程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法對(duì)云南元江稻屬資源秈粳分化的比較研究*

陳 越，付 堅(jiān)，張敦宇，李婷婷 ，陳 玲

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650205)

普通野生稻 (Oryza ruipogonGriff.) 的基因組為AA，是栽培稻的祖先近緣種，在長(zhǎng)期野外惡劣環(huán)境中蘊(yùn)含著如抗病、抗蟲(chóng)和抗各種非生物逆境等諸多優(yōu)良性狀，是維系稻種資源種質(zhì)創(chuàng)新的重要資源庫(kù)[1-2]。云南元江普通野生稻生長(zhǎng)在海拔780 m 的高原，且在其原生境保護(hù)點(diǎn)周?chē)? km范圍內(nèi)從未發(fā)現(xiàn)和種植任何稻種資源，是現(xiàn)存世界上分布海拔最高、保存最完整、最原始的普通野生稻居群之一[3-4]。亞洲栽培稻由普通野生稻進(jìn)化而來(lái)，秈粳分化是亞洲栽培稻分化的主流。秈、粳稻是在自然和人工雙重選擇壓力下經(jīng)歷漫長(zhǎng)歷史過(guò)程演化形成的在基因組及形態(tài)性狀都發(fā)生深刻變化的2個(gè)亞種[5-6]。栽培稻的秈粳亞種分別從已分化的普通野生稻獨(dú)立演化而來(lái)，即普通野生稻在演化成栽培稻之前就已經(jīng)發(fā)生了秈粳分化，因此，探究普通野生稻及其滲入系后代的秈粳屬性及分化程度是研究栽培稻秈粳亞種起源的基礎(chǔ)[1,7-9]。

鑒定稻屬資源秈粳屬性通常采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子標(biāo)記分類(lèi)法。形態(tài)學(xué)鑒定主要采用程侃聲等[10-11]在前人基礎(chǔ)上建立的以秈粳亞種間具有明顯差別且易于觀測(cè)的6個(gè)形態(tài)性狀(稃毛、酚反應(yīng)、第1～2 穗節(jié)間長(zhǎng)、抽穗時(shí)殼色、葉毛及谷粒長(zhǎng)寬比)為主要指標(biāo)的“程式指數(shù)法”，是廣泛應(yīng)用于育種及農(nóng)業(yè)實(shí)踐生產(chǎn)的秈粳鑒定方法。近年來(lái)，越來(lái)越多的分子標(biāo)記被應(yīng)用于稻屬資源的秈粳分類(lèi)研究，但早期使用較多的SSR[12]、RFLP[13]、RAPD[14]及ILP[15]等均不是針對(duì)秈、粳稻在DNA水平上的差異而設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記，故秈粳分類(lèi)的準(zhǔn)確性不高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，LU 等[16]根據(jù)秈稻9 311 和粳稻日本晴基因組序列比對(duì)而設(shè)計(jì)出可區(qū)分秈粳類(lèi)型的InDel 分子標(biāo)記，在秈粳鑒定方面具有擴(kuò)增效果好、穩(wěn)定性高、擴(kuò)增產(chǎn)物分離效果明顯和操作簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)，該標(biāo)記不僅可以定性秈粳屬性，還可以精準(zhǔn)地量化秈粳分化程度。自上世紀(jì)80 年代以來(lái)，王象坤等[7]、陳成斌等[17]、李小湘等[18]及董軼博[19]已先后對(duì)中國(guó)主要普通野生稻居群的秈粳屬性進(jìn)行了鑒定，但有關(guān)原始性較高的云南元江普通野生稻秈粳屬性的報(bào)道相對(duì)較少，且這些報(bào)道大多僅采取單一的鑒定方法進(jìn)行秈粳分類(lèi)，鮮有同時(shí)采用2 種分類(lèi)方法對(duì)云南元江普通野生稻及其滲入系后代資源的秈粳鑒定報(bào)道。本研究首次同時(shí)從表觀形態(tài)學(xué)和分子水平探討云南元江普通野生稻及其滲入系后代的粳秈類(lèi)型，對(duì)普通野生稻秈粳遺傳背景的深入研究以及探索普通野生稻在栽培稻起源演化、遺傳分化和育種應(yīng)用等具有重要意義，同時(shí)也為充分發(fā)掘利用普通野生稻及其滲入系后代奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料共計(jì)356 份，包括合系35 號(hào)1 份、云南元江普通野生稻1 份及其滲入系代表材料354 份 (編號(hào)為YN1～YN354)。滲入系代表材料由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所以云南元江普通野生稻為父本、合系35 號(hào)為母本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，經(jīng)胚挽救成苗后回交2 次、自交15 次，同時(shí)結(jié)合染色體原位雜交技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)獲得4 006 份滲入系材料，從中通過(guò)田間篩選淘汰性狀不穩(wěn)定及綜合性狀較差的材料后最終獲得。以粳稻日本晴和秈稻9311 作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 材料種植

