市政污水氧化溝處理工藝對人類致病菌群落組成的影響以南京市某污水處理廠為例
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吳璟涵，劉鵬，張徐祥，任洪強

(污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

介水傳染病是由于飲用或接觸受病原體污染的水而引起的一類傳染病，其病原體主要包括細(xì)菌、病毒、原生動物等[1]。近年來，全球范圍內(nèi)介水傳染病的暴發(fā)已經(jīng)嚴(yán)重危害各國人民生命健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，介水傳染病每年造成220多萬人死亡[1-2]。市政污水處理廠作為城市水循環(huán)的重要節(jié)點，既通過污水管網(wǎng)承接城市污水，又將處理后的污水排放進(jìn)入自然水體，是人類致病菌(Human pathogenic bacteria，HPB)傳播的重要源和匯。

以活性污泥為代表的生化處理工藝是市政污水處理廠的核心，是污水中有機質(zhì)和營養(yǎng)鹽去除的關(guān)鍵單元。隨著高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于污水和污泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解析[3]，生化處理工藝在塑造污水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)尤其是HPB群落結(jié)構(gòu)中的作用得到越來越多關(guān)注。污水中微生物種類繁多[4]，包括志賀氏菌[5]、銅綠假單胞菌[6]、沙門氏菌[7]、結(jié)核桿菌[8]、糞腸球菌[9]、鮑氏不動桿菌[10]等多種常見HPB，形成了復(fù)雜的HPB群落結(jié)構(gòu)。Ye等[11]利用454焦磷酸測序技術(shù)在來自4個國家14座市政污水處理廠中污泥、進(jìn)水、出水中檢測到34個不同屬的HPB。研究同時發(fā)現(xiàn)，部分HPB在生化處理前后的進(jìn)水和出水樣品中豐度相差較大，如弓形菌屬在進(jìn)水中相對豐度較高，而弧菌屬在出水中相對豐度較高。Li等[12]通過宏基因組學(xué)方法在香港某污水處理廠中檢測到113種HPB，其中79種在該污水處理廠首次檢測出，而活性污泥工藝對HPB的總體去除率達(dá)到98%，但不同種類的HPB去除效果存在較大差異。Huang等[13]利用454焦磷酸測序技術(shù)在某污水處理廠中檢測了243種潛在致病菌，活性污泥工藝顯著降低了污水HPB群落的多樣性。

氧化溝處理工藝是一種常見的活性污泥法變形工藝，具有工藝簡單，運行靈活，管理方便，成本較低的特點，被廣泛運用于中小型污水處理廠[14]，但氧化溝處理工藝對污水HPB群落組成的影響卻鮮有報道[15]?，F(xiàn)選擇南京市某采用氧化溝處理工藝的城市污水處理廠為研究對象，采集2016年1— 12月份污水處理廠的進(jìn)水、污泥和生化處理出水樣品，基于16S rRNA基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增和高通量測序技術(shù)，通過致病菌數(shù)據(jù)庫比對的方法解析了HPB群落組成特征，并研究了生化處理過程中水質(zhì)理化指標(biāo)與HPB群落組成的相關(guān)性，從而有助于加深對污水處理系統(tǒng)HPB群落的動態(tài)變化規(guī)律的理解，為氧化溝處理工藝去除HPB提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇南京市某城市污水處理廠為研究對象，該污水處理廠除收集生活組團的污水外，同時處理部分工業(yè)企業(yè)污水，日處理水量約為4.5萬m3。該污水處理廠主體工藝采用改進(jìn)型三槽式氧化溝為生化處理工藝，水力停留時間為18.3 h，污泥齡為18.1 d。于2016年1—12月，每月采集該污水處理廠進(jìn)水、活性污泥與生化處理出水樣品。使用無菌聚乙烯桶采集進(jìn)水樣品200 mL和生化處理出水樣品20 L，使用50 mL無菌離心管采集活性污泥樣品，并立即以1∶1(V/V)比例將污泥樣品與無水乙醇混合，以固定生物質(zhì)。將上述樣品置于冰上并運送至實驗室保存于-20 ℃冰箱。

1.2 水質(zhì)理化指標(biāo)測定

1.3 樣品總DNA提取、PCR擴增與高通量測序

進(jìn)水和生化處理出水樣品分別經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，以富集生物質(zhì)用于總DNA提取。采用FastDNA SPIN試劑盒[安倍醫(yī)療器械貿(mào)易(上海)有限公司]提取樣品總DNA，并采用NanoDrop?ND-2000超微量紫外分光光度計(美國基因有限公司)測定總DNA的濃度與純度。

