內(nèi)標(biāo)法測(cè)定動(dòng)物肉中脂肪酸組成及含量

張春華　寶　華　張崇志　李勝利　特日格勒　金　鹿　薩初拉　王海明　畢力格巴圖　孫海洲

內(nèi)標(biāo)法測(cè)定動(dòng)物肉中脂肪酸組成及含量

張春華寶華張崇志李勝利特日格勒金鹿薩初拉王海明畢力格巴圖孫海洲

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院內(nèi)蒙古呼和浩特010031）

試驗(yàn)通過(guò)GC2030氣相色譜儀，利用100 m長(zhǎng)的SP-2560毛細(xì)管色譜柱，采用內(nèi)標(biāo)法定量定性分析山羊肉中脂肪酸組成及含量。結(jié)果顯示，此方法簡(jiǎn)便、快捷，加入的內(nèi)標(biāo)C11與待測(cè)樣品組分中的C11相似或相近時(shí)間出峰，線(xiàn)性范圍好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 0以上，回收率為84.33%～91.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在5%左右。

內(nèi)標(biāo)法；氣相色譜法；肉樣脂肪酸；組成；含量

內(nèi)蒙古是我國(guó)重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，盛產(chǎn)牛羊肉。隨著生活水平的不斷提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，人們對(duì)肉質(zhì)鮮嫩適口，富含人體所需蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和氨基酸的優(yōu)質(zhì)肉品需求越來(lái)越高。因此，研究者越來(lái)越關(guān)注畜產(chǎn)品的品質(zhì)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)山羊肉樣品進(jìn)行水解、脂肪提取、脂肪皂化和甲酯化，最后上機(jī)測(cè)定肉中脂肪酸組成及含量，為進(jìn)一步研究肉、乳脂肪酸含量的測(cè)定提供有效方法和理論數(shù)據(jù)[1-2]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：島津氣相色譜儀（型號(hào)：GC2030）、FID檢測(cè)器、全自動(dòng)進(jìn)樣器、100 m×0.25 μm×0.2 nm的SP2560毛細(xì)管柱（賽默飛世爾公司提供）。

試驗(yàn)試劑：高純氮?dú)猓∟2，純度99.99%）、37種脂肪酸混標(biāo)（SIGMA公司提供）、水（符合GB/T 6682中規(guī)定的一級(jí)水）、無(wú)水乙醇色譜試劑、無(wú)水乙醚色譜試劑、鹽酸、CH3OH（色譜純）、正庚烷（色譜純）、三氟化硼甲醇（色譜純）、NaOH（分析純）、NaCl、無(wú)水Na2SO4、C11內(nèi)標(biāo)（SIGMA公司提供）。

1.2 儀器條件

氣相色譜儀采取程序升溫法進(jìn)行設(shè)置，初始溫度100 ℃，保持5 min，以3 ℃/min的速度升溫到240 ℃，保持35 min；進(jìn)樣口溫度240 ℃，檢測(cè)器溫度240 ℃；載氣為高純N2；分流比值20∶1；每次自動(dòng)進(jìn)樣1 μm。

1.3 樣品的前處理

1.3.1 樣品稱(chēng)取與水解

使用感量0.1 mg的天平稱(chēng)取山羊肉樣品2 g或2 g以?xún)?nèi)放入平底燒瓶中，加入備好的內(nèi)標(biāo)2 mL，再加2 mL95%的乙醇，繼續(xù)加配制濃度為8.3 mol/L的鹽酸10 mL，混勻。將平底燒瓶放入85 ℃水浴鍋內(nèi)水浴40 min，其間振蕩幾次，之后室溫冷卻備用。

1.3.2 脂肪的提取

向水解好的備樣中加入10 mL95%的乙醇，混勻。將平底燒瓶中的水解液全部轉(zhuǎn)移到250 mL的分液漏斗中，再將100 mL乙醚和石油醚1∶1的混合液分3次倒入分液漏斗中，加蓋，繼續(xù)搖晃數(shù)次混勻。靜置分層30 min后，棄去分液漏斗下層溶液，上層醚層經(jīng)塞含無(wú)水Na2SO4棉花的大漏斗過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移至250 mL平底燒瓶中，再用30 mL乙醚和石油醚1∶1的混合液沖洗分液漏斗，再轉(zhuǎn)移至平底燒瓶中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，平底燒瓶中剩下的殘留物為脂肪提取物。

