch repair-MMR）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）、腫瘤負(fù)荷（tumor mutationalburden，TMB）[44]、腫瘤新抗原表位和TCR克隆性以及免疫基因特征均有助于對(duì)患者的臨床反應(yīng)性進(jìn)行預(yù)測(cè)[45]。PDO 模型在保留了腫瘤細(xì)胞特征的情況下，利用多組學(xué)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物發(fā)掘，對(duì)尋找新的癌癥預(yù)后生物標(biāo)志物提供更多可能性，為腫瘤精準(zhǔn)治療和個(gè)體化治療提供靶標(biāo)[46]。KONG 等[47]利用重建TME 類器官方案培養(yǎng)原發(fā)性肝癌組織類器官，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，EUBE2S 和DTYMK 等分子在肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和C1QBP 在膽管細(xì)胞癌（cholangiocarcinoma,CC）中高表達(dá)時(shí)患者預(yù)后較差；LENZ 等[48]確定了黏膜相關(guān)淋巴瘤易位蛋白1（MALT1）蛋白酶、含有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的蛋白11（CARD11）的突變與彌漫性B 細(xì)胞淋巴瘤的進(jìn)展高度相關(guān)。

2.2 用于免疫聯(lián)合治療策略的評(píng)估

腫瘤治療在臨床上往往選擇多種免疫療法的組合，利用多個(gè)免疫檢查點(diǎn)（如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3和VISTA）及免疫抑制細(xì)胞群（如Treg）的獨(dú)特生物學(xué)特性聯(lián)合化學(xué)療法、放射療法以及通過抑制血管生成治療腫瘤[48]，而來源于患者的腫瘤類器官因具有與患者同樣的基因型表型、突變潛能而成為臨床前癌癥治療方法的試金石[49]。類器官可以較為真實(shí)地反映患者體內(nèi)表型、基因型和特定基因功能的特征以及組織多種生理和病理變化，為優(yōu)化患者聯(lián)合治療方案制定提供了可靠的篩選平臺(tái)[2]。PAULI等[50]利用重建TME類器官培養(yǎng)方案培養(yǎng)結(jié)直腸癌類器官，發(fā)現(xiàn)阿法替尼和組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合治療能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，療效優(yōu)于奧沙利鉑單藥治療。5-氟尿嘧啶（5-FU）、葉酸和奧沙利鉑聯(lián)合用藥是當(dāng)前轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，而大多數(shù)患者在治療過程中會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。以往研究表明腫瘤干細(xì)胞與結(jié)直腸癌的化學(xué)耐藥有關(guān)，抑制腫瘤干細(xì)胞信號(hào)通路如Wnt、Notch 和Hedgehog通路可有效提高癌癥患者的生存率。為了解耐藥產(chǎn)生的潛在機(jī)制并篩選結(jié)直腸癌適用藥物，USUI 等[51]構(gòu)建了結(jié)直腸癌患者來源的高表達(dá)LGR5和CD44 的腫瘤干細(xì)胞類器官用以研究腫瘤干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)的抑制劑是否能夠提高化療藥物的敏感性,研究結(jié)果表明,Hedgehog 信號(hào)抑制劑（AY9944 和GANT61）與抗癌藥物聯(lián)合治療能夠抑制腫瘤細(xì)胞干性、減少類器官集落生成、逆轉(zhuǎn)耐藥，顯著提高患者療效。

2.3 用于腫瘤特異性T細(xì)胞的制備

惡性細(xì)胞表現(xiàn)出足夠的免疫原性是免疫治療的先決條件，培養(yǎng)在基質(zhì)膠中的類器官，雖然缺乏免疫組分，但可以作為抗原來源篩選腫瘤反應(yīng)性T 細(xì)胞[52]。BRANDENBERG 等[53]利用ALI 類器官培養(yǎng)模型在補(bǔ)充有IL-2、抗CD28 和抗PD1 的培養(yǎng)基中，通過將NSCLC 患者來源腫瘤類器官與自體PBMC 的共培養(yǎng)，篩選了對(duì)正常細(xì)胞無細(xì)胞毒作用、而能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞[52]。

