抵當(dāng)芪桂湯對(duì)2型糖尿病大鼠肝組織PI3K、Akt基因和蛋白的影響*

韓思榮 屈杰 楊景鋒 楊軍 譚穎穎 李小會(huì) 陳麗名

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是胰島素分泌不足和(或)胰島素作用缺陷導(dǎo)致的一種以持續(xù)高血糖為主要特征，以多飲、多食、多尿及體重減輕為典型癥狀的慢性代謝性疾病[1]。由于其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，單純西藥治療對(duì)T2DM及其并發(fā)癥的進(jìn)程控制不是十分理想。

中醫(yī)藥在防治T2DM及其并發(fā)癥方面具有多靶點(diǎn)、多途徑等不可替代的優(yōu)勢(shì)[2]。通過(guò)大量的臨床觀察，導(dǎo)師楊景鋒教授指出“氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)”是T2DM的關(guān)鍵病機(jī)，并以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)作為其基本治則治法，將經(jīng)方抵當(dāng)湯和黃芪桂枝五物湯化裁組成抵當(dāng)芪桂湯，用于T2DM及其并發(fā)癥的臨床治療，療效顯著[3-5]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，抵當(dāng)芪桂湯能夠降低血糖水平，保護(hù)胰島細(xì)胞，改善胰島素抵抗[6-8]。本課題在其基礎(chǔ)上研究抵當(dāng)芪桂湯對(duì)2型糖尿病大鼠肝組織PI3K、Akt表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其降糖機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1主要儀器 悅好Ⅲ型740魚(yú)躍血糖儀及配套血糖試紙(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；R136切片機(jī)(德國(guó)Leica)；CX21正置電子光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)；Veriti DX梯度PCR儀(Life)；Roche480II熒光定量PCR儀(Roche)；JY88-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝)；CR22GⅡ臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日本日立)；ELXSOSIU全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 抵當(dāng)芪桂湯(生黃芪30 g，桂枝10 g，酒大黃10 g，炒白芍15 g，水蛭6 g，鬼箭羽20 g組成)，中藥材由提供陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院提供，品質(zhì)合格。煎藥取液，并濃縮成含生藥0.948 g·mL-1和1.896 g·mL-1兩種濃度，存儲(chǔ)于4 ℃冰箱；鹽酸二甲雙胍(格華止)，中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素(Streptozotocin)STZ，美國(guó)Sigma公司；胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；PI3K、Akt抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)買(mǎi)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物SPF級(jí)許可證號(hào)：SCXK(陜)2007- 001。

2 方法

2.1動(dòng)物模型制備 80只SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)抽取10只作為空白對(duì)照組，給予普通飼料。剩下70只作為T(mén)2DM造模組，給予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)6 w。第7 w，所有大鼠禁食12 h，造模組大鼠按照35 mg·kg-1一次性腹腔注射STZ溶液(將STZ溶于0.1 mol·L-1、pH4.2的枸櫞酸緩沖液，配制為1%濃度)，對(duì)照組大鼠予按照35 mg·kg-1枸櫞酸緩沖液進(jìn)行腹腔注射。STZ注射72 h后，造模組大鼠尾靜脈采血，測(cè)FBG≥16.9 mmol·L-1為造模成功。

2.2分組與給藥 于STZ注射后的第8 d，將造模成功的60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)表分組(見(jiàn)表1)。藥物干預(yù)6 w后，處死大鼠，留取血清和肝組織。

表1 大鼠分組與給藥

2.3指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1大鼠空腹血糖(FBG)的測(cè)定 測(cè)定FBG前禁食12 h，于大鼠尾靜脈采血，用魚(yú)躍血糖儀及配套血糖試紙檢測(cè)。

2.3.2大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)的測(cè)定 由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定HbA1c含量。

2.3.3大鼠肝組織胰島素的測(cè)定 按照大鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中肝組織胰島素水平。

2.3.4RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織PI3K、AktmRNA的表達(dá) 勻漿器處理肝組織后，進(jìn)行肝組織總RNA的抽提，采用RT-PCR法檢測(cè)肝組織PI3K、AktmRNA的表達(dá)。見(jiàn)表2。

表2 引物序列表

2.3.5WB法檢測(cè)大鼠肝組織PI3K、Akt蛋白的表達(dá) 勻漿器處理肝組織后，提取肝組織總蛋白，采用Western-blot法檢測(cè)肝組織PI3K、Akt蛋白的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1對(duì)大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)和肝組織胰島素水平的影響 與Control組相比，Model組大鼠的FBG、HbA1c和肝組織胰島素水平均升高(P<0.01)；與Model組相比，Met組、DQZ組、DQZX組的FBG、HbA1c和肝組織胰島素水平均呈現(xiàn)不同程度降低(P<0.05或P<0.01)；與Met組相比，DQZ組的FBG、HbA1c和肝組織胰島素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DQZX組與藥物干預(yù)各組相比，其HbA1c和肝組織胰島素降低最為顯著(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3和圖1。

