基于JAK/STAT信號(hào)通路探討夏枯草提取物對(duì)間變性大細(xì)胞淋巴瘤的作用及機(jī)制研究

李偉明， 薛偉麗， 付曉瑞， 孫振昌， 張明智

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450006，2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 410105

間變性大細(xì)胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是非霍奇金淋巴瘤的一種，約占10%，男女發(fā)病率大約為6∶1，青年人居多，2/3以上的患者明確診斷時(shí)病情已經(jīng)處于Ⅲ期或Ⅳ期。ALCL屬于中度惡性的淋巴瘤，五年生存率不到40%，目前治療主要是化療、放療、靶向藥物治療、造血干細(xì)胞移植，但臨床緩解后，仍有一些病人出現(xiàn)耐藥和復(fù)發(fā)，因此迫切需要找到新的有效治療藥物。在核仁磷酸蛋白-間變性淋巴瘤激酶（nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase，NPM-ALK）調(diào)節(jié)的ALCL中（anaplastic large T-cell lymphoma，ALCL），50%存在 NPM-ALK 伴隨 p-JAK3和p-STAT3的異常升高，其原因在于染色體t（2；5）（p23；q35）易位，使得融合蛋白NPM-ALK高表達(dá)，作為激酶的NPM-ALK可分別與JAK3及STAT3形成復(fù)合體，并直接促進(jìn)其磷酸化，調(diào)控下游靶基因BCL-xL表達(dá)增加，發(fā)揮抗凋亡作用，從而介導(dǎo)了ALCL的發(fā)生發(fā)展。

夏枯草是臨床常用的傳統(tǒng)中草藥，功效為清火明目，能夠治療淋巴結(jié)腫大、目赤腫痛、頭痛等疾病。根據(jù)歷代本草文獻(xiàn)記載，夏枯草的藥性可以總結(jié)為性寒，味苦、辛，無毒，可入肝經(jīng)。功效多體現(xiàn)在清熱平肝、散結(jié)止痛、透疹消瘡、袪濕除痹等方面，可用于治療肝火上炎所致的頭痛、目痛、瘰疬、瘡瘍等熱證[1]。中醫(yī)學(xué)中并無“淋巴瘤”病名的記載，根據(jù)淋巴瘤的癥狀及病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，屬于中醫(yī)“痰核”“瘰疬”等疾病的范疇，目前研究發(fā)現(xiàn)夏枯草對(duì)甲狀腺癌、淋巴瘤等具有抗腫瘤作用[2]，李仝認(rèn)為淋巴瘤病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，標(biāo)實(shí)則為痰濕瘀毒，治療應(yīng)選用夏枯草、半夏等化痰散結(jié)的藥物[3]，楊淑蓮善用溫陽藥和散結(jié)藥聯(lián)用，認(rèn)為夏枯草散結(jié)可治療淋巴瘤[4]。夏枯草（學(xué)名：Prunella vulgaris L），包含三萜類化合物、甾醇類化合物、黃酮類化合物等主要成分[5]，崔體圣等[6]發(fā)現(xiàn)乙醇提取所獲得的有效成分濃度最高，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取的方法，對(duì)夏枯草的有效成分開展研究。筆者所在課題組已經(jīng)獲得夏枯草提取方法的專利，并研究了夏枯草提取物對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株Karpas299細(xì)胞的作用情況，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

人間變性大細(xì)胞T淋巴瘤細(xì)胞株Karpas299細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c雄性裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證：SCXK（京）2016-0008。于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)單位許可證編號(hào)：SYXK（豫）2016-0002。

1.3 藥物與試劑

夏枯草購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中草藥房，產(chǎn)自河南省確山縣中藥種植基地，并經(jīng)過鄭州大學(xué)藥學(xué)院乙醇提取，所用夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L的干燥果穗；1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司C11875500BT）；胎牛血清（廣州素譜110520）；CCK8試劑盒；細(xì)胞凋亡試劑盒（江陰齊氏7-8402-A）；細(xì)胞蛋白提取試劑盒（北京艾美捷OP-0003-100）；WB試劑盒（北京百奧萊博WE0297）；Bcl-2一抗（ABCAM公司抗體ab31163）；Bax一抗（ABCAM公司抗體ab31148）；二抗（北京金杉中橋公司）；DAB顯色試劑盒（北京金杉中橋公司）。

