復(fù)方參柏煎劑對(duì)慢性濕疹I(lǐng)CR小鼠的療效及作用機(jī)制*

趙金莉 鐘琪 李長(zhǎng)香 邢洪霞 趙琰 屈會(huì)化 孔慧**)

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.曲阜市中醫(yī)院，曲阜 273100；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)

濕疹為臨床常見(jiàn)疾病之一，且多頑固難愈，近年來(lái)濕疹的發(fā)病率不斷上升，有流行病學(xué)調(diào)查顯示，近二十年來(lái)我國(guó)皮膚科門診就診的患者不斷增加，一般人群的濕疹患病率已經(jīng)接近西方國(guó)家，兒童發(fā)病率10～30%[1]。目前西醫(yī)治療以抗炎、調(diào)節(jié)免疫、止癢為主，多采用高效外用皮質(zhì)類固醇，鈣調(diào)神經(jīng)酶抑制劑(他克莫司、吡美莫司)，口服抗組胺藥、免疫抑制劑、環(huán)孢素、生物制劑等，短期內(nèi)可改善瘙癢和皮損癥狀，但療效具有局限性，重復(fù)使用這些藥物或者長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)導(dǎo)致感染，腎上腺抑制，皮膚萎縮，色素沉著發(fā)暗，很難恢復(fù)，影響視覺(jué)，愈合易復(fù)發(fā)，療效不確切，難以控制其復(fù)發(fā)等副作用[2]。中醫(yī)采用辨證論治的方法治療濕疹，可有效減少?gòu)?fù)發(fā)，副作用相對(duì)較少[3]。

中醫(yī)古籍文獻(xiàn)中無(wú)濕疹病名，但有很多關(guān)于濕疹的記載，根據(jù)其臨床特征，將其歸于“浸淫瘡”“濕瘡”等范疇?！吨T病源候論·浸淫瘡候》記載“小兒五臟有熱，熏發(fā)皮膚，外為風(fēng)濕所折，濕熱相搏身體，其瘡初出甚小，后有膿汁，浸淫漸大，故謂之浸淫瘡也”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕疹發(fā)病的原因有內(nèi)因和外因共同作用而成，內(nèi)因是體內(nèi)五臟有熱(功能失調(diào))，尤以脾、肺、心三臟為主，外因是感受風(fēng)、濕、熱等六淫邪氣，內(nèi)外兩邪相搏，充于腠理，外搏肌膚而發(fā)病[4]。

現(xiàn)代醫(yī)家采用不同的辨證分型，并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。王慶國(guó)教授將濕疹分為血分熱毒型、濕熱在表型、風(fēng)濕熱盛型、血虛風(fēng)燥型。治療急性濕疹突出血分熱毒的病理因素，治以涼血清熱解毒為主，佐以利濕祛風(fēng)止癢。對(duì)于慢性濕疹，王老師則特別重視養(yǎng)血活血藥的應(yīng)用。針對(duì)兒童口服中藥比較困難的情況，結(jié)合王老師臨床治療經(jīng)驗(yàn)，擬定了治療兒童濕疹的外用煎劑[5]。處方組成：本處方由苦參、炒黃柏、蛇蛻、徐長(zhǎng)卿、炒槐花、炒刺蒺藜、赤芍、大黃、黃芪、花椒10味中藥組成，將其命名為復(fù)方參柏煎劑。方中苦參、黃柏清熱燥濕為君藥；槐花清瀉肝火為臣藥；徐長(zhǎng)卿祛風(fēng)化濕為臣藥；蛇蛻、刺蒺藜和花椒祛風(fēng)止癢為佐藥；赤芍養(yǎng)血潤(rùn)燥、黃芪益氣固表兼強(qiáng)脾胃，為佐藥；大黃活血祛瘀為使藥。全方配伍精當(dāng)，內(nèi)健機(jī)體(提高機(jī)體免疫力)外除病邪(祛濕止癢)，共奏清熱燥濕、祛風(fēng)止癢、養(yǎng)血潤(rùn)燥之功。從外觀可見(jiàn)緩解瘙癢、改善皮損的癥狀。

