• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA 909靶向調(diào)控miR-194-5p/DACH1軸對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

    2022-04-07 02:30:38鄧家琦錢保林張麗云李明星
    中國普通外科雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:實驗分析

    鄧家琦,錢保林,張麗云,李明星

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.超聲醫(yī)學(xué)科2.肝膽外科3.健康管理部,四川瀘州646000)

    胰腺癌是一種惡性程度很高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其主要病理類型為胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD),病死率居我國惡性腫瘤第5位,預(yù)后較差,患者生存率低[1-2]。近年來,該病的發(fā)病率及病死率均呈逐年上升的趨勢,給人民的健康安全造成嚴(yán)重威脅[3]。目前還沒有很好的胰腺癌早期診斷手段,外科手術(shù)切除是胰腺癌最有效的治療手段,但因術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā),其5年生存率仍低于20%[4]。因此,尋找有效的胰腺癌早期診斷和治療靶點至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度>200個核苷酸長度的RNA片段,其缺乏開放閱讀框架,不具備編碼蛋白的能力,參與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控,在機體的正常發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5-7]。lncRNA可作為一種競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)吸附微小RNA(microRNA,miRNA),參與靶基因的表達調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[8-10]。長鏈非編碼RNA 909(LINC00909)是一個新發(fā)現(xiàn)的長度約為2 kb的lncRNA,位于18號染色體q22.3上,在膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌和白血病中被報道發(fā)揮癌基因的作用[11-14]。然而,關(guān)于LINC00909在胰腺癌中的作用鮮有報道,因此本研究從LINC00909作為ceRNA發(fā)揮生物學(xué)功能這一角度出發(fā),通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建LINC00909 ceRNA網(wǎng)絡(luò),并通過細(xì)胞學(xué)實驗驗證LINC00909對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,為進一步研究LINC00909在胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機制、診斷及預(yù)后提供了新的線索和思路。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞和主要試劑

    胰腺正常細(xì)胞系HPDE及SW1990細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物公司,PANC-1、BXPC3及ASPC1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞研究所。針對LINC00909的小干擾RNA片段(si-LINC00909-1#,si-LINC00909-2#)、miR-194-5p模擬物(mimics)、miR-194-5p抑制物(inhibitor)和陰性對照(NC)購自上海吉瑪生物科技有限公司,脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司,DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司,青霉素和鏈霉素購自美國Sigma公司,活細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自碧云天生物科技公司,TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix和實時定量PCR(qPCR)試劑盒One Step SYBR PrimeScript購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 表達及預(yù)后分析

    從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理胰腺癌轉(zhuǎn)錄組的miRNA及mRNA/lncRNA表達譜數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。利用R語言limma包對癌旁和癌組織的miRNA進行表達差異對比分析。利用R語言“survival”包、“survminer”包及“ggstatsplot”包,對所得到的基因進行生存分析,分析其與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。利用lncRNA-miRNA結(jié)合數(shù)據(jù)庫(starBase)及3個miRNA-mRNA結(jié)合數(shù)據(jù)庫(miRmap、miRanda和TargetScan),預(yù)測LINC00909的靶miRNA以及靶miRNA下游的mRNA,并構(gòu)建LINC00909-miRNAmRNA網(wǎng)絡(luò)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

    復(fù)蘇PANC-1及SW1990細(xì)胞于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,復(fù)蘇HPDE、BXPC3及ASPC1細(xì)胞于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達到約80%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。按照1×105個/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞融合度達約50%~60%時,采用脂質(zhì)體向PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-LINC00909、miR-194-5p mimics、miR-194-5p inhibitor及NC。

    1.4 CCK-8實驗

    按照5×103個/孔的密度將各組細(xì)胞接種于96孔板,分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h加入10μL CCK-8溶液,恒溫培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度,以空白孔為參照,評估細(xì)胞的增殖情況。

    1.5 劃痕實驗

    將細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)后形成單層,用200μL無菌移液器槍頭在單層細(xì)胞中央劃出一條直線,于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并在劃痕0、24 h后用顯微鏡拍攝細(xì)胞傷口圖像,測量細(xì)胞遷移距離并計算劃痕愈合率。