1.3.3 脂肪的皂化和甲酯化

向上步提取物中加入10 mL濃度為2%的氫氧化鈉甲醇溶液，放入回流冷凝裝置的水浴鍋中，90 ℃水浴回流30 min。冷凝回流大概25 min時(shí)，從冷凝管上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液，再加2 mL甲醇，繼續(xù)回流幾分鐘后取下回收瓶冷卻。再加10 mL正庚烷，手搖振蕩3 min～5 min，加飽和NaCl至瓶頸，放入超聲儀中超聲10 min后取出靜放，等待分層。分層后，用裝有無(wú)水Na2SO4的一次性注射器吸取上層正庚烷層液體1 mL左右，用濾膜將溶液過(guò)濾后放入樣瓶中備用。

1.3.4 脂肪酸混標(biāo)的配置

將37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)配制成4個(gè)不同濃度待測(cè)，分別為0.15 mg/mL、0.35 mg/mL、0.6 mg/mL和0.8 mg/mL。

1.3.5 試樣中脂肪酸含量的計(jì)算

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.27—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定》[3]，計(jì)算試樣中的脂肪酸含量。

1.4 樣品的回收率測(cè)定

已知含量的待測(cè)樣中加入已配好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繼續(xù)上機(jī)檢測(cè)，再計(jì)算回收率?；厥章?（待測(cè)混合樣測(cè)定值/原樣濃度+標(biāo)準(zhǔn)品加入量）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

將配制好的不同濃度的37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)上機(jī)后，根據(jù)每種脂肪酸甲酯氣相色譜圖的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖出峰的保留時(shí)間為依據(jù)，對(duì)未知樣品中測(cè)定出的脂肪酸進(jìn)行定性，以碳十一烷酸（C11:0）內(nèi)標(biāo)峰面積定量分析未知樣品中脂肪酸的相對(duì)含量。脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖如圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以配制好的37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度為軸，峰面積為軸，制作37條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行回歸計(jì)算。圖2為其中短鏈C4:0和長(zhǎng)鏈C22:6n3的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，回歸方程分別為：=3E-06-0.005 9，2=0.999 5；=9E-07+0.001 1，2=0.999 3。

圖2　脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.3 回收率的測(cè)定

樣品的回收率測(cè)定值如表1，從表1中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，樣品的回收率測(cè)定值均在84%以上。

表1樣品的回收率測(cè)定值

組分原樣濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入量/mg/mL混合樣實(shí)測(cè)值/mg/mL回收率/%`x±RSD%123123123 C11:00.010 10.008 00.004 00.002 00.017 00.012 70.010 293.7490.1584.1989.73±5.40 C12:00.020 60.016 00.008 00.004 00.034 40.026 10.020 993.9091.1785.0790.05±5.02 C13:00.010 40.008 00.004 00.002 00.017 40.013 40.010 794.7992.7986.6291.40±4.66 C14:00.021 10.016 00.008 00.004 00.035 10.026 60.022 394.6391.5088.8691.66±3.15 C14:10.010 10.008 00.004 00.002 00.016 70.013 00.010 492.2291.8585.9590.01±3.95 C15:00.010 60.008 00.004 00.002 00.017 50.013 50.010 994.2692.5186.3191.03±4.59 C15:10.010 40.008 00.004 00.002 00.017 60.013 40.010 795.6192.8685.9291.46±5.46 C16:00.027 40.016 00.008 00.004 00.038 90.031 10.026 089.5987.9582.8686.80±4.03 C16:10.010 00.008 00.004 00.002 00.016 90.012 90.010 393.9091.8185.9990.57±4.53 C17:00.009 50.008 00.004 00.002 00.015 70.011 80.009 689.8687.6783.3586.96±3.81