表3 各組大鼠FBG、HbA1c、肝組織胰島素水平

圖1 各組大鼠FBG、HbA1c、肝組織胰島素水平柱形圖

3.2對(duì)大鼠肝組織PI3K、AktmRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果見(jiàn)圖2。與Control組比較，Model組大鼠肝臟組織的PI3K、AktmRNA的表達(dá)均降低(P<0.01)；與Model組比較，藥物干預(yù)各組大鼠的肝臟組織PI3K、AktmRNA的表達(dá)均有所上調(diào)(P<0.01)；與Met組相比，DQZ組的PI3K、AktmRNA的表達(dá)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DQZX組與藥物干預(yù)各組相比，其PI3K、AktmRNA的表達(dá)上調(diào)最為顯著(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肝組織PI3K、AktmRNA表達(dá)柱狀圖

3.3對(duì)大鼠肝組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)過(guò)圖像分析可知：與Control組比較，Model組大鼠肝臟組織中的PI3K、Akt蛋白的表達(dá)水平均降低(P<0.01)；與Model組比較，藥物干預(yù)各組的PI3K、Akt的蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)；與Met組相比，DQZ組的PI3K、Akt的蛋白表達(dá)組間存在差異(P<0.05或P<0.01)；DQZX組與藥物干預(yù)各組相比，其PI3K、Akt蛋白的表達(dá)上調(diào)最為顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖3、4。

圖3 各組大鼠肝組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)條帶圖 圖4 各組大鼠肝組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)柱狀圖

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)T2DM發(fā)生的主要病理機(jī)制是胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，而IR是由于長(zhǎng)期攝入過(guò)量的高糖高脂飲食，導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝紊亂而誘發(fā)是指人體內(nèi)發(fā)揮降糖效力的胰島素靶器官(肝臟、肌肉和脂肪)對(duì)胰島素的反應(yīng)力降低，導(dǎo)致其促使葡萄糖代謝的能力下降，肝糖原合成障礙，表現(xiàn)為血糖升高[9-10]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周，誘導(dǎo)其發(fā)生胰島素抵抗，并按照35 mg·kg-1一次性腹腔注射STZ溶液破壞部分胰島細(xì)胞，造成胰島β細(xì)胞損傷，使血糖升高，T2DM大鼠的造模成功率高達(dá)85%。這兩者結(jié)合所誘導(dǎo)的病理改變更加接近于人類(lèi)的T2DM[11]。

基于多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，楊景鋒教授認(rèn)為T(mén)2DM患者中氣虛血瘀情況較為多見(jiàn)，表示該病主要病因病機(jī)為“氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)”，故以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)作為其基本治則治法，將經(jīng)方抵當(dāng)湯與黃芪桂枝五物湯加減組成抵當(dāng)芪桂湯，用于T2DM及其并發(fā)癥的治療，臨床療效顯著。該方以黃芪、炒白芍為君藥，益氣養(yǎng)陰生津；桂枝溫通經(jīng)絡(luò)，水蛭、酒大黃活血化瘀，共為臣藥；并以鬼箭羽為佐，破血祛瘀。諸藥合用，補(bǔ)益而不郁滯，祛瘀而不傷正，共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抵當(dāng)芪桂湯可以降低血糖和肝組織胰島素水平，同時(shí)當(dāng)二甲雙胍聯(lián)合抵當(dāng)芪桂湯治療T2DM大鼠時(shí)，可增加其降糖療效。提示抵當(dāng)芪桂湯可能通過(guò)提高肝臟組織對(duì)胰島素的敏感性，增加其對(duì)葡萄糖的攝取和利用，以降低血糖水平。

胰島素需要與靶組織的胰島素受體結(jié)合，與下游的信號(hào)蛋白發(fā)生作用，引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而調(diào)控葡萄糖的代謝。其中，PI3K/Akt通路是肝臟胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、β細(xì)胞存活、胰島素基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程[12-14]，在血糖代謝方面占據(jù)重要地位，該通路信號(hào)傳導(dǎo)異常會(huì)導(dǎo)致T2DM肝臟IR[15-17]。當(dāng)胰島素進(jìn)入血液后，與肝細(xì)胞膜上的特異性受體相結(jié)合，并激活胰島素受體底物-1(IRS-1)。隨之與下游PI3K的P85調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，激活PI3K P110亞基，使Akt磷酸化。Akt活化后通過(guò)抑制糖原合成酶激酶的活性，使糖原合成酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)肝糖原合成[18-20]；同時(shí)Akt活化后會(huì)與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)結(jié)合，促進(jìn)葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，共同維持體內(nèi)血糖的穩(wěn)態(tài)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Model組大鼠肝組織中PI3K、Akt基因和蛋白的水平明顯降低，抵當(dāng)芪桂湯高劑量組、抵當(dāng)芪桂湯常量組、抵當(dāng)芪桂湯加二甲雙胍組的PI3K、Akt基因和蛋白表達(dá)均有不同程度的上調(diào)。提示抵當(dāng)芪桂湯可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)，改善肝臟胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，從而降低血糖，達(dá)到防治T2DM的目的。