1.4 主要儀器

超凈工作臺(tái)（EN1822型，美國Thermo scientific公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma310型，美國Thermo scientific公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countess3型，美國bio-rad公司）；紫外分光光度儀（754N型，中國北京普析）；流式細(xì)胞儀（Attune NxT型，美國Thermo scientific公司）；電泳儀（DYY6C型，中國北京六一）；凝膠成像分析系統(tǒng)（tocan360型，美國Thermo scientific公司）；中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)V2.5（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究生）。

2 方法

2.1 淋巴瘤方藥中夏枯草實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

本研究共選取2011年1月至2021年6月在河南中醫(yī)藥大學(xué)三附院門診和住院的淋巴瘤患者，參照中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)淋巴瘤診療指南（2021）。

2.2 夏枯草乙醇提取

將夏枯草用95%乙醇浸泡于提取器內(nèi)1周，過濾，加熱，旋蒸，將所得提取液濃縮至干浸膏，用氯仿對(duì)所得浸膏進(jìn)行萃取，分別收集有機(jī)相和水相，濃縮至干取有機(jī)相，用氯仿、甲醇、水進(jìn)行溶解，待靜置后，分出上層，將上層溶液濃縮至干取上層殘留物加流動(dòng)相溶解，進(jìn)行反相柱層析，洗脫，收集一甲醇洗脫液，將各個(gè)相的洗脫液濃縮至干，即得夏枯草有效部位。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

胎牛血清和RPM1640培養(yǎng)基按照1∶9的比例，均勻混合，37.0℃，5% CO2條件下，將細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)液放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長周期的時(shí)候開始實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞增殖

將細(xì)胞濃度稀釋至2.0×105/ml，然后接種到細(xì)胞培養(yǎng)96孔板，然后將夏枯草提取物按照等比數(shù)列分別加入到Karpas299細(xì)胞培養(yǎng)液中，篩選藥物濃度，最終選擇夏枯草提取物濃度分別為100 ug/ml、50 ug/ml、25 ug/ml、12.5 ug/ml、6.25 ug/ml（藥物濃度計(jì)算參照夏枯草乙醇提取物干燥后重量），分別作用24 h、48 h、72 h。然后加入CCK8試劑，在紫外分光光度儀上進(jìn)行OD值檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞抑制率和IC50值。

2.5 細(xì)胞凋亡

Karpas299細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長周期時(shí)，將細(xì)胞濃度稀釋至2.0×105/ml，根據(jù)IC50值加入相應(yīng)濃度的夏枯草提取物，培養(yǎng)最佳作用時(shí)間，然后加入細(xì)胞凋亡試劑盒，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

2.6 Western blot檢測(cè)Karpas299細(xì)胞中p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

Karpas299細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長周期時(shí)，將細(xì)胞濃度稀釋至2.0×105/ml，根據(jù)IC50值加入相應(yīng)濃度的夏枯草提取物，培養(yǎng)48 h，加入細(xì)胞蛋白提取試劑，提取蛋白后進(jìn)行電泳，經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)圖像處理與分析軟件，可以用來進(jìn)行半定量分析。