    1.6 Transwell實驗

    Matrigel在冰上融化后按1∶3的比例用無血清培養(yǎng)基進行稀釋,用預(yù)冷的槍頭吸取25μL稀釋的Matrigel加入Transwell小室的上室,37℃靜置30 min,使Matrigel聚合成膠。同時收集各組已轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞胰酶消化后計數(shù),并接種于含Matrigel的Transwell小室上進行侵襲實驗,將細(xì)胞懸液接種于不含Matrigel的Transwell小室上進行遷移實驗,500μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室,24 h后終止培養(yǎng),用PBS將上室的細(xì)胞洗掉,4%多聚甲醛固定15 min,并用0.1%結(jié)晶紫染色。然后在顯微鏡下對細(xì)胞進行拍照并計數(shù)。

    1.7 總RNA提取和qPCR

    采用TRIzol提取細(xì)胞的總RNA,使用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后將2μL cDNA溶液加入qPCR反應(yīng)體系,采用One Step SYBR PrimeScript于ABI 7500 RT-PCR系統(tǒng)進行qPCR。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt表示LINC00909和DACH1的相對表達量。LINC00909上游引物:5'-TGT GCA AGG CGA GAA TGC TA-3',下游引物:5'-AAA CAG GTC ACC AAG CCA CA-3';DACH1上游引物:5'-ATG TGG AAC AAG TTC GCA TCC-3',下游引物:5'-TGC AGT CAT TGT AGA GGG TCT-3';GAPDH上游引物:5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3';下游引物:5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。

    1.8 熒光素酶報告實驗

    采用DIANA Tools程序在線預(yù)測LINC00909和DACH1與miR-194-5p的結(jié)合位點,合成含有miR-194-5p結(jié)合位點的LINC00909和DACH1并克隆至螢光素酶報告載體pmirGLO。采用Lipofectamine 2000將LINC00909或DACH1載體與miR-194-5p模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染,48 h后收集細(xì)胞并使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)測定相對熒光素酶活性。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 21.0版統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。本研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 胰腺癌組織中LINC00909的表達及預(yù)后情況

    通過UALCAN在線分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫的24種腫瘤組織LINC00909表達水平,發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織LINC00909表達水低于正常組織表達(圖1A)。進一步通過LinkedOmics在線分析LINC00909在176例胰腺癌中的表達及預(yù)后情況,發(fā)現(xiàn)LINC00909表達隨胰腺癌病理分級的上升而明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。同時生存分析顯示,LINC00909低表達患者的預(yù)后差,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。與胰腺正常細(xì)胞系HPDE相比,LINC00909在4個胰腺癌細(xì)胞系中均下調(diào)表達(P<0.05)(圖1D)。

    圖1 胰腺癌組織中LINC00909的表達及預(yù)后情況A:LINC00909在24種腫瘤中的表達;B:LINC00909在胰腺癌病理分級中的表達;C:生存曲線;D:細(xì)胞表達譜Figure 1 The expression of LINC00909 and prognosis in pancreatic cancer tissue A:Expressions of LINC00909 in 24 types of tumors;B:Expressions of LINC00909 in pancreatic cancer with different pathological grades;C:Survival curves;D:Cell expression profiles

    2.2 靶向LINC00909的miRNA分析

    通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與LINC00909結(jié)合的miRNA,獲得28個與LINC00909結(jié)合的miRNA,分別是miR-105-5p、miR-122-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p、miR-152-3p、miR-155-5p、miR-194-5p、miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-23c、miR-24-3p、miR-339-3p、miR-448、miR-511-3p、miR-519a-3p、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-552-3p、miR-5586-5p、miR-580-3p、miR-625-5p、miR-6509-5p、miR-7853-5p、miR-874-3p及miR-892c-5p。進一步通過對TCGA胰腺癌miRNA表達數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),只有miR-194-5p在胰腺癌中明顯上調(diào)表達(圖2)。因此提示miR-194-5p可能是LINC00909的潛在靶miRNA。

    圖2 與LINC00909結(jié)合的miRNA在胰腺癌中的表達情況Figure2 Theexpressionsof miRNAbinding to LINC00909 in pancreatic cancer

