德宏奶水牛乳腺組織CD36 基因的表達研究*

王夢迪，唐 娜，俞大闊，張永云，楊 忠 ，李衛(wèi)真

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100176；3.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實驗教學示范中心，云南 昆明 650201；4.云南生物制藥有限公司，云南 昆明 650503)

水牛奶品質(zhì)優(yōu)良，其中脂肪和蛋白質(zhì)含量分別約為8.29%和5.23%，營養(yǎng)價值遠高于荷斯坦牛乳[1-5]。德宏水牛屬于沼澤型水牛，是云南當?shù)亟?jīng)過長期選擇培育的優(yōu)良地方牛種資源[6]。德宏水牛與泌乳性能優(yōu)良的摩拉水牛、尼里—拉菲水牛等河流型水牛進行雜交，培育出產(chǎn)乳性能優(yōu)良的德宏奶水牛。改良后的德宏奶水牛屬于乳、肉、役兼用型水牛，是構(gòu)建雜交育種體系的理想模型[7]。

分化抗原簇36 (cluster of differentiation 36，CD36)又被稱為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT)，存在于牛奶脂肪球膜[8]，是直接參與反芻動物組織中脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)跨膜運輸和脂肪細胞積累脂質(zhì)的重要運載體。有研究表明：FAT/CD36可作為FA 轉(zhuǎn)運和甘油三酯(triglyceride，TG)合成的關(guān)鍵基因[9-11]。韓立強等[12]研究表明：在小鼠泌乳中期，CD36的mRNA 相對表達豐度較高，且其mRNA 表達量可上調(diào)3 倍。BIONAZ 等[13]認為：隨著泌乳的進行，CD36基因的mRNA 表達量增加，表明其在奶牛乳腺細胞攝取FA 時發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為泌乳性狀的關(guān)鍵基因。本研究利用實時熒光定量PCR 法研究不同乳脂率德宏奶水牛乳腺組織中CD36基因mRNA 的表達水平，并與乳脂率進行相關(guān)性分析，以期揭示CD36基因在乳脂合成中的作用，為研究其與德宏奶水牛乳脂的合成機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及分組

選擇同一養(yǎng)殖小區(qū)中飼養(yǎng)條件相同的健康德宏奶水牛216 頭，采集乳樣并測定其乳脂率。經(jīng)測，大部分德宏奶水牛乳脂率約為7.5%，故以乳脂率(7.5±0.5)%為基準，將德宏奶水牛分為高乳脂率組(H 組，乳脂率＞8%)、中乳脂率組(M組，乳脂率為7%～8%)和低乳脂率組(L 組，乳脂率＜7%)。每組選取胎次相同、年齡相近、處于泌乳中期的德宏奶水牛各3 頭，屠宰后采集乳腺組織，置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

試劑：RNAiso Plus RNA 提取試劑、Prime ScriptTMreagent Kit Perfect Real Time 和SYBR?Premix ExTaqTMII 購自TaKaRa 公司；RNA Fixer 組織RNA 保存液購自艾德萊生物科技有限公司。

儀器：電泳儀(型號：Power PacTMBasic)、凝膠成像系統(tǒng)(型號：GelDocTMXR)和熒光定量PCR 儀(型號：iCycler Thermal Cycler)購自Bio-Rad 公司；超凈工作臺(型號：SW-CJ-IF)購自上海博迅實業(yè)有限公司；高速冷凍離心機(型號：Thermo Biofuge Primo R)購自Thermo 科技有限公司；核酸蛋白定量檢測儀(型號：Nano Drop Lite)購自Thermo 科技有限公司；乳成分分析儀(型號：Milko ScanTMFT120)購自上海技越國際貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳脂率測定

每頭試驗牛采集乳樣25 mL，采用乳成分分析儀測定乳脂率。

1.3.2 乳腺組織總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

乳腺組織總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄參照孫政等[14]的方法進行，總RNA 提取后使用約1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.3 熒光定量PCR 引物設計

根據(jù)NCBI 上提供的水牛CD36基因(NW_005784248.1)和β-肌動蛋白基因(β-actin，XM_006044278)序列，利用Primer 6.0 和 Oligo 7.0 軟件分別設計引物序列(表1)并對其進行分析評價，選擇評分高的適宜引物進行試驗。

表1 CD36 基因與β-actin 基因引物信息Tab.1 Primer information of CD36 gene and β-actin gene

1.3.4CD36基因表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測CD36基因表達豐度，反應體系設置為20 μL，包括SYBR?Premix ExTaqTMII 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL，cDNA 模板2 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃變性5 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；55 ℃，30 s，81個循環(huán)進行熔解曲線分析。

每個樣品與內(nèi)參β-actin均設置3個重復，以減小系統(tǒng)誤差。在實時熒光定量PCR 反應結(jié)束后，用MyIQ 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并保存熔解曲線及擴增曲線分析，確定產(chǎn)物是否為單一片段，運用2-ΔΔCt法計算CD36基因的表達量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26.0 軟件單因素方差分析各試驗處理數(shù)據(jù)間的顯著性；利用Pearson 相關(guān)系數(shù)法對CD36基因的mRNA 表達水平與乳脂率進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳脂率測定結(jié)果