2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選用BALB/c雄性裸鼠構(gòu)造間變性大細(xì)胞淋巴瘤動(dòng)物模型，當(dāng)Karpas299細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長周期時(shí)，收集細(xì)胞，用生理鹽水配制成單細(xì)胞懸液，濃度為l.0×107/ml，接種在BALB/c雄性裸鼠的右腋下，當(dāng)瘤組織生長到直徑約0.5 cm時(shí)，開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，首先根據(jù)裸鼠半數(shù)致死量確定夏枯草提取物的藥物劑量是1000 mg/kg/d，采用等比濃度差設(shè)置濃度梯度，進(jìn)而選擇出200 mg/kg/d的最佳有效濃度。然后用藥對(duì)比觀察，采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化的分組，分為空白組、夏枯草提取物組（200 mg/kg/d、d1-8）、長春新堿組（100 mg/kg/d、d1），生理鹽水、夏枯草提取物和長春新堿均采用腹腔注射，每組12只，并給藥觀察。用藥2周后處死裸鼠，檢測(cè)瘤組織p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 夏枯草是治療淋巴瘤的核心藥物

本研究共入組淋巴瘤患者108例，共525診次。運(yùn)用頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析后，共有183味藥物，總頻次為7281次，其中平均每份處方含有藥物15.2味，出現(xiàn)頻次大于50次的藥物設(shè)為常用藥物，依次為甘草、白術(shù)、黨參、黃芪、柴胡、夏枯草、貓爪草、郁金等，夏枯草出現(xiàn)頻次331次，頻率3.64%，見表1。

表1 常用藥物頻數(shù)分布表Table1 Frequency distribution table of commonly used drugs

3.2 夏枯草提取物對(duì)Karpas299細(xì)胞具有抑制作用

與空白對(duì)照組相比，不同濃度的夏枯草提取物均具有抑制細(xì)胞增殖的作用，且呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。經(jīng)過比較細(xì)胞生長抑制率，發(fā)現(xiàn)夏枯草提取物對(duì)Karpas 299細(xì)胞作用48h的生長抑制率最明顯，不同濃度的夏枯草提取物細(xì)胞生長抑制率分別為（81.2±2.73）%、（62.35±1.89）%、（44.38±1.61）%、（29.56±1.04）%、（7.45±0.96）%。其IC50值為（33.2± 1.8）ug/ml，見表2和圖1至圖3。

表2 不同濃度夏枯草提取物對(duì)karpas299細(xì)胞處理24 h、48 h、72 h的增殖抑制作用Table 2 Effect of the extract from Prunella vulgaris L on Karpas299 Cells for 24 h、48 h、72 h

圖1 karpas 299細(xì)胞（×40）Figure 1 karpas 299 Cells（×40）

圖2 karpas 299細(xì)胞（×10）Figure 2 karpas 299 Cells（×10）

圖3 各組karpas 299細(xì)胞的凋亡率Figure 3 Apoptosis rate of karpas 299 cells of all groups

3.3 夏枯草提取物對(duì)Karpas299細(xì)胞具有促凋亡作用

將終濃度為33.2 μg/ml的夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞48 h，與空白對(duì)照組相比，夏枯草提取物組的細(xì)胞凋亡率為（38.9±2.95）%，長春新堿組的karpas299細(xì)胞凋亡率為（42.8±3.71）%。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示各給藥組均可誘導(dǎo)Karpas299細(xì)胞的凋亡，P＜0.01（P=0.0093，P=0.0064），見圖3和圖4。

圖4 不同組別karpas 299細(xì)胞的凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of karpas 299 cells of different groups

3.4 夏枯草提取物對(duì)Karpas299細(xì)胞p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

將終濃度為33.2 μg/ml的夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞48 h，與空白對(duì)照組相比，夏枯草提取物組和長春新堿組的p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)下降，P＜0.05或0.01（P=0.025 6、P=0.021 1；P=0.037 3、P=0.010 6；P=0.034 9、P=0.008 7），Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，P＜0.05（P=0.020 6、P=0.025 1），見圖5至圖9。

圖5 不同組別細(xì)胞p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2 and Bax proteins in different groups

圖6 不同組別細(xì)胞p-JAK3蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 6 Semi-quantitative analysis of expression of p-JAK3 protein in different groups

圖7 不同組別細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 7 Semi-quantitative analysis of expression of p-STAT3 protein in different groups

圖8 不同組別細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 8 Semi-quantitative analysis of expression of Bcl-2 protein in different groups