以復(fù)方參柏煎劑外用治療小兒濕疹、丘疹性蕁麻疹、尿布皮炎、足癬、帶狀皰疹等皮膚疾患，均取得了滿意的療效。本方適用范圍廣泛、療效確切，為了造福更廣泛的兒童患者，擬將其開(kāi)發(fā)成使用方便的外用制劑，為此，本實(shí)驗(yàn)選擇慢性濕疹的經(jīng)典動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)其效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠，雄性，體重20～25 g(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，所有小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)在同一環(huán)境下，溫度為(24.0±1.0)℃，相對(duì)濕度為(55～65)%，可自由飲食進(jìn)水，12 h～12 h明暗循環(huán)飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)前12 h，禁食不禁水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024170)；復(fù)方參柏煎劑：按處方比例稱取苦參、炒黃柏、蛇蛻、徐長(zhǎng)卿、炒槐花、刺蒺藜、赤芍、大黃、黃芪、花椒,加水煎煮(加水八倍量，浸泡2 h，煎煮二次，每次40 min，兩次水煎液合并)，濾液濃縮至0.64 g/mL(按生藥計(jì))(中藥飲片均購(gòu)自北京仟草中藥飲片有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 2,4-二硝基氯苯(DNCB)(阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司)；無(wú)水乙醇(北京化工)；4%組織細(xì)胞固定液(北京百瑞極生物科技有限公司)；1×PBS緩沖液(深圳瑞捷特科技有限公司)；薇婷脫毛膏(利潔時(shí)家化(中國(guó))有限公司)；小鼠IL-4、干擾素-γ、IL-17試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備 分析天平(BSA1245-CW，0.1 mg，德國(guó)Sartorius)；螺旋測(cè)微器(0～25 mm，蘇州英仕精密機(jī)械有限公司)；手持組織勻漿機(jī)(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；打孔器(得力文具)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1復(fù)方參柏煎劑對(duì)慢性濕疹小鼠模型的藥效學(xué)研究 取42只ICR雄性小鼠，隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏組)、復(fù)方參柏煎劑低劑量(0.16 g·mL-1，以原藥材計(jì))組、中劑量(0.32 g·mL-1)組、高劑量組(0.64 g·mL-1)，每組7只，腹部脫毛(面積2 cm×2 cm)，以7%的DNBC乙醇溶液100 μL/只涂擦致敏，間隔5天，第6天以1%的DNCB乙醇溶液10 μL/只涂擦右耳部激發(fā)，隔一天激發(fā)一次，共激發(fā)4次，藥物干預(yù)從第一次激發(fā)的第二天開(kāi)始，涂擦右耳部給藥，陽(yáng)性藥組10 μL/只，復(fù)方參柏煎劑組10 μL/只，一天兩次，激發(fā)當(dāng)天不給藥，模型組給予等量生理鹽水處理，末次給藥后觀察小鼠耳部紅腫及鱗屑情況，次日再次給藥后，摘眼球取血，脫臼處死，并取各組小鼠耳朵，比較左右耳重量及厚度差，取部分耳片組織放于4%組織細(xì)胞固定液中固定，剩余耳朵組織液氮凍存后放入-80 ℃冰箱中備用。

2.2指標(biāo)檢測(cè)方法

2.2.1耳重量及厚度測(cè)量 沿小鼠耳朵根部剪取小鼠雙耳，用螺旋測(cè)微器測(cè)量雙耳同一位置的厚度，多次測(cè)量取平均值；隨后用打孔器(孔洞直徑0.35 cm)切取雙耳中部相同位置的組織，分析天平稱取其重量。