普通野生稻種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉溪市元江基地普通野生稻保護(hù)圃。滲入系和合系35 號(hào)種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所易門(mén)實(shí)驗(yàn)基地，于2019 年3 月播種，5 月單穴單苗移栽，每份材料種植4 行，每行10 株，行株距為20 cm×25 cm，田間水肥管理與當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)一致。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

按照程侃聲等[10-11]的“程式指數(shù)法”，每份資源標(biāo)記中間行生長(zhǎng)狀態(tài)一致的5 株，抽穗期調(diào)查其主穗抽穗時(shí)殼色和葉毛，成熟時(shí)取各株的主穗帶回實(shí)驗(yàn)室調(diào)查其稃毛、酚反應(yīng)、第1 和第2 穗節(jié)間長(zhǎng)及谷粒長(zhǎng)寬比等指標(biāo)。

1.2.3 InDel 分子標(biāo)記鑒定

基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增：于分蘗盛期采集356 份材料及對(duì)照品種的劍葉葉片，參照陳越等[5]的方法提取DNA 及PCR 擴(kuò)增。

InDel 引物篩選：以普通野生稻、合系35 號(hào)及兩者滲入系后代中表型差異較大的20 份材料與粳稻日本晴和秈稻9311 全基因組DNA 序列比對(duì)獲得的45 對(duì)InDel 分子標(biāo)記[16]進(jìn)行篩選，最終篩選出36 對(duì)用于秈粳鑒定 (表1)。這36 對(duì)InDel 標(biāo)記均勻分布于水稻的12 條染色體，且在云南元江普通野生稻、合系35 號(hào)以及表型差異較大的20 份滲入系后代材料中均帶型清晰、容易判讀、無(wú)雜帶。

表1 用于云南元江稻屬資源秈粳鑒定的InDel 分子標(biāo)記Tab.1 InDel molecular markers used to identify indica-japonica of Oryza L.resources in Yuanjiang,Yunnan Province

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

程式指數(shù)法以稃毛、酚反應(yīng)、第1～2 穗節(jié)間長(zhǎng)、抽穗時(shí)殼色、葉毛及谷粒長(zhǎng)寬比等6個(gè)性狀的綜合分值判斷356 份資源的粳秈屬性，總積分≤8 為秈型、9～13 為偏秈型、14～18 為偏粳型、＞18 為粳型 (表2)。

表2 程氏指數(shù)法鑒別稻屬資源秈粳屬性的性狀及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Identification of indica-japonica characteristics of Oryza L.resources and scoring standard by Cheng’s index

InDel 分子標(biāo)記法以粳稻日本晴和秈稻9311擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型為標(biāo)準(zhǔn)，條帶統(tǒng)計(jì)及秈、粳型基因頻率的計(jì)算方法參考陳越等[5]的報(bào)道；按照LU等[16]的方法計(jì)算并統(tǒng)計(jì)356 份稻屬資源在36 對(duì)InDel 分子標(biāo)記的秈型或粳型基因頻率；按照表3中InDel 分子標(biāo)記秈粳屬性的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)劃分稻屬資源的秈粳類(lèi)別。

表3 按照基因頻率鑒定秈稻或粳稻的InDel 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 InDel classification standards based on indica or japonica gene frequencies