圖9 不同組別細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 9 Semi-quantitative analysis of expression of Bax protein in different groups

3.5 夏枯草提取物對(duì)間變性大細(xì)胞淋巴瘤瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

各組裸鼠成瘤后，各組隨時(shí)間的延長，瘤體積逐漸增大，空白對(duì)照組瘤體積變化最大，各用藥組瘤體積不同程度縮小。與空白對(duì)照組相比，其中夏枯草提取物組、長春新堿組瘤組織體積增大明顯減少，P＜0.01（P=0.009 4，P=0.009 1），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3和圖10、圖11。

表3 各組BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)前后的變化（±s）

表3 各組BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)前后的變化（±s）

注：瘤重與空白對(duì)照組相比，①P＜0.01；瘤體積與空白對(duì)照組相比，②P＜0.01

組別空白對(duì)照組夏枯草提取物組長春新堿組鼠存活數(shù)（只）1 0抑瘤率（%）3 7.5 3 5.9 9 9體重（g）給藥前1 9.0±0.9 1 8.7±0.8 1 9.2±1.1給藥后3 2.7±1.8 2 6.3±1.6 2 3.1±1.5瘤重（g）1.5 7 1±0.1 5 6 0.9 0 6±0.0 8 1①0.8 6 7±0.0 7 3①瘤體積（m m 3）給藥前2 0 9±2 1 2 1 4±2 0 2 0 6±1 5給藥后1 9 3 9±1 5 6 9 8 0±1 4 4②9 9 4±1 9 3②

圖10 各組裸鼠瘤體積隨著時(shí)間的變化而變化

圖11 各組成瘤裸鼠和瘤組織Figure 11 Tumor nude mice and tumor tissue

給藥后，與空白對(duì)照組相比，夏枯草提取物組和長春新堿組的p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2蛋白均出現(xiàn)不同程度的降低，P＜0.05（P=0.017 6、P=0.019 4；P=0.020 7、P=0.015 2；P=0.032 5、P=0.018 1），夏枯草提取物組和長春新堿組的Bax蛋白表達(dá)出現(xiàn)不同程度的升高，P＜0.05（P=0.020 5、P=0.034 2），見圖12至圖16。

圖12 不同組別瘤組織p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)Figure 12 Expression of p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2 and Bax proteins in different tumor groups

圖13 不同組別瘤組織p-JAK3蛋白表達(dá)半定量分析Figure 13 Semi-quantitative analysis of expression of p-JAK3 protein in different groups

圖14 不同組別瘤組織p-STAT3蛋白表達(dá)半定量分析Figure 14 Semi-quantitative analysis of expression of p-STAT3 protein in different groups

圖15 不同組別瘤組織Bcl-2蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 15 Semi-quantitative analysis of expression of Bcl-2 protein in different tumor groups

圖16 不同組別瘤組織Bax蛋白表達(dá)的半定量分析Figure 16 Semi-quantitative analysis of expression of Bax protein in different groups

4 討論

淋巴瘤是我國的常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率排名第十。隨著每年新增發(fā)病人數(shù)逐年增多，臨床上復(fù)發(fā)和耐藥的淋巴瘤患者也是呈遞增趨勢(shì)，因此，全世界都在尋找治療淋巴瘤的有效藥物。間變性大細(xì)胞淋巴瘤約占非霍奇金淋巴瘤的3%～7%，五年生存率為52%。治療可實(shí)施放療、化療、靶向治療、造血干細(xì)胞移植等方法。化療可以使多數(shù)患者完全緩解，但易復(fù)發(fā)[6]，尤其是ALK陰性的間變大細(xì)胞淋巴瘤。