續(xù)表1樣品的回收率測(cè)定值

組分原樣濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入量/mg/mL混合樣實(shí)測(cè)值/mg/mL回收率/%`x±RSD%123123123 C18:00.018 10.016 00.008 00.004 00.030 80.023 20.018 590.2788.9583.5787.60±4.05 C18:1n9c0.018 20.016 00.008 00.004 00.031 00.023 10.018 690.7487.9883.7887.50±4.01 C18:2n6t0.010 50.008 00.004 00.002 00.017 50.013 30.010 694.7591.5584.8490.38±5.60 C18:2n6c0.009 30.008 00.004 00.002 00.015 60.011 50.009 590.1286.7583.9586.94±3.55 C20:00.018 70.016 00.008 00.004 00.031 70.023 80.019 091.4589.2483.7888.16±4.48 C18:3n60.009 50.008 00.004 00.002 00.015 80.011 90.009 690.5287.8783.2687.22±4.21 C20:10.009 40.008 00.004 00.002 00.015 80.011 90.009 690.9688.9383.9187.93±4.13 C21:00.010 00.008 00.004 00.002 00.016 30.012 40.010 090.4988.9182.9587.45±4.55 C20:20.009 60.008 00.004 00.002 00.015 80.012 00.009 789.8688.1883.2687.10±3.94 C22:00.018 80.016 00.008 00.004 00.031 50.023 60.019 190.5687.9483.7587.42±3.93 C22:1n90.009 40.008 00.004 00.002 00.015 60.011 80.009 589.8088.3983.5087.23±3.79 C20:3n60.009 00.008 00.004 00.002 00.015 10.011 30.009 088.5987.1881.9285.90±4.09 C22:20.009 40.008 00.004 00.002 00.015 70.011 60.009 589.9686.3983.3986.58±3.80 C24:00.018 70.016 00.008 00.004 00.031 60.023 80.019 191.0789.1584.2288.15±4.01 C20:5n30.010 00.008 00.004 00.002 00.016 90.012 80.010 393.8091.1185.5690.16±4.66 C24:10.009 60.008 00.004 00.002 00.016 00.012 00.009 690.9387.8983.0287.28±4.57 C22:6n30.010 00.008 00.004 00.002 00.016 30.012 50.010 290.7589.1484.6088.16±3.62

2.4 山羊肉中脂肪酸組成及含量

肉樣脂肪酸組成及含量測(cè)定結(jié)果如表2。由表2可見(jiàn)，肉樣中股二頭肌、背最長(zhǎng)肌、臂三頭肌不同部位的脂肪酸含量差異不顯著（>0.05）?？偛伙柡椭舅崤c飽和脂肪酸（U/S）的比值范圍為1.35～1.50，多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸（P/S）的比值范圍為0.20～0.28，這與陳雪軍等（2008）研究的月齡對(duì)湖羊脂肪酸的影響[4]結(jié)果一致。

表2肉樣脂肪酸組成及含量測(cè)定結(jié)果

脂肪酸肉樣 化學(xué)名分子式臂三頭肌背最長(zhǎng)肌股二頭肌 十二碳酸C12:00.150.130.14 十四碳酸C14:01.231.671.33 順-9-十四碳一烯酸C14:10.120.140.12 十五碳酸C15:00.350.470.28 順-10-十五碳一烯酸C15:10.670.580.78 十六碳酸C16:020.1921.3719.95 順-9-十六碳一烯酸C16:11.651.971.75 十七碳酸C17:00.901.181.11 十七碳一烯酸C17:10.821.050.97 十八碳酸C18:015.5516.1816.37 反-9-十八碳一烯酸C18:1n9t1.251.751.32 順-9-十八碳一烯酸C18:1n9c47.0142.6442.58 反,反-9,12-十八碳二烯酸C18:2n6t0.100.060.08 順,順-9,12-十八碳二烯酸C18:2n6c3.474.145.56 順,順,順-9,12,15-十八碳三烯酸C18:3n60.130.130.16 順,順,順-6,9,12-十八碳三烯酸C18:3n31.181.471.76 二十碳酸C20:00.380.080.19 順-11-二十碳一烯酸C20:10.150.120.14 順,順-11,14-二十碳二烯酸C20:20.130.070.09