    2.3 與miR-194-5p結(jié)合的潛在mRNA分析

    通過3個miRNA-mRNA相互作用預(yù)測數(shù)據(jù)庫分析,獲得114個潛在mRNA。進一步通過表達相關(guān)性分析及生存分析,對114個潛在mRNA進行篩選,最終獲得4個mRNA,分別是DACH1、SOCS2、STX16及SNAP91(圖3A)。表達相關(guān)性分析表明,4個基因與LINC00909表達呈明顯正相關(guān)(圖3B)。生存分析結(jié)果表明,4個基因與胰腺癌不良預(yù)后有關(guān),且基因低表達,患者預(yù)后差,與LINC00909預(yù)后結(jié)果一致(圖3C)。最終建了LINC00909-miR-194-5p-DACH1/SOCS2/STX16/SNAP91的ceRNA網(wǎng)絡(luò)(圖3D)。

    圖3 LINC00909 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建A:分析與miR-194-5p結(jié)合的潛在mRNA;B:基因表達相關(guān)性分析;C:生存分析;D:ceRNA網(wǎng)絡(luò)示意圖Figure 3 Construction of LINC00909 ceRNA network A:Prediction of potential target genes of miR-194-5p;B:Gene expression correlation analysis;C:Survival analysis;D:Schematic diagram of ceRNAnetwork

    2.4 下調(diào)LINC00909對PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

    LINC00909低表達組經(jīng)2條si-LINC00909序列轉(zhuǎn)染處理,qPCR結(jié)果顯示,PANC-1細(xì)胞LINC00909低表達組LINC00909的表達水平均降低(P<0.05)(圖4A)。MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,LINC00909低表達組的細(xì)胞增殖活力增加(P<0.05)(圖4B)。劃痕實驗結(jié)果顯示,與陰性對照組(轉(zhuǎn)染si-NC)比較,LINC00909低表達組(轉(zhuǎn)染si-LINC00909-1#或si-LINC00909-2#)的劃痕愈合率高于對照組(P<0.05)(圖4C)。Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,LINC00909低表達組的遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)高于對照組(均P<0.05)(圖4D)。

    圖4 下調(diào)LINC00909對PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響A:各組PANC-1細(xì)胞中LINC00909的表達水平;B:各組PANC-1細(xì)胞的增殖曲線;C:各組PANC-1細(xì)胞的劃痕實驗(×200);D:各組PANC-1細(xì)胞的遷移及侵襲實驗(×200)Figure 4 The effects of down-regulation of LINC00909 on theproliferation,migration,and invasion of PANC-1 cells A:The expression level of LINC00909 in each group PANC-1 cells;B:The proliferation curve of PANC-1 cells in each group;C:Wound scratch assay of PANC-1 cells in each group(×200);D:Migration and invasion assays of PANC-1 cells in each group(×200)

    2.5 LINC00909通過miR-194/DACH1軸抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

    回復(fù)組經(jīng)共轉(zhuǎn)染si-LINC00909-1#和miR-194-5p抑制物序列處理,qPCR結(jié)果顯示,下調(diào)LINC00909后DACH1表達明顯下降,當(dāng)同時下調(diào)LINC00909與miR-194-5p后DACH1表達明顯升高(P<0.05)(圖5A)。MTT結(jié)果顯示,與LINC00909低表達組比較,回復(fù)組細(xì)胞增殖活力降低(P<0.05)(圖5B)。劃痕實驗結(jié)果顯示,與LINC00909低表達組比較,回復(fù)組細(xì)胞劃痕愈合能力降低(P<0.05)(圖5C)。Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,與LINC00909低表達組比較,回復(fù)組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)降低(均P<0.05)(圖5D)。

    圖5 LINC00909通過miR-194-5p/DACH1軸抑制PANC-1細(xì)胞細(xì)胞增殖、遷移及侵襲A:各組PANC-1細(xì)胞DACH1水平;B:各組PANC-1細(xì)胞的增殖曲線;C:各組PANC-1細(xì)胞的劃痕實驗(×200);D:各組PANC-1細(xì)胞的遷移及侵襲實驗(×200)Figure 5 LINC00909 inhibiting PANC-1 cell proliferation,migration,and invasion through miR-194-5p/DACH1 axis A:The expression level of DACH1 in each group PANC-1 cells;B:The proliferation curve of PANC-1 cells in each group;C:Wound scratch assay of PANC-1 cells in each group(×200);D:Migration and invasion assays of PANC-1 cells in each group(×200)

