長鏈非編碼RNA 909靶向調(diào)控miR-194-5p/DACH1軸對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

鄧家琦，錢保林，張麗云，李明星

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1.超聲醫(yī)學(xué)科2.肝膽外科3.健康管理部，四川瀘州646000）

胰腺癌是一種惡性程度很高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其主要病理類型為胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD），病死率居我國惡性腫瘤第5位，預(yù)后較差，患者生存率低[1-2]。近年來，該病的發(fā)病率及病死率均呈逐年上升的趨勢，給人民的健康安全造成嚴(yán)重威脅[3]。目前還沒有很好的胰腺癌早期診斷手段，外科手術(shù)切除是胰腺癌最有效的治療手段，但因術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，其5年生存率仍低于20%[4]。因此，尋找有效的胰腺癌早期診斷和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度＞200個(gè)核苷酸長度的RNA片段，其缺乏開放閱讀框架，不具備編碼蛋白的能力，參與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控，在機(jī)體的正常發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5-7]。lncRNA可作為一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）吸附微小RNA（microRNA，miRNA），參與靶基因的表達(dá)調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[8-10]。長鏈非編碼RNA 909（LINC00909）是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的長度約為2 kb的lncRNA，位于18號染色體q22.3上，在膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌和白血病中被報(bào)道發(fā)揮癌基因的作用[11-14]。然而，關(guān)于LINC00909在胰腺癌中的作用鮮有報(bào)道，因此本研究從LINC00909作為ceRNA發(fā)揮生物學(xué)功能這一角度出發(fā)，通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建LINC00909 ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00909對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，為進(jìn)一步研究LINC00909在胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制、診斷及預(yù)后提供了新的線索和思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

胰腺正常細(xì)胞系HPDE及SW1990細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物公司，PANC-1、BXPC3及ASPC1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞研究所。針對LINC00909的小干擾RNA片段（si-LINC00909-1#，si-LINC00909-2#）、miR-194-5p模擬物（mimics）、miR-194-5p抑制物（inhibitor）和陰性對照（NC）購自上海吉瑪生物科技有限公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，青霉素和鏈霉素購自美國Sigma公司，活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自碧云天生物科技公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）試劑盒One Step SYBR PrimeScript購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 表達(dá)及預(yù)后分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理胰腺癌轉(zhuǎn)錄組的miRNA及mRNA/lncRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。利用R語言limma包對癌旁和癌組織的miRNA進(jìn)行表達(dá)差異對比分析。利用R語言“survival”包、“survminer”包及“ggstatsplot”包，對所得到的基因進(jìn)行生存分析，分析其與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。利用lncRNA-miRNA結(jié)合數(shù)據(jù)庫（starBase）及3個(gè)miRNA-mRNA結(jié)合數(shù)據(jù)庫（miRmap、miRanda和TargetScan），預(yù)測LINC00909的靶miRNA以及靶miRNA下游的mRNA，并構(gòu)建LINC00909-miRNAmRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇PANC-1及SW1990細(xì)胞于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，復(fù)蘇HPDE、BXPC3及ASPC1細(xì)胞于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。按照1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)約50%～60%時(shí)，采用脂質(zhì)體向PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-LINC00909、miR-194-5p mimics、miR-194-5p inhibitor及NC。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

按照5×103個(gè)/孔的密度將各組細(xì)胞接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h加入10μL CCK-8溶液，恒溫培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度，以空白孔為參照，評估細(xì)胞的增殖情況。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)后形成單層，用200μL無菌移液器槍頭在單層細(xì)胞中央劃出一條直線，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在劃痕0、24 h后用顯微鏡拍攝細(xì)胞傷口圖像，測量細(xì)胞遷移距離并計(jì)算劃痕愈合率。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

Matrigel在冰上融化后按1∶3的比例用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，用預(yù)冷的槍頭吸取25μL稀釋的Matrigel加入Transwell小室的上室，37℃靜置30 min，使Matrigel聚合成膠。同時(shí)收集各組已轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，并接種于含Matrigel的Transwell小室上進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞懸液接種于不含Matrigel的Transwell小室上進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，500μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室，24 h后終止培養(yǎng)，用PBS將上室的細(xì)胞洗掉，4%多聚甲醛固定15 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色。然后在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.7 總RNA提取和qPCR

