逆灸對(duì)亞健康狀態(tài)大鼠下丘腦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中PERK、ATF4的影響*

杜旭 張容超 劉娟 張豪斌 李玉杰 胡文靜

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046)

目前在人類生理、心理承受的壓力越來越大的趨勢(shì)下，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致亞健康狀態(tài)人群越來越多。2016年WHO報(bào)告，全球范圍內(nèi)亞健康狀態(tài)人數(shù)超過60億人，占全球總?cè)丝诘?5%[1]；而中國(guó)總體已約占17.8%～60.5%[2]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為亞健康狀態(tài)屬“治未病”范疇。灸法作為中醫(yī)的特色療法，在本領(lǐng)域已初步顯示出其優(yōu)勢(shì)和潛在能量，具有巨大發(fā)展空間[3]。灸法能明顯改善亞健康患者的疲勞癥狀和生活質(zhì)量，提高機(jī)體免疫能力；在緩解緊張、抑郁、焦慮等方面效果明顯；無(wú)副作用；簡(jiǎn)便，易操作，安全性高[4-8]。而“逆灸”是特殊灸法，屬“逆針灸”，源于《內(nèi)經(jīng)》“治未病”思想，即在機(jī)體的健康狀態(tài)、發(fā)病前或疾病輕淺時(shí)，預(yù)先施以灸法，來激發(fā)機(jī)體經(jīng)氣、抗病與應(yīng)變能力，從而維護(hù)健康、防病減損?！澳婢摹备深A(yù)亞健康狀態(tài)可顯著改善患者中醫(yī)癥候積分、中醫(yī)癥候、睡眠情況、疲勞癥狀和生存質(zhì)量，顯著降低患者經(jīng)絡(luò)能量指數(shù)、精神狀態(tài)指數(shù)、筋骨氣血指數(shù)、新陳代謝指數(shù)、自律神經(jīng)指數(shù)的異常率[9]，但其機(jī)制研究鮮見。因此本研究擬從神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)樞紐——下丘腦的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路探究其部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠30只(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK2020-003)，♂，體質(zhì)量(250±30)g，以隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(10只)、模型組(10只)和逆灸組(10只)，實(shí)驗(yàn)全程按2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2主要儀器與試劑 奧林巴斯BX51型顯微鏡、徠卡APERI0 VERSA 8掃描儀等。PERK抗體(北京博奧森，批號(hào)：bs-2469R)；ATF4抗體(武漢博士德，批號(hào)：A00371-1)、即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒(武漢博士德，批號(hào)：SA1022)。艾條(南陽(yáng)市臥龍漢醫(yī)艾絨廠，規(guī)格:18 mm×200 mm)。

1.3模型制備 參照文獻(xiàn)[10]，共兩部分，次序采用數(shù)字隨機(jī)表安排。以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異為成功標(biāo)志。

1.3.1自制大鼠活動(dòng)限制筒 取長(zhǎng)15 cm，內(nèi)徑5.5 cm透明的堅(jiān)固塑料圓筒，筒壁設(shè)有若干直徑約0.2 cm的圓孔，一端封閉，另一端設(shè)有可移動(dòng)的塑料厚片塞，并通過連接在其上的長(zhǎng)柄來控制大鼠移動(dòng)空間。每日9時(shí)至12時(shí)將大鼠置于筒內(nèi)，根據(jù)其身長(zhǎng)，調(diào)節(jié)移動(dòng)塞的位置，使大鼠不能自由活動(dòng)，但保證無(wú)損傷，不影響其呼吸和排泄。每日1次，每次3 h，同時(shí)禁止飲食。連續(xù)造模21 d。

1.3.2自制160 cm×80 cm×65 cm注水鼠箱 水溫25 ℃左右，水深30 cm。每天16時(shí)將大鼠置入水箱中。第1周強(qiáng)迫游泳20 min，第2、3周時(shí)間分別為30 min、40 min。連續(xù)造模21 d。

1.4干預(yù)方法 空白組：不做治療，每日1次模擬抓拿固定。

模型組：第1 d開始不做治療，每日1次模擬抓拿固定，至第24 d開始采用束縛應(yīng)激結(jié)合游泳運(yùn)動(dòng)制備模型，每日1次，共21次。

逆灸組：第1 d開始逆灸，7 d一個(gè)療程，持續(xù)3個(gè)療程共21 d，療程間隔1 d。參考余曙光主編2016版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中常用動(dòng)物穴位定位法，取大鼠百會(huì)、足三里和腎俞穴。將大鼠固定于自制鼠板上，腧穴處剪毛，將艾條固定于自制艾灸支架上，垂直距離大鼠穴位約3 cm施灸，每日1次，每次20 min。至第24 d開始造模，每日1次，共21次。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第23 d、45 d進(jìn)行，觀察大鼠在新異環(huán)境中的自主行為、探究行為和緊張度。場(chǎng)箱規(guī)格：50 cm×50 cm×50 cm，四周、底面均涂以黑色，底面用白色線條標(biāo)記為5×5的方格。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠置于場(chǎng)箱中央格，觀察其5 min內(nèi)，方格間穿行(水平運(yùn)動(dòng))次數(shù)，以大鼠三爪以上跨入鄰格的次數(shù)為1次；豎起(垂直運(yùn)動(dòng))次數(shù)，以大鼠雙前肢離地以上的次數(shù)為1次。