2 結(jié)果與分析

2.1 稻屬資源的程式指數(shù)法鑒定結(jié)果

由圖1、2 可知：程式指數(shù)法的6 項(xiàng)指標(biāo)在普通野生稻、合系35 號(hào)及來(lái)自同一親本材料的滲入系后代之間差異明顯。按照程式指數(shù)法的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表2)分別統(tǒng)計(jì)356 份稻屬資源的分值并對(duì)其秈粳類(lèi)型進(jìn)行劃分，結(jié)果顯示：普通野生稻6項(xiàng)指標(biāo)的總分值為11 分，屬偏秈型；合系35 號(hào)的總分值為24 分，為粳型；在354 份滲入系后代資源中有秈型179 份，占所有后代材料的50.56%；偏秈型76 份，占21.47%；粳型25 份，占7.06%；偏粳型74 份，占20.90%。程式指數(shù)法的鑒定結(jié)果表明：354 份普通野生稻與合系35 號(hào)雜交得到滲入系后代資源的秈粳分化明顯，但大部分后代材料以秈型稻(秈型和偏秈型)資源為主。

圖1 云南元江普通野生稻和合系35 號(hào)的程式指數(shù)法6個(gè)指標(biāo)形態(tài)比較Fig.1 Comparison of the six indexes of the Cheng’s index of Oryza rufipogon in Yuanjiang,Yunnan Province and Hexi 35

2.2 稻屬資源的InDel 分子指數(shù)法鑒定結(jié)果

篩選出的36 對(duì)引物均具有較好的秈粳特異性，356 份稻屬資源均能擴(kuò)增出1 條與日本晴/9311位置一致的帶型，或2 條位置分別與日本晴和9311 一致的雜合帶型。部分稻屬資源引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。親本資源普通野生稻和合系35 號(hào)的秈粳類(lèi)型分別為偏粳型和典型粳稻，其秈型、粳型基因頻率依次為0.32、0.68 和0.04、0.96。由普通野生稻的PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果可知：在36 對(duì)InDel標(biāo)記中，R1M30、R1M37、R1M47、R2M26、R2M37、R3M23、R3M53、R4M13、R4M17、R4M30、R6M14、R6M44、R7M7、R8M33、R9M10、R9M42、R10M17、R10M30、R10M40、R11M23、R12M27 和R12M43 等22 對(duì)標(biāo)記擴(kuò)增出純合粳型基因型帶型，R1M7、R1M20、R2M10、R2M50、R3M10、R4M43、R5M13、R8M23 和R8M46 等9 對(duì)標(biāo)記擴(kuò)增出純合秈型基因型帶型，而R4M13、R4M50、R7M20、R9M20 和R11M40等5 對(duì)引物則擴(kuò)增出秈—粳雜合基因型帶型，說(shuō)明普通野生稻已發(fā)生一定程度的秈粳分化。

圖3 InDel 引物R1M47 擴(kuò)增22 份云南元江普通野生稻滲入系的多態(tài)性Fig.3 InDel primer R1M47 amplified polymorphisms of 22 introgression lines of O.rufipogon in Yuanjiang,Yunnan Province

InDel 分子標(biāo)記所劃分的7 種秈粳類(lèi)型在354份滲入系后代中均有出現(xiàn)，其中典型秈稻113 份、秈稻84 份、偏秈36 份、中間類(lèi)型29 份、偏粳21 份、粳稻24 份和典型粳稻47 份，普通野生稻滲入系資源中含有秈型血緣的秈型稻數(shù)量最多(233 份)，表明354 份滲入系資源秈粳分化明顯，但大部分資源以秈型稻為主。

2.3 程式指數(shù)法與InDel 分子指數(shù)法對(duì)稻屬資源秈粳分類(lèi)的比較分析

圖2 部分云南元江普通野生稻滲入系資源的程式指數(shù)法的指標(biāo)形態(tài)比較Fig.2 Comparison index patterns of the Cheng’s index for some introgression lines of O.rufipogon in Yuanjiang,Yunnan Province

除普通野生稻和26 份滲入系后代外，其他稻屬資源經(jīng)2 種秈粳鑒定方法得到的結(jié)果基本一致。程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法分別將普通野生稻劃分為偏秈和偏粳；在鑒定結(jié)果不一致的26 份滲入系后代中，YN351、YN343、YN334 和YN344 經(jīng)程式指數(shù)法分別鑒定為粳稻、秈稻、秈稻和秈稻，而InDel 分子指數(shù)法則將這些資源分別劃分為典型秈稻、粳稻、偏粳和偏粳；YN33、YN45、YN56、YN83、YN84、YN91、YN92、YN104、YN105、YN109、YN116、YN123、YN126、YN129、YN208、YN211、YN214、YN293、YN338、YN340、YN348 和YN354 等22 份資源經(jīng)2 種方法鑒定后劃分的秈粳類(lèi)型也都存在不同程度的差異。由此可見(jiàn)，程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法的擬合度較高，可達(dá)92.42%，進(jìn)一步表明這2 種秈粳屬性的鑒定方法都具有較高的準(zhǔn)確性。2 種秈粳分類(lèi)方法均在354 份滲入系后代中鑒定出較多的秈型稻資源，其中，程式指數(shù)法鑒定出秈型稻(秈稻和偏秈) 255 份(占所有后代資源的72.03%)，In-Del 分子指數(shù)法鑒定出秈型稻(典型秈稻、秈稻和偏秈) 233 份(占所有后代資源的65.82%)，表明在滲入系后代資源中以帶有秈型血緣的資源為主。

