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    IFITM1在胰腺癌中的表達及對胰腺癌細胞生物學行為的影響

    2022-04-07 02:30:40趙秀雷張雷劉汝海李鳳山張執(zhí)全孔德帥張耀敏石倩倩劉婷婷
    中國普通外科雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:劃痕胰腺癌孵育

    趙秀雷,張雷,劉汝海,李鳳山,張執(zhí)全,孔德帥,張耀敏,石倩倩,劉婷婷

    (河北省滄州市中心醫(yī)院肝膽胰外一科,河北滄州061000)

    統(tǒng)計報告顯示,全世界每年新增胰腺癌患者約46萬例,死于胰腺癌的患者約為43萬例,分別占所有惡性腫瘤的2.5%和4.5%,每年新發(fā)胰腺癌患者的比例雖然排在所有惡性腫瘤的第14位,但其病死率卻排在第7位,并且近年來胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,總體發(fā)病年齡呈下降趨勢[1-3]。胰腺癌早期診斷困難,接近一半的患者在確診時已處于晚期[4-5]。雖然不斷有新的靶向藥物、免疫藥物被應用于臨床,但是胰腺癌患者的5年生存率仍不足10%[6]。胰腺癌的轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致治療失敗和患者死亡的重要因素,但其機制尚不清楚[7]?,F(xiàn)階段研究[8-10]表明,作為MAPK通路的核心激酶,ERK1/2的磷酸化激活會顯著促進下游增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達,ERK1/2的激活是導致胰腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素,調(diào)控ERK1/2則是治療胰腺癌的重要思路。干擾素誘導的跨膜蛋白1(interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)是一種分子量為17 kDa的膜蛋白,是在淋巴細胞中轉(zhuǎn)導同型黏附信號的膜復合物的一部分[11-13]。一項測序研究[14]結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFITM1的轉(zhuǎn)錄水平在胰腺癌組織中顯著升高,但是IFITM1蛋白在胰腺癌中的意義以及作用機制則仍不清楚。綜上,本研究主要分析IFITM1、ERK1/2在胰腺癌中的表達特點,并分析IFITM1調(diào)控胰腺癌細胞遷移和侵襲的分子機制。

    1 材料與方法

    1.1 組織樣本

    選擇2018年6月—2021年6月間在河北省滄州市中心醫(yī)院肝膽胰外一科行手術(shù)治療的78例胰腺癌患者,收集患者手術(shù)切除的胰腺癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤組織3 cm以上)。其中男47例,女31例;年齡41~74歲。根據(jù)全身正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission tomographycomputed tomography,PET-CT)的結(jié)果,將患者分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組。未轉(zhuǎn)移組患者46例,男28例,女18例;平均年齡(53.25±3.62)歲。轉(zhuǎn)移組共32例,男19例,女13例;平均年齡(54.42±3.79)歲。納入標準:⑴年齡在40~75歲之間;⑵確診為胰腺癌;⑶患者知情同意。排除標準:⑴收集前3個月內(nèi)接受過胰腺癌相關(guān)治療;⑵合并血液學疾病、感染或炎癥;⑶合并其他癌癥。本研究經(jīng)過河北省滄州市中心醫(yī)院倫理委員會的批準。

    1.2 材料

    人胰腺癌細胞PANC-1(ATCC,美國)。96孔、24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司,美國)。RPMI 1640培養(yǎng)基和抗體(Gibco公司,美國)。IFITM1過表達質(zhì)粒以及相應的陰性對照(negative control,NC)(吉瑪公司,中國)。Lipofectamine?2000(Invitrogen公司,美國)。選擇性ERK1/2抑制劑LY3214996(Selleck公司,美國)??贵w(Abcam公司,美國)。PDVF膜(Millipore公司,美國)。ECL顯色試劑盒和Nanodrop 2000儀器(Thermo Fisher公司,美國)。凋亡試劑盒(Annexin V-FITC和PI)(耶森公司,中國)。流式細胞儀(Becton公司,美國)。基質(zhì)膠和Transwell裝置(Corning公司,美國)。光學顯微鏡(奧林巴斯公司,日本)。

    1.3 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

    人胰腺癌細胞PANC-1培養(yǎng)在RPMI1640完全基中,培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃和95%濕度下培養(yǎng)。細胞分為3組:對照組、IFITM1組、IFITM1+LY3214996組。IFITM1組和IFITM1+LY3214996組細胞通過轉(zhuǎn)染IFITM質(zhì)粒來過表達IFITM1。將細胞在6孔板中培養(yǎng),當細胞達到60%匯合后,添加Opti(100μL)和LipofectamineTM2000(5μL)并孵育5 min作為試劑A。加入Opti(100μL)和IFITM1質(zhì)粒(20 ng/μL)并孵育5 min作為試劑B。將A和B混合在一起并孵育20 min。16 h后,更換培養(yǎng)基并收獲細胞。對照組細胞轉(zhuǎn)染等量的NC作為對照。IFITM1+LY3214996組的細胞在培養(yǎng)基中加入終濃度為10 nmol/L ERK1/2通路抑制劑LY3214996。