    2.6 miR-194-5p與LINC00909和DACH1的靶向關(guān)系驗證

    預(yù)測分析顯示,LINC00909和DACH1基因都含有miR-194-5p的結(jié)合位點(圖6A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎琺iR-194-5p模擬物能夠抑制含有其結(jié)合位點的LINC00909和DACH1質(zhì)粒的熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6B)。

    圖6 miR-194-5p與LINC00909和DACH1的靶向關(guān)系驗證A:LINC00909和DACH1與預(yù)測的miR-194-5p結(jié)合位點比對及示意圖;B:相對熒光強度Figure 6 Verification of the targeted relationship of miR-194-5p with LINC00909 and DACH1 A:Alignment and schematic diagram of thebinding sitesof predicted miR-194-5p to LINC00909 and DACH1;B:Relativefluorescenceintensity

    3 討論

    在最近的胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn),lncRNA作為癌基因或抑癌基因參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展,可作為miRNA的ceRNA來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性轉(zhuǎn)化過程[15-17]。胰腺癌中一些lncRNA,如THAP9-AS1、PLACT1和LINC00346等已被證明發(fā)揮癌基因的功能[18-21],而一些lncRNA如LINC01111、PXN-AS1和TUSC7等作為腫瘤抑制因子發(fā)揮抑癌基因的功能[22-24]。例如,THAP9-AS1能夠通過miR-484/YAP軸來促進胰腺癌生長[18]。LINC01111在胰腺癌患者中異常低表達,且與患者總生存期呈正相關(guān),并通過miR-3924/DUSP1軸抑制胰腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移[22]。LINC00909已被報道可作為癌基因促進膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌及急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展,但其在胰腺癌中的生物學(xué)功能尚不清楚。

    本研究通過TCGA在線分析發(fā)現(xiàn),LINC00909在胰腺癌組織中低表達,且與胰腺癌的預(yù)后呈正相關(guān)。體外干擾LINC00909表達,檢測其差異表達后PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化,綜合評估LINC00909在胰腺癌進展中的作用。CCK-8實驗結(jié)果顯示,下調(diào)LINC00909表達顯著促進胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖能力;同時劃痕愈合實驗結(jié)果顯示下調(diào)LINC00909表達顯著促進PANC-1細(xì)胞劃痕愈合能力;Transwell實驗結(jié)果顯示下調(diào)LINC00909表達顯著促進PANC-1細(xì)胞遷移及侵襲能力,以上結(jié)果表明LINC00909能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程。本研究證明在胰腺癌中LINC00909發(fā)揮抑癌基因的功能,與已報道的在膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌及急性髓系白血病中的功能相反,在胰腺癌中這種功能的差異可能是由于其調(diào)控下游靶標(biāo)的不同導(dǎo)致的。

    目前研究[25-27]認(rèn)為lncRNA通??赡茏鳛閙iRNA的ceRNA來發(fā)揮生理作用。本研究首先通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建LINC00909-miR-194-5p-DACH1/SOCS2/STX16/SNAP91的ceRNA網(wǎng)絡(luò),并在細(xì)胞學(xué)水平研究了LINC00909-miR-194-5p-DACH1軸的功能。熒光素酶報告實驗證實LINC00909與DACH1都可靶向結(jié)合miR-194-5p。進一步在下調(diào)LINC00909表達的細(xì)胞中抑制miR-194-5p表達,發(fā)現(xiàn)由LINC00909下調(diào)引起的促生長、促遷移及促侵襲作用被明顯抑制。有研究[28-31]已證實,細(xì)胞命運決定因子DACH1是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的黑腹果蠅Dachshund基因同源的基因,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化、黏附等細(xì)胞活動,是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。DACH1在大多數(shù)正常組織中均表達,然而在很多惡性腫瘤如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌中表達降低或缺失,在胰腺癌中miR-194-5p可靶向DACH1并下調(diào)其表達,促進胰腺癌生長[32]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-194-5p可作為LINC00909調(diào)控MUC1-C的“海綿”分子,參與LINC00909在膠質(zhì)瘤中的作用[11]。結(jié)合本研究和先前研究結(jié)果,筆者推測miR-194-5p及其靶基因DACH1構(gòu)成的信號軸可能是LINC00909在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用的機制。