3 討論

栽培稻的秈粳分化是栽培稻經(jīng)歷漫長(zhǎng)歷史演化后形成的2 類(lèi)在農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、表觀形態(tài)以及基因組水平上均存在較大差異的栽培稻類(lèi)型[6,20]。稻屬資源的秈粳鑒定通常采用形態(tài)學(xué)鑒定和DNA水平上的分子標(biāo)記法。目前，形態(tài)學(xué)鑒定主要采用經(jīng)典的程式指數(shù)法，該法大多適用于遺傳背景相對(duì)簡(jiǎn)單的秈型或粳型材料鑒定，具有觀測(cè)和鑒別簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)育種生產(chǎn)上應(yīng)用較為廣泛的傳統(tǒng)方法，但此法對(duì)操作者要求較高，需要具有一定經(jīng)驗(yàn)才能準(zhǔn)確判斷調(diào)查對(duì)象的秈粳屬性[20]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，SSR、RAPD、RFLP 和ILP 等分子標(biāo)記成為稻屬資源秈粳分類(lèi)的有效方法，但這些標(biāo)記并非根據(jù)秈稻和粳稻的差異而設(shè)計(jì)，極大影響了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[6,12-15]。隨著粳稻日本晴和秈稻9311 全基因組測(cè)序的完成，針對(duì)秈、粳稻基因組序列的特異性差異而設(shè)計(jì)的InDel 標(biāo)記為稻屬資源的秈粳鑒定提供了成熟、準(zhǔn)確的方法，該方法不僅可以準(zhǔn)確、高效地鑒定秈粳類(lèi)型，還可以精準(zhǔn)地計(jì)算秈粳分化程度[21-22]。王友林等[6]、李小湘等[18]和劉丹等[23]先后驗(yàn)證了InDel 標(biāo)記在偏秈、偏粳、滲入大量亞種片段的中間型栽培稻、稻屬的野生種及近緣種等遺傳背景復(fù)雜資源秈粳屬性鑒定的準(zhǔn)確性。程式指數(shù)法是根據(jù)研究對(duì)象6個(gè)形態(tài)指標(biāo)的綜合分值將其分為秈型、偏秈型、偏粳型和粳型等4 種類(lèi)型；而InDel 分子標(biāo)記則根據(jù)研究對(duì)象的秈、粳基因頻率將其進(jìn)一步劃分為7 種類(lèi)型(典型秈稻、秈稻、偏秈、中間型、偏粳、粳稻及典型粳稻)。本研究采用程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法同時(shí)對(duì)356 份稻屬資源的秈粳類(lèi)別進(jìn)行鑒定，除遺傳背景較為復(fù)雜、原始性較強(qiáng)的云南元江普通野生稻和極少部分滲入系后代外，其他329 份稻屬資源經(jīng)2 種秈粳鑒定方法所劃分的秈粳類(lèi)別基本一致，擬合度高達(dá)92.42%，證實(shí)了程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法在鑒定稻屬資源秈粳屬性上均具有較高的可靠性。此外，InDel 分子指數(shù)法鑒定秈粳屬性時(shí)僅需小部分葉片即可分析，鑒定過(guò)程不需要經(jīng)歷完整的水稻生育期，受外界環(huán)境影響不大；而程式指數(shù)法比較簡(jiǎn)便、易于觀測(cè)，可廣泛應(yīng)用于田間大規(guī)模水稻選育工作。