續(xù)表2肉樣脂肪酸組成及含量測(cè)定結(jié)果

脂肪酸肉樣 化學(xué)名分子式臂三頭肌背最長(zhǎng)肌股二頭肌 順,順,順-8,11,14-二十碳三烯酸C20:3n60.230.240.33 順,順,順-11,14,17-二十碳三烯酸C20:3n30.170.150.24 順,順,順,順-5,8,11,14-二十碳四烯酸C20:4n61.171.281.37 全順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸C20:5n30.920.971.44 二十一碳酸C21:00.490.680.06 二十二碳酸C22:00.630.760.98 順-13-二十二碳一烯酸C22:1n90.160.160.08 順,順-13,16-二十二碳二烯酸C22:20.090.070.08 全順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸C22:6n30.370.380.48 二十四碳酸C24:00.090.070.25 二十四碳一烯酸C24:10.090.040.09 單不飽和脂肪酸MUFA（%） 52.1648.4547.83 多不飽和脂肪酸PUFA（%） 8.128.9611.51 不飽和/飽和U/S（%） 1.501.351.46 多不飽和/飽和P/S（%） 0.200.210.28

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

2000年前后，37種脂肪酸的測(cè)定儀器也是氣相色譜儀，但所使用的柱子有填充柱和石英柱[5-6]等。隨著科學(xué)的發(fā)展和儀器設(shè)備的轉(zhuǎn)型升級(jí)，以及氣相色譜技術(shù)的迅猛發(fā)展，現(xiàn)在主要使用不同長(zhǎng)度的毛細(xì)管柱來(lái)測(cè)定脂肪酸組成及含量。因?yàn)槊?xì)管柱子長(zhǎng)、柱效高，大大彌補(bǔ)了其他柱子分離能力較差的缺點(diǎn)，很容易分離結(jié)構(gòu)復(fù)雜的混合物成分，尤其適用于脂肪酸同分異構(gòu)體的分離。本試驗(yàn)采用以聚100%二氰丙基硅氧烷為固定相的SP-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）毛細(xì)管色譜柱，每個(gè)脂肪酸分離出來(lái)的峰較清晰，效果較好。

3.2 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的比較

37種脂肪酸的測(cè)定有內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法兩種。鄭玉梅等（2002）測(cè)定奶油中c9，t11-共軛亞油酸含量時(shí)，是用十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)定量分析的[7]。張春華等（2012）采用外標(biāo)法，利用GC2014氣相色譜儀測(cè)定動(dòng)物肉脂肪酸組成[8]。過(guò)去，用外標(biāo)法測(cè)定脂肪酸是用面積歸一化法來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，系統(tǒng)誤差較大，而內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是較好地克服了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的系統(tǒng)誤差。本研究是以C11為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定動(dòng)物肉中脂肪酸的組成及含量，結(jié)果表明，第十碳以上的長(zhǎng)鏈脂肪酸分離的線(xiàn)性范圍好，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 0以上，回收率為84.33%～91.66%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%左右[9]。

4 結(jié)語(yǔ)

脂肪酸的甲酯化步驟及使用的藥品有很多種[8]。下一步繼續(xù)開(kāi)展肉、乳脂肪酸測(cè)定試驗(yàn)時(shí)，有必要采用張春華等[8]（2012）的研究中提到的脂肪酸前處理中不同的甲酯化步驟做對(duì)比，比較測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步篩選出脂肪酸甲酯化方法的優(yōu)劣。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.02.21

TS251.7

A

2095-1205(2022)02-66-04

2022年內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2022CXJJM14）；2020年內(nèi)蒙古自然基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（2020LH03019）；2021年內(nèi)蒙古自治區(qū)留學(xué)回區(qū)人員創(chuàng)新啟動(dòng)支持計(jì)劃項(xiàng)目

張春華（1978- ），女，蒙古族，內(nèi)蒙古通遼人，博士，副研究員，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。

孫海洲（1971- ），男，蒙古族，內(nèi)蒙古烏海人，博士，研究員、博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控理論研究。