此 外，為了評(píng)估氨基雙膦酸鹽（aminobisphosphonate，BP）的抑癌效果，ZUMWALDE 等[54]構(gòu)建BP 治療后的乳腺癌類器官，發(fā)現(xiàn)與未治療組相比，Vδ2+T細(xì)胞在類器官中聚集增加，之后利用重建TME類器官培養(yǎng)模型，將患者來源的PBMC 與乳腺癌類器官共培養(yǎng)并給予低濃度BP以刺激并擴(kuò)增Vδ2+T細(xì)胞，將上述擴(kuò)增培養(yǎng)的Vδ2+T細(xì)胞與患者新生腫瘤細(xì)胞共孵育顯示，Vδ2+T 細(xì)胞IFN-γ 分泌顯著增加，細(xì)胞毒性作用顯著增強(qiáng)，提示BP可增強(qiáng)Vδ2+T細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能及消除新生腫瘤細(xì)胞。以上結(jié)果表明，可以利用腫瘤類器官技術(shù)平臺(tái)制備和擴(kuò)增腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答[52]。

2.4 用于免疫治療新方法的篩選和評(píng)估

腫瘤的異質(zhì)性是腫瘤患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療的重要原因。以往的研究主要是應(yīng)用腫瘤細(xì)胞系在體外可無限增殖這一特點(diǎn)篩選癌癥藥物，但在傳代過程中腫瘤細(xì)胞對(duì)2D環(huán)境逐漸適應(yīng)和選擇丟失親本腫瘤異質(zhì)性，不能評(píng)估抗腫瘤藥物療效與安全性，而PDX模型培養(yǎng)周期長(zhǎng)且費(fèi)用昂貴[55]。腫瘤類器官體外突變與體細(xì)胞突變一致，能夠保證與患者相同的藥物敏感性，且該模型在體外能夠穩(wěn)定傳代、大量擴(kuò)增，因此可以用于高通量化療藥物的篩選，比PDX 模型更具有代表性，是預(yù)測(cè)不同患者與治療反應(yīng)性的合理工具[56]；并且來源于同一患者的腫瘤組織和正常組織都可以培養(yǎng)成類器官，對(duì)兩者同時(shí)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)和藥物毒性測(cè)試，可以篩選出特異性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無毒性的藥物，從而減少藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)[57]。

此外，在胰腺癌的治療中，通過胰腺癌類器官篩選得到的奧沙利鉑和光動(dòng)力聯(lián)合療法較單一療法相比，抗腫瘤功效顯著增強(qiáng)，且未增加毒副作用。同樣腫瘤組織類器官模型亦可應(yīng)用于CAR-T 以及CAR-NK 細(xì)胞免疫療法的篩選和評(píng)估[58]，SCHNALZGER等[59]利用ALI結(jié)直腸癌類器官模型評(píng)價(jià)了靶向EGFRvⅢ+的CAR-NK92 細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌的抗瘤效應(yīng)，結(jié)果顯示，該細(xì)胞能夠特異性殺傷EGFRvⅢ+的結(jié)直腸癌類器官，而對(duì)正常組織細(xì)胞無殺傷活性，提示類器官-免疫細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)可用于評(píng)估正常和腫瘤類器官中CAR介導(dǎo)的腫瘤特異性細(xì)胞毒性。

3 TME類器官應(yīng)用存在的缺陷和限制

3.1 腫瘤免疫微環(huán)境重塑困難

免疫微環(huán)境是由細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)的DC、Treg、TAM、MDSC 等多種免疫細(xì)胞組成的復(fù)雜系統(tǒng)，腫瘤免疫微環(huán)境隨時(shí)空變化一直處于動(dòng)態(tài)發(fā)展中且高度異質(zhì)，不同腫瘤類型以及不同個(gè)體患者之間均存在差異[7,22,43]，如何維持類器官培養(yǎng)過程中免疫微環(huán)境使其與在體微環(huán)境保持一致有待于進(jìn)一步完善和優(yōu)化[60-61]。常用的ALI類器官培養(yǎng)模式維持了氧氣供應(yīng)及適宜氧梯度，有助于類器官生存；但ALI 培養(yǎng)仍無法解決類器官培養(yǎng)免疫細(xì)胞組分維持時(shí)間短的問題[62]。究其原因可能與基質(zhì)細(xì)胞耗竭迅速，從而使腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞-基質(zhì)細(xì)胞相互作用難以維持有關(guān)[5]。

3.2 腫瘤類器官較正常上皮組織生長(zhǎng)緩慢

在腫瘤組織類器官培養(yǎng)過程中，正常上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較腫瘤細(xì)胞快，從而使其在培養(yǎng)環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而抑制腫瘤類器官的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，取材時(shí)應(yīng)最大程度地避免污染正常上皮細(xì)胞。此外，不同腫瘤組織來源類器官應(yīng)控制不同大小。例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官應(yīng)嚴(yán)格控制在0.5 mm 以下[43]。部分腫瘤類器官若培養(yǎng)體積過大會(huì)引起氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸無法在類器官內(nèi)部擴(kuò)散，最終導(dǎo)致中心壞死，從而影響后續(xù)應(yīng)用[63-64]。