采用TRIzol提取細(xì)胞的總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后將2μL cDNA溶液加入qPCR反應(yīng)體系，采用One Step SYBR PrimeScript于ABI 7500 RT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行qPCR。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示LINC00909和DACH1的相對表達(dá)量。LINC00909上游引物：5'-TGT GCA AGG CGA GAA TGC TA-3'，下游引物：5'-AAA CAG GTC ACC AAG CCA CA-3'；DACH1上游引物：5'-ATG TGG AAC AAG TTC GCA TCC-3'，下游引物：5'-TGC AGT CAT TGT AGA GGG TCT-3'；GAPDH上游引物：5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'；下游引物：5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。

1.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

采用DIANA Tools程序在線預(yù)測LINC00909和DACH1與miR-194-5p的結(jié)合位點(diǎn)，合成含有miR-194-5p結(jié)合位點(diǎn)的LINC00909和DACH1并克隆至螢光素酶報(bào)告載體pmirGLO。采用Lipofectamine 2000將LINC00909或DACH1載體與miR-194-5p模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞并使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)測定相對熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織中LINC00909的表達(dá)及預(yù)后情況

通過UALCAN在線分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫的24種腫瘤組織LINC00909表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織LINC00909表達(dá)水低于正常組織表達(dá)（圖1A）。進(jìn)一步通過LinkedOmics在線分析LINC00909在176例胰腺癌中的表達(dá)及預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)LINC00909表達(dá)隨胰腺癌病理分級的上升而明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B）。同時(shí)生存分析顯示，LINC00909低表達(dá)患者的預(yù)后差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1C）。與胰腺正常細(xì)胞系HPDE相比，LINC00909在4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系中均下調(diào)表達(dá)（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 胰腺癌組織中LINC00909的表達(dá)及預(yù)后情況A：LINC00909在24種腫瘤中的表達(dá)；B：LINC00909在胰腺癌病理分級中的表達(dá)；C：生存曲線；D：細(xì)胞表達(dá)譜Figure 1 The expression of LINC00909 and prognosis in pancreatic cancer tissue A:Expressions of LINC00909 in 24 types of tumors;B:Expressions of LINC00909 in pancreatic cancer with different pathological grades;C:Survival curves;D:Cell expression profiles

2.2 靶向LINC00909的miRNA分析

通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與LINC00909結(jié)合的miRNA，獲得28個(gè)與LINC00909結(jié)合的miRNA，分別是miR-105-5p、miR-122-5p、miR-130a-5p、miR-135a-5p、miR-135b-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p、miR-152-3p、miR-155-5p、miR-194-5p、miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-23c、miR-24-3p、miR-339-3p、miR-448、miR-511-3p、miR-519a-3p、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-552-3p、miR-5586-5p、miR-580-3p、miR-625-5p、miR-6509-5p、miR-7853-5p、miR-874-3p及miR-892c-5p。進(jìn)一步通過對TCGA胰腺癌miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，只有miR-194-5p在胰腺癌中明顯上調(diào)表達(dá)（圖2）。因此提示miR-194-5p可能是LINC00909的潛在靶miRNA。

圖2 與LINC00909結(jié)合的miRNA在胰腺癌中的表達(dá)情況Figure2 Theexpressionsof miRNAbinding to LINC00909 in pancreatic cancer

2.3 與miR-194-5p結(jié)合的潛在mRNA分析

通過3個(gè)miRNA-mRNA相互作用預(yù)測數(shù)據(jù)庫分析，獲得114個(gè)潛在mRNA。進(jìn)一步通過表達(dá)相關(guān)性分析及生存分析，對114個(gè)潛在mRNA進(jìn)行篩選，最終獲得4個(gè)mRNA，分別是DACH1、SOCS2、STX16及SNAP91（圖3A）。表達(dá)相關(guān)性分析表明，4個(gè)基因與LINC00909表達(dá)呈明顯正相關(guān)（圖3B）。生存分析結(jié)果表明，4個(gè)基因與胰腺癌不良預(yù)后有關(guān)，且基因低表達(dá)，患者預(yù)后差，與LINC00909預(yù)后結(jié)果一致（圖3C）。最終建了LINC00909-miR-194-5p-DACH1/SOCS2/STX16/SNAP91的ceRNA網(wǎng)絡(luò)（圖3D）。