    1.4 檢測方法

    1.4.1 Western blot對于組織中的蛋白水平,按照分組將等量的組織一起裂解。組織或者細胞裂解后通過離心(4℃,12 000 r/min,5 min)收集總蛋白。通過10%的SDS-PAGE分離40μg的蛋白質(zhì),并將其轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。加入5%脫脂牛奶(室溫,2 h)封閉后加入一抗(1∶1 000稀釋,4°C,8 h),洗滌后加入二抗(1∶2 000稀釋,室溫,1 h)。條帶利用ECL可視化處理,GAPDH作為內(nèi)參,分析ERK1/2和p-ERK1/2的相對表達量。

    1.4.2 CCK-8檢測細胞增殖活力將100μL的細胞懸浮液添加到96孔板的孔中,孵育24 h和48 h后,將體積為10μL的CCK-8溶液添加到每個孔中并孵育2 h。在450 nm波長下,用酶標儀檢測每個孔的光密度(OD)值。

    1.4.3 流式細胞術(shù)檢測凋亡將細胞用1×PBS洗滌并懸浮在100μL結(jié)合緩沖液中。加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI,在室溫下于黑暗中孵育10~15 min。最后,將400μL的結(jié)合緩沖液添加到樣品中,并在1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

    1.4.4 劃痕愈合實驗檢測遷移按照上述方法在6孔板中培養(yǎng)細胞,形成單層細胞。然后使用200μL塑料移液器吸頭進行劃痕。在0 h的劃痕寬度。倒出培養(yǎng)基,洗去劃掉的細胞,然后將細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。再次拍照以評估劃痕的愈合情況。通過光學顯微鏡測量劃痕前緣遷移距離百分比。。

    1.4.5 Transwell檢測侵襲將基質(zhì)膠(1∶8稀釋)加入Transwell裝置的上室并在37°C下孵育30 min。將600μL完全培養(yǎng)基填充到4孔板-Transwell裝置的下室。將細胞在無血清培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)24 h進行饑餓處理。消化后,向水合的Transwell上室中加入100μL細胞溶液(5×105個細胞/mL)。24 h后,洗去未侵入的細胞。滲入下室的細胞用95%乙醇固定,0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min。在×400倍視野中的5個隨機視野中計數(shù)細胞數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計學處理

    使用SPSS 19.0進行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示,兩組間的比較通過t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 胰腺癌組織中IFITM1的表達特點

    IFITM1在胰腺癌組織中的相對表達量明顯高于癌旁正常組織(3.85±0.34vs.1.00±0.08,P<0.001)(圖1A)。IFITM1在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的相對表達量明顯高于未轉(zhuǎn)移組胰腺癌組織(4.04±0.19vs.2.00±0.11,P=0.007)(圖1B)。

    圖1 Western blot檢測IFITM 1蛋白表達A:胰腺癌組織與癌旁正常組織;B:有轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織與無轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織Figure1 IFITM1 protein expressions detected by Western blot analysis A:Pancreatic cancer tissues and adjacent normal tissue;B:Pancreatic cancer tissueswith and without metastasis

    2.2 各組細胞中IFITM1蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平比較

    各組細胞中IFITM1蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。IFITM1組的IFITM1和p-ERK1/2/ERK1/2水平明顯高于對照組(P<0.001)。IFITM1+LY3214996組的p-ERK1/2/ERK1/2水平明顯低于IFITM1組(P<0.001),但IFITM1水平與IFITM1組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IFITM1+LY3214996組的IFITM1蛋白水平明顯高于對照組(P<0.001),p-ERK1/2/ERK1/2水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

    圖2 各組細胞中IFITM 1蛋白和ERK 1/2蛋白磷酸化水平Figure 2 The levels of IFITM1 protein and phosphorylation ERK 1/2 protein in each group of cells

    2.3 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞增殖活力的影響

    各組細胞增殖活力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IFITM1組的24、48 h的細胞增殖活力均明顯高于對照組(均P<0.001);IFITM1+LY3214996組24、48 h的細胞增殖活力均明顯低于IFITM1組(均P<0.001);IFITM1+LY3214996組與對照組間24、48 h的細胞增殖活力差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(圖3)。

    圖3 CCK-8法檢測各組胰腺癌細胞的增殖活力(OD值)Figure 3 Theproliferativeability of each group of pancreatic cancer cellsdetected by CCK-8 assay(OD value)

    2.4 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞凋亡的影響

    各組細胞的凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=16.1578,P=0.004)。IFITM1組的凋亡率明顯低于對照組[(3.86±0.41)%vs.(6.01±0.58)%,P=0.014];IFITM1+LY3214996組的凋亡率明顯高于IFITM1組[(5.67±0.63)%vs.(3.86±0.41)%,P=0.027];IFITM1+LY3214996組與對照組的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義[(5.67±0.63)%vs.(6.01±0.58)%,P>0.05](圖4)。