    綜上所述,LINC00909在胰腺癌細(xì)胞中低表達,并通過miR-194-5p/DACH1信號軸來抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,發(fā)揮抑癌作用。該發(fā)現(xiàn)為LINC00909作為潛在的胰腺癌診斷和治療靶點提供部分理論基礎(chǔ)。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    猜你喜歡
    實驗分析
    記一次有趣的實驗
    微型實驗里看“燃燒”
    隱蔽失效適航要求符合性驗證分析
    做個怪怪長實驗
    電力系統(tǒng)不平衡分析
    電子制作(2018年18期)2018-11-14 01:48:24
    電力系統(tǒng)及其自動化發(fā)展趨勢分析
    NO與NO2相互轉(zhuǎn)化實驗的改進
    實踐十號上的19項實驗
    太空探索(2016年5期)2016-07-12 15:17:55
    中西醫(yī)結(jié)合治療抑郁癥100例分析
    在線教育與MOOC的比較分析
    国产三级中文精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产高清激情床上av| 日韩欧美 国产精品| 亚洲人成网站高清观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产激情欧美一区二区| 一级毛片女人18水好多| 国产综合懂色| 色尼玛亚洲综合影院| 日本在线视频免费播放| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产亚洲欧美98| 一进一出抽搐动态| 午夜精品久久久久久毛片777| 久9热在线精品视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一本一本综合久久| 最近在线观看免费完整版| 毛片女人毛片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲国产色片| 精品一区二区三区视频在线 | 国产高潮美女av| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成年人精品一区二区| 午夜a级毛片| ponron亚洲| 国产三级在线视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产亚洲欧美98| 一本久久中文字幕| 精品久久久久久久毛片微露脸| av欧美777| 欧美一区二区精品小视频在线| 超碰成人久久| 日本一本二区三区精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费搜索国产男女视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产精品999在线| 日本黄色视频三级网站网址| 9191精品国产免费久久| 日本三级黄在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产伦人伦偷精品视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 好男人电影高清在线观看| 91九色精品人成在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费大片18禁| 欧美一区二区国产精品久久精品| 性色av乱码一区二区三区2| 美女cb高潮喷水在线观看 | 欧美中文综合在线视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲色图av天堂| 国产高清视频在线播放一区| 搡老岳熟女国产| 日韩三级视频一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲第一电影网av| netflix在线观看网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 免费电影在线观看免费观看| 无遮挡黄片免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 最新在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99热6这里只有精品| 中出人妻视频一区二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人无遮挡网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲电影在线观看av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产黄片美女视频| 久久久久久九九精品二区国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 男人舔奶头视频| 亚洲国产精品合色在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 9191精品国产免费久久| 999精品在线视频| 草草在线视频免费看| 黄色视频,在线免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 99热这里只有精品一区 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 露出奶头的视频| 一本一本综合久久| 亚洲第一电影网av| www日本在线高清视频| 日韩人妻高清精品专区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 成人特级av手机在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 成人亚洲精品av一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 国产高潮美女av| 日韩欧美三级三区| 老鸭窝网址在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 波多野结衣高清无吗| www.999成人在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产熟女xx| 91字幕亚洲| 国产高清视频在线观看网站| 午夜福利在线观看吧| av片东京热男人的天堂| 看黄色毛片网站| 麻豆成人av在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久精品欧美日韩精品| 一进一出抽搐动态| 国产1区2区3区精品| 成年女人看的毛片在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 免费看a级黄色片| 成人三级做爰电影| 久99久视频精品免费| 一进一出抽搐动态| 最新在线观看一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 久久精品91蜜桃| 神马国产精品三级电影在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线a可以看的网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99久久精品热视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲成av人片免费观看| 日韩欧美国产在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲美女视频黄频| 岛国在线免费视频观看| 久久久久国内视频| 国产淫片久久久久久久久 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 男人舔女人下体高潮全视频| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美激情在线99| 午夜精品久久久久久毛片777| 中文在线观看免费www的网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久精品电影| 精品久久久久久久末码| 少妇的丰满在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩欧美 国产精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品综合一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久久精品欧美日韩精品| 