圖3 LINC00909 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建A：分析與miR-194-5p結(jié)合的潛在mRNA；B：基因表達(dá)相關(guān)性分析；C：生存分析；D：ceRNA網(wǎng)絡(luò)示意圖Figure 3 Construction of LINC00909 ceRNA network A:Prediction of potential target genes of miR-194-5p;B:Gene expression correlation analysis;C:Survival analysis;D:Schematic diagram of ceRNAnetwork

2.4 下調(diào)LINC00909對PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

LINC00909低表達(dá)組經(jīng)2條si-LINC00909序列轉(zhuǎn)染處理，qPCR結(jié)果顯示，PANC-1細(xì)胞LINC00909低表達(dá)組LINC00909的表達(dá)水平均降低（P＜0.05）（圖4A）。MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，LINC00909低表達(dá)組的細(xì)胞增殖活力增加（P＜0.05）（圖4B）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組（轉(zhuǎn)染si-NC）比較，LINC00909低表達(dá)組（轉(zhuǎn)染si-LINC00909-1#或si-LINC00909-2#）的劃痕愈合率高于對照組（P＜0.05）（圖4C）。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，LINC00909低表達(dá)組的遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)高于對照組（均P＜0.05）（圖4D）。

圖4 下調(diào)LINC00909對PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響A：各組PANC-1細(xì)胞中LINC00909的表達(dá)水平；B：各組PANC-1細(xì)胞的增殖曲線；C：各組PANC-1細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)（×200）；D：各組PANC-1細(xì)胞的遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)（×200）Figure 4 The effects of down-regulation of LINC00909 on theproliferation,migration,and invasion of PANC-1 cells A:The expression level of LINC00909 in each group PANC-1 cells;B:The proliferation curve of PANC-1 cells in each group;C:Wound scratch assay of PANC-1 cells in each group(×200);D:Migration and invasion assays of PANC-1 cells in each group(×200)

2.5 LINC00909通過miR-194/DACH1軸抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

回復(fù)組經(jīng)共轉(zhuǎn)染si-LINC00909-1#和miR-194-5p抑制物序列處理，qPCR結(jié)果顯示，下調(diào)LINC00909后DACH1表達(dá)明顯下降，當(dāng)同時(shí)下調(diào)LINC00909與miR-194-5p后DACH1表達(dá)明顯升高（P＜0.05）（圖5A）。MTT結(jié)果顯示，與LINC00909低表達(dá)組比較，回復(fù)組細(xì)胞增殖活力降低（P＜0.05）（圖5B）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LINC00909低表達(dá)組比較，回復(fù)組細(xì)胞劃痕愈合能力降低（P＜0.05）（圖5C）。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LINC00909低表達(dá)組比較，回復(fù)組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)降低（均P＜0.05）（圖5D）。

圖5 LINC00909通過miR-194-5p/DACH1軸抑制PANC-1細(xì)胞細(xì)胞增殖、遷移及侵襲A：各組PANC-1細(xì)胞DACH1水平；B：各組PANC-1細(xì)胞的增殖曲線；C：各組PANC-1細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)（×200）；D：各組PANC-1細(xì)胞的遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)（×200）Figure 5 LINC00909 inhibiting PANC-1 cell proliferation,migration,and invasion through miR-194-5p/DACH1 axis A:The expression level of DACH1 in each group PANC-1 cells;B:The proliferation curve of PANC-1 cells in each group;C:Wound scratch assay of PANC-1 cells in each group(×200);D:Migration and invasion assays of PANC-1 cells in each group(×200)

2.6 miR-194-5p與LINC00909和DACH1的靶向關(guān)系驗(yàn)證

預(yù)測分析顯示，LINC00909和DACH1基因都含有miR-194-5p的結(jié)合位點(diǎn)（圖6A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，miR-194-5p模擬物能夠抑制含有其結(jié)合位點(diǎn)的LINC00909和DACH1質(zhì)粒的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6B）。