2.2.2小鼠耳朵組織切片 剪取小鼠右耳部分組織，放于4%組織細(xì)胞固定液中固定，石蠟包埋，HE染色，電子顯微鏡200倍下觀察、拍片。

2.2.3ELISA法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo) 末次給藥后摘眼球取血，隨后脫臼處死小鼠，血液靜置兩小時(shí)后，3000 r·min-1離心15 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒的操作方法，檢測(cè)血清中IL-4、IFN-γ和IL-17的含量。

取凍存的耳朵組織，用生理鹽水漂洗，擦干并稱重，之后加入9倍量1×PBS緩沖液，組織勻漿機(jī)研磨，3000 r·min-1離心15 min，取上清液，按照ELISA試劑盒的操作方法,檢測(cè)小鼠耳組織勻漿中IL-4和IL-17的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1組織形態(tài)學(xué)觀察 復(fù)方參柏煎劑外用治療小鼠耳腫脹的組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可以看出，空白組小鼠耳朵HE染色切片中表皮層、真皮層組織結(jié)構(gòu)完好，層次分明，厚度適中；與空白組相比，模型組表現(xiàn)為表皮角化不全，顆粒層及棘層增厚，且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；其它各治療組亦有表皮角化過(guò)度或不全，顆粒層及棘層增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的病理表現(xiàn)，但均較模型組輕。表明復(fù)方參柏煎劑可以明顯改善小鼠耳朵的炎性癥狀。

3.2復(fù)方參柏煎劑對(duì)小鼠耳腫脹的影響 復(fù)方參柏煎劑對(duì)小鼠耳厚度及耳重量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出，與空白組比較，模型組小鼠耳厚度明顯增加，具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組耳厚度顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，復(fù)方參柏煎劑低劑量組耳厚度降低，具有顯著差異(P<0.05)，中、高劑量組具有極顯著差異(P<0.01)。與空白組比較，模型組小鼠耳重量增加，具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組耳重量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，復(fù)方參柏煎劑中、高劑量組小鼠耳重量降低，具有極顯著差異(P<0.01)，低劑量組耳重量也降低了，但是差異未達(dá)到顯著性。以上結(jié)果表明，復(fù)方參柏煎劑可以明顯改善小鼠的耳腫脹度，且具有一定的劑量依賴性。

圖1 復(fù)方參柏煎劑外用治療小鼠耳腫脹的組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 各組小鼠耳厚度及耳重量比較

3.3復(fù)方參柏煎劑的作用機(jī)制研究 復(fù)方參柏煎劑對(duì)小鼠血清IL-4、IFN-γ及IL-17因子的影響見(jiàn)表2。由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-4上升、IFN-γ下降，且均具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組及復(fù)方參柏煎劑低、中、高劑量組血清IL-4的含量降低，均具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組及復(fù)方參柏煎劑中、高劑量組血清IFN-γ的含量升高，具有極顯著差異(P<0.01)，低劑量組具有顯著差異(P<0.05)。各組血清IL-17含量均低于試劑盒檢測(cè)下限，此項(xiàng)未獲得有效數(shù)據(jù)。

表2 各組血清IL-4、IFN-γ及IL-17比較

由于實(shí)驗(yàn)中各組血清IL-17含量均低于試劑盒檢測(cè)下限，所以增測(cè)了組織(耳朵)中IL-17含量，另外IL-4的測(cè)定值也比較低，故在組織中一起增測(cè)了IL-4的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠組織中IL-4、IL-17含量上升，且均具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組及復(fù)方參柏煎劑高劑量小鼠組織中IL-4含量均極顯著下降(P<0.01)，中劑量組顯著下降(P<0.05)，低劑量組無(wú)顯著差異。與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組和復(fù)方參柏煎劑低、中、高劑量組小鼠組織中IL-17含量均極顯著下降(P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