99riav亚洲国产免费| 精品一区二区三区视频在线 | 很黄的视频免费| 91麻豆av在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产av不卡久久| 最新在线观看一区二区三区| 欧美大码av| 成人av一区二区三区在线看| 男女视频在线观看网站免费| 在线国产一区二区在线| 在线免费观看的www视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 老司机深夜福利视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 热99re8久久精品国产| 色老头精品视频在线观看| www.999成人在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 日韩免费av在线播放| 欧美在线一区亚洲| 国产亚洲精品av在线| 精品国产美女av久久久久小说| 女警被强在线播放| 手机成人av网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜福利成人在线免费观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 操出白浆在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人18禁在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品爽爽va在线观看网站| www.熟女人妻精品国产| 国产精品久久久久久久电影 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日本在线视频免费播放| 一个人看的www免费观看视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 国产成人欧美在线观看| 在线国产一区二区在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 99国产综合亚洲精品| 欧美丝袜亚洲另类 | 99久久99久久久精品蜜桃| 天堂影院成人在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久九九精品影院| 男女那种视频在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一级黄色大片毛片| 免费电影在线观看免费观看| 国模一区二区三区四区视频 | 色在线成人网| 婷婷精品国产亚洲av在线| 90打野战视频偷拍视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲av成人一区二区三| www日本黄色视频网| 黄片大片在线免费观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 色在线成人网| 一本久久中文字幕| 欧美日本视频| 1024香蕉在线观看| 国产美女午夜福利| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久久成人免费电影| 嫩草影院入口| 国产成人欧美在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美成狂野欧美在线观看| 一级毛片高清免费大全| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 高清毛片免费观看视频网站| 波多野结衣巨乳人妻| 五月伊人婷婷丁香| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产伦人伦偷精品视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 天堂√8在线中文| 色视频www国产| 亚洲欧美日韩东京热| 国产免费av片在线观看野外av| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲自拍偷在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 中文字幕久久专区| 亚洲 国产 在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 小说图片视频综合网站| 国产私拍福利视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 国产视频内射| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线免费观看的www视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 怎么达到女性高潮| 色老头精品视频在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 真实男女啪啪啪动态图| 老司机深夜福利视频在线观看| 国内精品美女久久久久久| 一级a爱片免费观看的视频| 九九热线精品视视频播放| 丁香欧美五月| 国产野战对白在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产高清视频在线观看网站| 久久久色成人| 99精品在免费线老司机午夜| 国产三级中文精品| 亚洲av美国av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩人妻高清精品专区| 香蕉丝袜av| xxx96com| 看片在线看免费视频| 成人18禁在线播放| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产一区二区三区视频了| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产aⅴ精品一区二区三区波| www.自偷自拍.com| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产欧美日韩一区二区三| 精品无人区乱码1区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲成人免费电影在线观看| 九九热线精品视视频播放| svipshipincom国产片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线国产一区二区在线| 18禁国产床啪视频网站| 少妇的丰满在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲第一电影网av| 在线视频色国产色| 午夜激情欧美在线| 久久香蕉精品热| 性色av乱码一区二区三区2| 免费观看精品视频网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲成人久久爱视频| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 黄色成人免费大全| 国产三级黄色录像| 国产成人啪精品午夜网站| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲国产精品成人综合色| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 香蕉国产在线看| 搡老熟女国产l中国老女人| av国产免费在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 国产熟女xx| 色吧在线观看| 国产美女午夜福利| 特级一级黄色大片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 最近在线观看免费完整版| 免费看光身美女| av天堂在线播放| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品av视频在线免费观看| 国产真实乱freesex| 曰老女人黄片| 九九热线精品视视频播放| 99久久成人亚洲精品观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 禁无遮挡网站| 亚洲国产精品合色在线| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产一区二区三区视频了| 午夜亚洲福利在线播放| 少妇的逼水好多| 国产高清激情床上av| 美女高潮的动态| 三级国产精品欧美在线观看 | 免费看日本二区| 此物有八面人人有两片| 男插女下体视频免费在线播放| h日本视频在线播放| 欧美成人性av电影在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日日夜夜操网爽| 国产精品免费一区二区三区在线| 很黄的视频免费| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 草草在线视频免费看| 少妇的丰满在线观看| 999久久久国产精品视频| 精品久久久久久久末码| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 色av中文字幕| www.