圖6 miR-194-5p與LINC00909和DACH1的靶向關(guān)系驗(yàn)證A：LINC00909和DACH1與預(yù)測的miR-194-5p結(jié)合位點(diǎn)比對及示意圖；B：相對熒光強(qiáng)度Figure 6 Verification of the targeted relationship of miR-194-5p with LINC00909 and DACH1 A:Alignment and schematic diagram of thebinding sitesof predicted miR-194-5p to LINC00909 and DACH1;B:Relativefluorescenceintensity

3 討論

在最近的胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA作為癌基因或抑癌基因參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為miRNA的ceRNA來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性轉(zhuǎn)化過程[15-17]。胰腺癌中一些lncRNA，如THAP9-AS1、PLACT1和LINC00346等已被證明發(fā)揮癌基因的功能[18-21]，而一些lncRNA如LINC01111、PXN-AS1和TUSC7等作為腫瘤抑制因子發(fā)揮抑癌基因的功能[22-24]。例如，THAP9-AS1能夠通過miR-484/YAP軸來促進(jìn)胰腺癌生長[18]。LINC01111在胰腺癌患者中異常低表達(dá)，且與患者總生存期呈正相關(guān)，并通過miR-3924/DUSP1軸抑制胰腺癌的增殖與轉(zhuǎn)移[22]。LINC00909已被報(bào)道可作為癌基因促進(jìn)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌及急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展，但其在胰腺癌中的生物學(xué)功能尚不清楚。

本研究通過TCGA在線分析發(fā)現(xiàn)，LINC00909在胰腺癌組織中低表達(dá)，且與胰腺癌的預(yù)后呈正相關(guān)。體外干擾LINC00909表達(dá)，檢測其差異表達(dá)后PANC-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化，綜合評估LINC00909在胰腺癌進(jìn)展中的作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)LINC00909表達(dá)顯著促進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖能力；同時(shí)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)LINC00909表達(dá)顯著促進(jìn)PANC-1細(xì)胞劃痕愈合能力；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)LINC00909表達(dá)顯著促進(jìn)PANC-1細(xì)胞遷移及侵襲能力，以上結(jié)果表明LINC00909能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程。本研究證明在胰腺癌中LINC00909發(fā)揮抑癌基因的功能，與已報(bào)道的在膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌及急性髓系白血病中的功能相反，在胰腺癌中這種功能的差異可能是由于其調(diào)控下游靶標(biāo)的不同導(dǎo)致的。

目前研究[25-27]認(rèn)為lncRNA通?？赡茏鳛閙iRNA的ceRNA來發(fā)揮生理作用。本研究首先通過生物信息學(xué)分析構(gòu)建LINC00909-miR-194-5p-DACH1/SOCS2/STX16/SNAP91的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并在細(xì)胞學(xué)水平研究了LINC00909-miR-194-5p-DACH1軸的功能。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC00909與DACH1都可靶向結(jié)合miR-194-5p。進(jìn)一步在下調(diào)LINC00909表達(dá)的細(xì)胞中抑制miR-194-5p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)由LINC00909下調(diào)引起的促生長、促遷移及促侵襲作用被明顯抑制。有研究[28-31]已證實(shí)，細(xì)胞命運(yùn)決定因子DACH1是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的黑腹果蠅Dachshund基因同源的基因，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化、黏附等細(xì)胞活動(dòng)，是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。DACH1在大多數(shù)正常組織中均表達(dá)，然而在很多惡性腫瘤如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)降低或缺失，在胰腺癌中miR-194-5p可靶向DACH1并下調(diào)其表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌生長[32]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-194-5p可作為LINC00909調(diào)控MUC1-C的“海綿”分子，參與LINC00909在膠質(zhì)瘤中的作用[11]。結(jié)合本研究和先前研究結(jié)果，筆者推測miR-194-5p及其靶基因DACH1構(gòu)成的信號軸可能是LINC00909在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制。

綜上所述，LINC00909在胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，并通過miR-194-5p/DACH1信號軸來抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，發(fā)揮抑癌作用。該發(fā)現(xiàn)為LINC00909作為潛在的胰腺癌診斷和治療靶點(diǎn)提供部分理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。