1.5.2PERK、ATF4免疫組化檢測(cè) 第45 d將各組大鼠斷頭處死，冰上迅速剖取腦，取下丘腦組織常規(guī)制作石蠟切片。常規(guī)脫臘水化；加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min后清洗，將切片放入EDTA抗原修復(fù)液中加熱8 min后冷卻至室溫；滴加5%BSA封閉液室溫封閉30 min，傾去多余液體；加入ATF4(1∶100)、PERK(1∶200)抗體4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后用PBS洗滌3次，每次5 min；滴加羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，5 min/次；滴加SABC孵育30 min，PBS洗5 min×4次；加入DAB顯色液顯色，觀察后水洗；滴加Mayor蘇木素室溫孵育1 min，清洗；樹膠封片、鏡檢；使用Image-ProPlus采集圖片積分光密度(integrated option density，IOD)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表1示，第23 d后，逆灸組大鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)較模型組均有非常明顯差異(P<0.01)。第45 d后，模型組大鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)明顯減弱，與空白組有非常明顯差異(P<0.01)；逆灸組大鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)能力較空白組低、較模型組高，均有非常明顯差異(P<0.01)。

2.2各組大鼠PERK、ATF4表達(dá)比較 見表2。

表2 各組大鼠PERK、ATF4表達(dá)比較

表2示，第45 d后，與空白組比較，模型組、逆灸組大鼠PERK含量明顯升高，模型組有非常明顯差異(P<0.01)，逆灸組有明顯差異(P<0.05)；與模型組比較，逆灸組較低，有明顯差異(P<0.05)。與空白組比較，模型組、逆灸組大鼠ATF4含量也明顯升高，均有明顯差異(P<0.05)，與模型組比較，逆灸組也較低，有明顯差異(P<0.05)。

3 討論

亞健康狀態(tài)在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“虛勞”范疇，主要以補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血為治療原則。對(duì)相關(guān)3篇文獻(xiàn)(4個(gè)研究，591例受試者)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，針灸在改善亞健康人群總體癥狀和睡眠指數(shù)等單個(gè)癥狀方面可能優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照[11]。數(shù)據(jù)挖掘研究表明，現(xiàn)代針灸治療亞健康頻次最高的5個(gè)腧穴為足三里、三陰交、百會(huì)、腎俞及關(guān)元[12]。足三里穴為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴、下合穴，可健脾益胃、益氣補(bǔ)血、扶正培元，為保健要穴；多灸足三里，可培補(bǔ)正氣，補(bǔ)益臟腑。腎俞是腎之精氣在腰部深聚部位，可填精益氣。百會(huì)為三陽(yáng)五會(huì)，可調(diào)補(bǔ)陽(yáng)氣，醒腦開竅。已有機(jī)理研究表明，灸法可以明顯改善亞健康患者的免疫狀態(tài)、生活質(zhì)量及甲襞微循環(huán)等，且無(wú)副作用，安全性高，是一種理想、簡(jiǎn)捷、有效的療法[13-14]。但相關(guān)研究仍較缺乏，最具特色的“逆灸”預(yù)防亞健康狀態(tài)機(jī)理研究更是鮮見。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，亞健康狀態(tài)是長(zhǎng)期應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)，而下丘腦HPA軸是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)樞紐，對(duì)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)過程起著核心作用[15]。我們前期研究聚焦于HPA軸，發(fā)現(xiàn)逆灸預(yù)防亞健康狀態(tài)可能是通過調(diào)控HPA軸-5-HT通路進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮作用的；逆灸可能是預(yù)防機(jī)體長(zhǎng)期慢性應(yīng)激損害的有效手段，能夠啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，調(diào)動(dòng)自我反饋、調(diào)節(jié)機(jī)制以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[16]。下丘腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可能是應(yīng)激過程中的關(guān)鍵因素和潛在的研究熱點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中最大的細(xì)胞器，在細(xì)胞中具有重要作用。ER合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、整合、翻譯、修飾蛋白質(zhì)，合成磷脂和膽固醇，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用重大。ERS是ER功能穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，引起ER腔內(nèi)未折疊、錯(cuò)誤折疊蛋白增加或Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，ERS早期或未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)能提高細(xì)胞在有害因素下的生存能力，減輕累積的蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成損害，是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，但劇烈或者持久的ERS能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡[17]。ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要進(jìn)化保守機(jī)制——自噬密切相關(guān)，存在共同的上游信號(hào)通路，包括蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)/誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、Ca2+等[18]。PERK是唯一存在于ER內(nèi)的絲氨酸或蘇氨酸激酶，在ER腔內(nèi)具有應(yīng)激感應(yīng)域，與應(yīng)激密切相關(guān)[19]。ATF4則可上調(diào)編碼C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表達(dá)，影響其靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞損傷修復(fù)機(jī)制，如生長(zhǎng)停滯及DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage-inducible protein 34，GADD34)等的表達(dá)[20]。研究表明，中藥單體、中成藥、復(fù)方及針灸，都可有效影響細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)[21-23]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，逆灸可提高大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)能力，效應(yīng)肯定；同時(shí)也能降低PERK、ATF4表達(dá)。一定程度上表明，逆灸預(yù)防亞健康狀態(tài)可能與下丘腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中PERK、ATF4相關(guān)，可能是揭示逆灸預(yù)防亞健康狀態(tài)的一個(gè)途徑。