自偷自拍.com| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲欧美激情综合另类| 久久精品人妻少妇| 成人性生交大片免费视频hd| 成人特级黄色片久久久久久久| 18禁美女被吸乳视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 观看免费一级毛片| 热99在线观看视频| 免费看日本二区| 精品人妻1区二区| 精品欧美国产一区二区三| 黑人操中国人逼视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 宅男免费午夜| www.精华液| 免费看a级黄色片| av女优亚洲男人天堂 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 日本 av在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲 国产 在线| 精品一区二区三区视频在线 | 久久精品人妻少妇| 两性夫妻黄色片| 黄色成人免费大全| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 无遮挡黄片免费观看| 日本a在线网址| 舔av片在线| 又爽又黄无遮挡网站| netflix在线观看网站| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 国产精品永久免费网站| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品99久久久久久久久| 国产不卡一卡二| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲男人的天堂狠狠| 我的老师免费观看完整版| 久久久水蜜桃国产精品网| 男人的好看免费观看在线视频| 99久久精品国产亚洲精品| 美女cb高潮喷水在线观看 | 亚洲欧美日韩东京热| 国产真人三级小视频在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99热精品在线国产| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 成年人黄色毛片网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产av在哪里看| 俄罗斯特黄特色一大片| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲成人久久性| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 少妇的逼水好多| 国产高清视频在线观看网站| 天堂影院成人在线观看| 草草在线视频免费看| 人妻久久中文字幕网| 午夜福利18| 熟女人妻精品中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看 | 午夜两性在线视频| 中亚洲国语对白在线视频| 婷婷亚洲欧美| 亚洲av第一区精品v没综合| 又黄又粗又硬又大视频| 一个人免费在线观看电影 | 日本免费a在线| 欧美日本视频| 国产三级黄色录像| 午夜免费观看网址| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久久久久久黄片| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av成人av| 一级毛片高清免费大全| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 一级毛片精品| 九九热线精品视视频播放| 91在线观看av| 国产精品女同一区二区软件 | 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 色老头精品视频在线观看| 日本a在线网址| 亚洲熟妇熟女久久| av天堂中文字幕网| 天天躁日日操中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 岛国在线免费视频观看| 国产精品国产高清国产av| 黄频高清免费视频| 国产熟女xx| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热精品在线国产| 99在线人妻在线中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看| 97超视频在线观看视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美大码av| 在线免费观看的www视频| 观看免费一级毛片| 深夜精品福利| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久中文看片网| 91老司机精品| АⅤ资源中文在线天堂| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久香蕉国产精品| 成人精品一区二区免费| 精品久久久久久久毛片微露脸| 看黄色毛片网站| 我要搜黄色片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久香蕉国产精品| 亚洲五月天丁香| 一级黄色大片毛片| 桃红色精品国产亚洲av| 熟女电影av网| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 18禁美女被吸乳视频| 国产亚洲欧美98| 91av网一区二区| 老司机福利观看| 宅男免费午夜| 99热精品在线国产| av在线天堂中文字幕| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品亚洲一级av第二区| av女优亚洲男人天堂 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品不卡国产一区二区三区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产爱豆传媒在线观看| av片东京热男人的天堂| 色噜噜av男人的天堂激情| 观看免费一级毛片| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 两个人视频免费观看高清| 一个人看的www免费观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲熟女毛片儿| 毛片女人毛片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日韩欧美精品v在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品一及| 日日夜夜操网爽| or卡值多少钱| 特级一级黄色大片| 中亚洲国语对白在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 两个人的视频大全免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费观看精品视频网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲av熟女| 日本成人三级电影网站| 久久午夜亚洲精品久久| 黄色 视频免费看| 色视频www国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 真实男女啪啪啪动态图| 色综合站精品国产| www日本在线高清视频| 国产成人影院久久av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美午夜高清在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产高清视频在线观看网站| 窝窝影院91人妻| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99国产精品一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 1024手机看黄色片| 99国产极品粉嫩在线观看|