3.3 影響腫瘤類器官成功構(gòu)建的因素

當(dāng)前建立的較為成熟的POD模型還僅限于上皮來源的腫瘤組織，其他類型腫瘤如血液瘤尚未建立成熟模型。腫瘤類器官構(gòu)建是否成功與腫瘤組織的種類、來源、細(xì)胞生長(zhǎng)階段等多種因素有關(guān)[65]。不同組織類型類器官所需培養(yǎng)條件不盡相同，與組織來源高度相關(guān)，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子或小分子抑制劑對(duì)類器官中的基因表達(dá)和信號(hào)通路、藥物以及免疫治療的敏感性有顯著影響，需要進(jìn)一步研究解決[30,54,58,66-67]。不同類型腫瘤類器官構(gòu)建的成功率差異顯著，其中結(jié)直腸癌成功率最高，可達(dá)90%以上，卵巢癌和胰腺癌次之，可分別達(dá)到85%或75%～85%，而肝癌和前列腺癌則較低，僅有30% 和15%～20%[65,67-69]。有研究[53]發(fā)現(xiàn)尚有部分類器官不能在體外長(zhǎng)期擴(kuò)增。此外，不同實(shí)驗(yàn)室來源的同一組織類器官的培養(yǎng)基組分不同，目前尚無統(tǒng)一的培養(yǎng)方案標(biāo)準(zhǔn)，因此不同取樣批次以及不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方案均有差異，需要對(duì)培養(yǎng)條件持續(xù)改良[16]。另外，還存在細(xì)胞外基質(zhì)膠阻礙藥物滲透，進(jìn)而影響類器官在藥物篩選中的應(yīng)用，需要研發(fā)新型細(xì)胞基質(zhì)膠等問題[69,70]。

4 總結(jié)與展望

腫瘤類器官除保留親本腫瘤組織的基因組學(xué)和遺傳學(xué)特性、異質(zhì)性、傳代穩(wěn)定、可體外大量擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)之外，還可進(jìn)行基因編輯操作，避免了倫理問題[12]，因此該平臺(tái)在腫瘤患者免疫聯(lián)合治療策略的評(píng)估、免疫治療新方法的篩選及生物標(biāo)志物的鑒定等方面優(yōu)勢(shì)明顯，從而使患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療成為可能。此外，液體活檢來源的腫瘤類器官，取材不受腫瘤部位限制，可在腫瘤進(jìn)展的不同階段或用藥前后隨時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)，腫瘤類器官技術(shù)實(shí)現(xiàn)了腫瘤生長(zhǎng)過程的可視化[71]。類器官培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合器官芯片技術(shù)，對(duì)TME 多個(gè)組分進(jìn)行搭配，旨在研究這種微流控系統(tǒng)中各組分間信息交流，對(duì)類器官的培養(yǎng)做到可控可重復(fù)，并在一定程度上實(shí)現(xiàn)類器官脈管化。結(jié)合4D成像技術(shù)能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同細(xì)胞亞群之間的活細(xì)胞間相互作用，對(duì)于研究共培養(yǎng)系統(tǒng)中的免疫動(dòng)力學(xué)尤其重要[31]。腫瘤類器官培養(yǎng)結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)以及微加工和微流體技術(shù)，構(gòu)建的organ-on-chip（OoC），以及tumor-on-chip（ToC），是在微流控設(shè)備（也稱為“芯片”）上培養(yǎng)的類器官，其3D仿生基質(zhì)中還可共同培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞[72]。ToC 技術(shù)實(shí)驗(yàn)成本低，未來有望實(shí)現(xiàn)高通量藥物測(cè)試，有效區(qū)分免疫療法應(yīng)答與非應(yīng)答患者，定義有效劑量與確定聯(lián)合治療方案[30]。

綜上，腫瘤類器官培養(yǎng)對(duì)深入了解腫瘤免疫系統(tǒng)、腫瘤免疫治療具有開創(chuàng)性意義。相信隨著該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，更加完善便利的類器官培養(yǎng)模式會(huì)大量涌現(xiàn)，類器官也將成為未來基礎(chǔ)研究和臨床前研究中不可或缺的新平臺(tái)。