夏枯草的功效為清火明目，能夠治療目赤腫痛、甲狀腺疾病等。目前藥學(xué)研究也證實(shí)夏枯草對(duì)淋巴瘤、甲狀腺癌、肝癌等腫瘤均有抑制作用[7-12]，尤其是對(duì)淋巴瘤，包括T細(xì)胞淋巴瘤和B細(xì)胞淋巴瘤有抑制作用，并且隨著科學(xué)技術(shù)的提高，通過從夏枯草水煎劑到有效成分分析發(fā)現(xiàn)，夏枯草的有效成分具有抗腫瘤作用[13-18]。通過對(duì)夏枯草的有效成分和作用機(jī)制的研究，能夠?yàn)榕R床夏枯草治療淋巴瘤提供科學(xué)依據(jù)。但是夏枯草的成分復(fù)雜，其發(fā)揮抗腫瘤作用及成分具體的作用機(jī)制還未明確。夏枯草性寒，味辛、及味苦，主要治療實(shí)熱證，目前針對(duì)淋巴瘤的病理與中醫(yī)證候研究尚存空白，這也是本課題下一步研究的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)夏枯草在淋巴瘤用藥處方中作為核心藥物使用頻率高，淋巴瘤屬中醫(yī)“痰核”范疇，因此處方中出現(xiàn)的健脾化痰藥物雖然出現(xiàn)頻次高，但不作為本研究的重點(diǎn)，而將具有化痰散結(jié)的夏枯草作為研究重點(diǎn)。在課題組提前出夏枯草的主要有效成分后，研究發(fā)現(xiàn)夏枯草提取物可顯著抑制Karpas299細(xì)胞的增殖，并且隨著藥物濃度的增高，抑制作用明顯增強(qiáng)，并且隨著藥物作用時(shí)間的延長，抑制作用明顯增強(qiáng)，其48小時(shí)抑制Karpas299細(xì)胞增殖的藥物IC50為（33.2±1.8）ug/ml，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的影響，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞后，凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低、Bax表達(dá)升高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明，夏枯草提取物可瘤組織的生長，降低瘤組織Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)瘤組織Bax蛋白的表達(dá)。

60%～80%的間變性大細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)ALK融合蛋白，ALK可通過激活PLC-γ、JAK/STAT、PI3K/AKT/mTOR等信號(hào)通路，在JAK/STAT通路中，活化的STAT可誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，阻斷STAT3信號(hào)通路就可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長，因此，以STAT3為靶點(diǎn)的腫瘤治療研究，逐漸成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[19]。細(xì)胞凋亡是指為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，它是一個(gè)重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)、調(diào)控，對(duì)細(xì)胞的更新起著十分關(guān)鍵的作用[20]。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，是目前研究細(xì)胞凋亡的主要對(duì)象，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，Bcl-2是抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此在大多數(shù)腫瘤中，Bcl-2表達(dá)升高，同時(shí)Bax表達(dá)下降[21]。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，夏枯草提取物能夠抑制p-JAK3、p-STAT3、Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)。夏枯草提取物抑制間變性大細(xì)胞淋巴瘤的機(jī)制與JAK/STAT信號(hào)通路導(dǎo)致的凋亡途徑有關(guān)，但是和PI3K/AKT/mTOR等其他信號(hào)通路的關(guān)系還不得而知，而且本研究只研究了一種淋巴瘤細(xì)胞株，還需要更多的細(xì)胞系進(jìn)行證明。

本研究以中草藥單體為研究對(duì)象，通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分別研究中藥單體對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株的作用和機(jī)制，為深入研究中草藥的抗腫瘤機(jī)制提供了科學(xué)方法，為中草藥的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，彌補(bǔ)了既往中藥復(fù)方復(fù)雜成分的干擾，但本研究只是針對(duì)淋巴瘤的一種細(xì)胞株和一種信號(hào)通路進(jìn)行研究，還需要在其他細(xì)胞株和信號(hào)通路上進(jìn)一步驗(yàn)證。夏枯草本身屬于復(fù)合物，在發(fā)揮抗腫瘤作用的時(shí)候，是一種化學(xué)成分主導(dǎo)作用，還是多種化學(xué)成分共同作用，還需要提取物單體和水煎劑的對(duì)照研究。