普通野生稻(O.ruipogonGriff.)是栽培稻的重要野生祖先種，具有極其豐富的變異類(lèi)型和基因資源，是所有野生稻中研究和育種利用較為廣泛和成熟的資源，普通野生稻在水稻起源進(jìn)化、遺傳分化、分類(lèi)、重要基因發(fā)掘及維系稻種資源多樣性等方面具有重要地位[6-9]。近年來(lái)，中國(guó)主要普通野生稻居群秈粳分化研究工作相繼展開(kāi)。李小湘等[18]以38 對(duì)InDel 秈粳特異性標(biāo)記對(duì)江永普通野生稻3個(gè)不同年份(1982 年、2008 年及2017 年)樣本的秈粳屬性及秈粳分化程度進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明：江永普通野生稻居群大部分屬于粳稻，少數(shù)屬偏粳型，且隨著年份的增加粳稻逐漸向偏粳型分化。陳芬等[24]對(duì)174 份粵北普通野生稻的SSR 秈粳特異性鑒定表明：除2 份粵北普通野生稻資源為偏秈外，其余172 份資源均為偏粳型。崔瑩瑩等[14]和尹昭坤等[25]先后用22 對(duì)SSR 引物和ITS 序列克隆測(cè)序技術(shù)對(duì)海南普通野生稻居群的秈粳類(lèi)型進(jìn)行劃分，結(jié)果表明：海南普通野生稻存在一定的秈粳分化。袁平榮等[26]、孫傳清等[27]及李亞莉等[4]先后采用RFLP標(biāo)記、形態(tài)特征、同工酶和親和性及SSR 標(biāo)記對(duì)云南元江普通野生稻的秈粳進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：云南元江普通野生稻居群比較純且原始，已經(jīng)發(fā)生了秈粳分化但不明顯，部分群體偏粳。本研究分別采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法對(duì)云南元江普通野生稻、合系35 號(hào)及兩者雜交得到的354 份滲入系后代的秈粳屬性進(jìn)行分析，程式指數(shù)法將普通野生稻劃分為偏秈，而InDel 分子指數(shù)法則根據(jù)各個(gè)InDel 位點(diǎn)上的條帶位置和秈、粳基因頻率將其劃分為偏粳，此結(jié)果與袁平榮等[26]以形態(tài)特征和同工酶分析得到的結(jié)果相似。本研究中普通野生稻經(jīng)程式指數(shù)法鑒定為偏秈而InDel 分子標(biāo)記則將其劃分為偏粳，其原因可能是普通野生稻秈粳分化不明顯，在形態(tài)上部分表型性狀秈粳分化進(jìn)度不一致，但2 種秈粳屬性的鑒定結(jié)果均表明普通野生稻中既有粳型血緣也有秈型血緣，充分體現(xiàn)了云南元江普通野生稻的原始性和分化不徹底性。

本研究中，程式指數(shù)法鑒定普通野生稻6 項(xiàng)指標(biāo)的總分值為11 分，屬偏秈型，合系35 號(hào)總分值為24 分，屬粳型；而InDel 分子指數(shù)法鑒定出的普通野生稻和合系35 號(hào)的秈型基因頻率分別為0.32 和0.04，被劃分為偏粳和典型粳稻?？梢?jiàn)，在2 種親本材料中秈型成分較少。而在354份滲入系后代中，經(jīng)2 種秈粳鑒定分類(lèi)的結(jié)果均是帶有秈型血緣的材料居多，其原因可能與354份滲入系資源有關(guān)。這354 份滲入系是從普通野生稻和合系35 號(hào)雜交得到的4 006 份資源中經(jīng)多年田間調(diào)查篩選后留下的綜合性狀較優(yōu)、遺傳穩(wěn)定的滲入系代表材料，即這些材料都經(jīng)過(guò)人工選擇，所以才有了親本秈型成分不多但含有較多秈型材料后代的結(jié)果。

4 結(jié)論

云南元江普通野生稻已發(fā)生秈粳分化，其形態(tài)學(xué)特征偏秈，但I(xiàn)nDel 分子指數(shù)法鑒定出的結(jié)果總體偏粳，充分說(shuō)明普通野生稻的原始性和分化不徹底性。程式指數(shù)法和InDel 分子指數(shù)法對(duì)其滲入系后代的秈粳鑒定結(jié)果基本一致，擬合度高達(dá)92.42%，其滲入系后代材料的秈粳分化明顯，且以帶有秈型血緣的材料居多，此結(jié)果與雜交后代篩選時(shí)的人工選擇有關(guān)。