由以上結(jié)果可知，復(fù)方參柏煎劑小鼠組織中IL-4的含量變化趨勢(shì)與血清中的一致，與模型組相比均呈降低趨勢(shì)；復(fù)方參柏煎劑各劑量組的IL-17含量均比模型組顯著降低，說(shuō)明本品可以通過(guò)降低IL-4和IL-17含量來(lái)達(dá)到降低炎癥反應(yīng)的作用。

表3 各組組織IL-4、及IL-17比較

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，邪之所入便是邪之所出，濕疹表現(xiàn)為皮毛受病，應(yīng)從皮毛而解。中醫(yī)遵循“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥即內(nèi)治之藥”。臨床上濕疹多內(nèi)外合治，口服中藥湯劑與中藥液擦拭浸泡患處相結(jié)合，能夠起到更好的效果?？紤]到兒童患濕疹的比率比較大，而且服用中藥比較困難，所以有必要研制適用兒童的療效確切的濕疹外用制劑。

4.1復(fù)方參柏煎劑處方分析 濕疹是由內(nèi)外因素共同作用而成的，內(nèi)因以脾濕為主，外因以風(fēng)、濕、熱為主，總不離乎“濕”[6]，復(fù)方參柏煎劑由苦參、炒黃柏、蛇蛻、徐長(zhǎng)卿、炒槐花、炒刺蒺藜、赤芍、大黃、黃芪、花椒組成。方中黃柏、槐花、刺蒺藜均用炒制品是本處方的點(diǎn)睛之筆，因濕疹不離“濕”，炒制增加了其“火”性，又“火”能勝“濕”，從而增強(qiáng)了其燥濕之功。

方中苦參主要含有氧化苦參堿，具有抗炎、抗病毒、抗病原微生物等多種藥理作用[7-8]；黃柏主要含有小檗堿，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒及其他病原微生物的作用[9-10]；蛇蛻具有抗炎、抗菌等藥理作用[11-12]；徐長(zhǎng)卿具有抗過(guò)敏等藥理作用[13-14]；槐花主要含有黃酮類成分，具有抗炎、抗病毒等作用[15-16]；刺蒺藜主要含有蒺藜皂苷，臨床上常用于治療風(fēng)疹瘙癢[17-18]；赤芍主要含有赤芍苷和黃酮類成分，具有抗炎、抗氧化等作用[19]；大黃主要含有蒽醌類、鞣質(zhì)類成分，具有抗氧化、改善微循環(huán)等作用[20-21]；黃芪主要含有黃芪皂苷和多糖，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗應(yīng)激和較廣泛的抗菌作用[22-23]；花椒揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛、麻醉、抗氧化、驅(qū)蟲等作用[24-25]。綜上，本處方涉及的中藥，從現(xiàn)代藥理藥化的研究結(jié)果顯示具有治療濕疹的作用。

4.2復(fù)方參柏煎劑作用機(jī)制分析 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為慢性濕疹的發(fā)病與Th1/Th2細(xì)胞的失衡有關(guān)，Th1細(xì)胞主要分泌IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IL-22等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫，急性期以Th2細(xì)胞為主，慢性期以Th1細(xì)胞為主[26-27]。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)IgG向IgE的類型轉(zhuǎn)換，以自分泌方式促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，但抑制Th1細(xì)胞增殖及其應(yīng)答；IFN-γ，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并抑制Th2細(xì)胞增殖；IL-17主要由外周血T細(xì)胞產(chǎn)生，誘導(dǎo)人表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌IL-6、IL-8等細(xì)胞因子。

本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方參柏煎劑可明顯降低模型小鼠耳朵的腫脹度，模型小鼠血清中IL-4含量升高，IFN-γ含量降低，Th1/Th2的比值降低，給藥組小鼠血清IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，使Th1/Th2的比值增大，可見(jiàn)復(fù)方參柏煎劑是通過(guò)調(diào)整Th1/Th2的比例失衡，也就是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)治療慢性濕疹的。