    圖4 流式細胞術(shù)檢測各組胰腺癌細胞凋亡情況Figure4 Theapoptosisin each group of pancreatic cancer cellsdetected by flow cytometry

    2.5 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞遷移的影響

    各組細胞遷移能力差異有統(tǒng)計學意義(F=23.715,P<0.001)。IFITM1組的劃痕前緣遷移百分比明顯高于對照組[(86.23±4.61)%vs.(51.78±2.64)%,P<0.001];IFITM1+LY3214996組的劃痕前緣遷移百分比明顯低于IFITM1組[(48.82±3.12)%vs.(86.23±4.61)%,P<0.001];IFITM1+LY3214996組與對照組劃痕前緣遷移百分比差異無統(tǒng)計學意義[(48.82±3.12)%vs.(51.78±2.64)%,P>0.05](圖5)。

    圖5 劃痕愈合實驗檢測各組胰腺癌細胞的遷移能力Figure 5 The migration ability of each group of pancreatic cancer cells analyzed by scratch healing experiment

    2.6 IFITM1通過ERK1/2對胰腺癌細胞侵襲的影響

    3組細胞侵襲能力差異有統(tǒng)計學意義(F=36.286,P<0.001)。IFITM1組的侵襲細胞數(shù)目明顯高于對照組[(210.85±15.43)個vs.(104.47±10.86)個,P<0.001];IFITM1+LY3214996組的侵襲細胞數(shù)目明顯低于IFITM1組[(112.35±14.94)個vs.(210.85±15.43)個,P<0.001];IFITM1+LY3214996組與對照組的侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義[(112.35±14.94)個vs.(104.47±10.86)個,P>0.05](圖6)。

    圖6 Transwell實驗檢測各組胰腺癌細胞的侵襲能力Figure 6 The invasion ability of each group of pancreatic cancer cells analyzed by Transwell assay

    3 討論

    IFITM1是一種由干擾素誘導的蛋白,具有調(diào)節(jié)細胞增殖、存活、運動和分泌的作用[15-17]。近年來研究[18-20]表明IFITM1在喉癌、胰腺癌等中發(fā)揮促癌作用。Sakamoto等[21]的研究結(jié)果表明,IFITM1可參與細胞黏附和增殖的多聚體復合蛋白,IFITM1在肺癌組織中過表達并且促進肺癌細胞的遠端轉(zhuǎn)移。也有研究顯示IFITM1是膽囊癌轉(zhuǎn)移的標志因子[22]。為分析IFITM1在胰腺癌中的意義,本研究在臨床上收集了胰腺癌組織和癌旁正常組織,結(jié)果顯示IFITM1在胰腺癌組織中顯著過表達。此外,根據(jù)腫瘤轉(zhuǎn)移情況分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組,結(jié)果顯示出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的IFITM1蛋白水平顯著高于未轉(zhuǎn)移組。為進一步分析IFITM1對胰腺癌細胞的影響,本研究通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建了IFITM1過表達的胰腺癌細胞模型,結(jié)果顯示提高IFITM1的水平會促進細胞的增殖、遷移和侵襲的能力,并抑制凋亡。本研究結(jié)果提示IFITM1與胰腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān),IFITM1可促進胰腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移來促進胰腺癌進展。

    為進一步分析IFITM1促進胰腺癌進展的機制,本研究也檢測了IFITM1對胰腺癌細胞中ERK1/2的影響。一項研究[23]顯示IFITM1可通過調(diào)節(jié)ERK1/2的激活參與人類矮小癥的發(fā)生。也有研究[24-25]顯示IFITM1的配體干擾素-γ可通過促進ERK1/2的磷酸化激活促進腫瘤細胞的免疫逃逸,從而促進肺癌進展。ERK1/2蛋白已被證明參與胚胎發(fā)育、器官發(fā)生以及多種生理過程,包括、代謝、細胞周期、免疫等[26-27]。研究[28-30]顯示ERK1/2被磷酸化激活后會促進細胞周期、細胞運動和抗凋亡蛋白的表達,進而參與胰腺癌的發(fā)生和進展。本次研究結(jié)果顯示IFITM1蛋白的水平升高后,胰腺癌細胞中的ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著升高。此外,本研究也進行了挽救實驗,即利用ERK1/2抑制劑LY3214996來阻斷ERK1/2的激活。結(jié)果顯示抑制ERK1/2的激活可顯著的阻斷IFITM1對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用,并降低IFITM1的抗凋亡作用。根據(jù)文獻,本研究結(jié)果說明IFITM1促進胰腺癌的作用與ERK1/2密切相關(guān)。

    然而,本研究也存在不足之處,關(guān)于IFITM1與胰腺癌患者生存率之間的關(guān)系仍需要擴大樣本進行長期隨訪研究。此外,IFITM1通過ERK1/2促進胰腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制仍需要動物實驗證實。

    綜上所述,IFITM1促進胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并抑制凋亡,IFITM1在胰腺癌組織中上調(diào)并可通過激活ERK1/2促進胰腺癌轉(zhuǎn)移。提示IFITM1可能成為診斷和治療胰腺癌的新靶點。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

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