由表2 可知：高乳脂率組(H 組)德宏奶水牛牛乳中的乳脂率極顯著高于中乳脂率組(M 組)和低乳脂率組(L 組)(P＜0.01)，且M 組顯著高于L 組(P＜0.05)。

表2 德宏奶水牛牛乳中的乳脂率(n=3)Tab.2 Milk fat content of Dehong dairy buffalo

2.2 乳腺組織總RNA 檢測結(jié)果

由圖1 可知：凝膠成像系統(tǒng)可觀察到完整清晰的3 條帶，得到符合試驗需要質(zhì)量標準的RNA；定量檢測每個樣品的RNA 含量及純度表明：該RNA 有較高的純度。

圖1 德宏奶水牛乳腺組織總RNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of total RNA of mammary gland tissue from Dehong dairy buffalo

2.3 CD36 基因的mRNA 表達水平

由圖2 可知：高乳脂率組(H 組)的德宏奶水牛乳腺組織CD36基因mRNA 表達量極顯著高于中乳脂率組(M 組)和低乳脂率組(L 組)(P＜0.01)，M 組也極顯著高于L 組(P＜0.01)。

圖2 德宏奶水牛CD36 基因表達水平Fig.2 Expression level of CD36 gene of Dehong dairy buffalo

2.4 CD36 基因表達水平與乳脂率相關(guān)性分析

德宏奶水牛乳腺組織CD36的mRNA 表達量與乳脂率呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，Pearson 相關(guān)系數(shù)為0.906。

3 討論

乳腺是哺乳動物泌乳期合成乳汁的重要器官。乳腺腺泡是乳腺組織中主要的功能單位，其外部被毛細血管所圍繞[15]，血管中的血液可以為腺泡提供物質(zhì)和氧氣，充足的營養(yǎng)可為乳汁合成提供必要條件。乳脂作為乳汁的主要組成成分，在營養(yǎng)方面發(fā)揮著不可忽視的作用。乳脂的主要成分是甘油三酯(TG)，約占總?cè)橹康?8%。乳腺組織中乳脂合成所需的脂肪酸(FA)既可由乳腺組織合成，也可從血液中直接攝取[16]。有研究認為：乳腺上皮細胞能夠利用從血液中攝取的FA 合成TG，在FA 被攝取進入乳腺上皮細胞的過程中，需要有特定的轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用，F(xiàn)AT/CD36 就發(fā)揮著極其重要的作用[13]。張航[17]研究FA 變化對乳脂的影響時指出：添加FA 可引起乳腺上皮細胞中TG 含量增加，添加飽和長鏈脂肪酸對TG 含量的上調(diào)作用更加顯著，且乳腺組織中相關(guān)脂肪酸攝取和轉(zhuǎn)運基因(CD36)的表達量最高。本研究表明：高乳脂率組(H 組)的德宏奶水牛乳腺組織CD36基因mRNA 表達量極顯著高于中乳脂率組(M 組)和低乳脂率組(L 組)，M 組也極顯著高于L 組，說明CD36基因可能是乳脂合成過程的重要功能基因。

CD36 作為一種乳脂球膜蛋白，在乳脂球膜上存在并表達，在FA 的轉(zhuǎn)運過程中起重要作用；且在泌乳階段，CD36的mRNA 表達量有所升高。呂艷濤[18]研究顯示：過氧化物酶體增殖物激活受體α 調(diào)控靶基因CD36，其mRNA 在泌乳期的表達量明顯高于妊娠后期。母豬乳腺組織中CD36基因表達量隨泌乳逐漸升高，到泌乳高峰期時進一步升高。由此可知：在母豬泌乳過程中，F(xiàn)A 攝取與轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達不斷升高。有研究發(fā)現(xiàn)：過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)的靶基因CD36參與FA 轉(zhuǎn)運，PPARG基因敲除小鼠試驗表明：PPARγ缺失導致TG 合成減少，這是由于負責FA 轉(zhuǎn)運的FA 轉(zhuǎn)運體CD36基因以及其他相關(guān)基因的mRNA 表達量下調(diào)所致[19]。許會芬[20]通過siRNA 介導的干擾技術(shù)對乙酰CoA 合成酶短鏈家族成員2 及ATP 檸檬酸裂解酶基因進行共同干擾，將siRNA 轉(zhuǎn)染至山羊原代乳腺上皮細胞后，細胞內(nèi)參與脂質(zhì)合成代謝的相關(guān)基因(如CD36)的表達量明顯下調(diào)，且脂滴沉積減少，TG 含量也有所降低。綜上所述，CD36基因的mRNA 表達可以促進TG 合成，進而可能提高乳質(zhì)量，但是CD36基因調(diào)控乳脂合成的機制還需要進一步研究。

4 結(jié)論

高乳脂率組(H 組)的德宏奶水牛乳腺組織CD36基因mRNA 表達量極顯著高于中乳脂率組(M 組)和低乳脂率組(L 組)，M 組也極顯著高于L 組。CD36基因的mRNA 表達水平與乳脂率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，該基因的表達對德宏奶水牛乳質(zhì)量的提高可能有顯著作用。研究結(jié)果可為乳脂合成機制的研究提供科學依據(jù)。