總DNA樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，擴增16S rRNA基因v4可變區(qū)，采用Hiseq 2500平臺進(jìn)行高通量測序，測序策略為PE250。

1.4 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析采用QIIME2平臺進(jìn)行。首先，采用DADA2對原始測序序列降噪和去除冗余序列，得到擴增子序列變異(amplicon sequence variant, ASV)。其次，選擇每個ASV代表序列，采用Blast方法比對包括128種人類致病菌16S rRNA基因全長序列的數(shù)據(jù)庫，比對閾值E設(shè)置為10-3，將序列相似度超過97%的ASV鑒定為潛在HPB。最后，HPB的相對豐度和某一樣品中HPB總相對豐度按照公式(1)和(2)[16]計算：

(1)

(2)

式中：Ai——某一樣品中某一HPB的相對豐度；NHPB-like sequence——比對上的某HPB的序列條數(shù)；

N16S sequence——樣品中微生物總序列條數(shù)；AT——某一樣品中HPB的總相對豐度；n——某一樣品中對應(yīng)檢出的HPB群落數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計分析

采用R語言中vegan包進(jìn)行HPB群落與水質(zhì)指標(biāo)的冗余分析(RDA)，并通過計算Spearman系數(shù)反映HPB群落豐度與水質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性，Spearman相關(guān)性系數(shù)絕對值|r|>0.80且P<0.05，即認(rèn)為具有顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 污水處理廠的水質(zhì)理化指標(biāo)

污水處理廠在2016年1—12月，進(jìn)水水質(zhì)呈現(xiàn)一定波動，但生化處理出水水質(zhì)較為穩(wěn)定，均符合《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 18918—2002)中一級A排放標(biāo)準(zhǔn)，水質(zhì)理化指標(biāo)情況見表1。

表1 污水處理廠進(jìn)水、生化處理出水水質(zhì)理化指標(biāo)

2.2 進(jìn)水、污泥和生化處理出水中HPB檢出種類數(shù)量與總相對豐度

利用基于16S rRNA基因的高通量測序技術(shù)，在所有進(jìn)水、污泥和生化處理出水樣品中共檢測出28種HPB群落。3種樣品中HPB檢出種類數(shù)量與總相對豐度的年內(nèi)變化見圖1(a)(b)。通過與數(shù)據(jù)庫中128種潛在HPB的信息對比發(fā)現(xiàn)，進(jìn)水、生化處理出水中HPB的檢出種類數(shù)量較為平穩(wěn)，基本穩(wěn)定在14 ～ 20種。污泥中HPB的檢出種類數(shù)量變化較大，冬、春季節(jié)較少，其中1，3月最少，檢出12種；夏、秋季節(jié)較多，其中9月最多，檢出23種。

同時，進(jìn)水和生化處理出水中HPB的總相對豐度變化不大，平均值為3%左右。而污泥中HPB的含量隨季節(jié)的變化差異明顯，2月污泥中HPB總相對豐度最低，為1.7%，5月最高，為15.1%。此外，污泥中HPB的總相對豐度普遍比進(jìn)水、生化處理出水要高，顯示出活性污泥對HPB具有一定的吸附、蓄積潛力。

圖1 進(jìn)水、污泥和生化處理出水中HPB檢出種類數(shù)量與總相對豐度的年內(nèi)變化

2.3 進(jìn)水、污泥和生化處理出水中HPB群落組成

本研究共檢出28種HPB，檢出類型與年內(nèi)相對豐度變化見圖2，相對豐度值已通過對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。其中，共有6種HPB在所有月份的進(jìn)水、污泥和生化處理出水中均有檢出且具有較高的相對豐度，分別是鮑氏志賀菌(Shigellaboydii)(0.01%～0.28%)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)(0.05%～1.25%)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(0.15%～2.46%)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)(0.01%～0.31%)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(0.07%～3.54%)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)(0.22%～9.80%)。這6種HPB在市政污水[17]與湖泊[18]、河流[19]等自然水體中均多有報道，是水環(huán)境中常見的HPB。

圖2 進(jìn)水、污泥和生化處理出水中HPB組成的年內(nèi)變化

在上述6種HPB中，鮑氏志賀菌、糞腸球菌和鮑氏不動桿菌均呈現(xiàn)污泥中相對豐度高于進(jìn)水和生化處理出水的分布特征，表明這3種HPB環(huán)境存活能力較強，具有在活性污泥中富集的潛力。腸道沙門氏菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌則在進(jìn)水中相對豐度較高，經(jīng)氧化溝工藝去除后，活性污泥和生化處理出水中相對豐度則均出現(xiàn)下降。

由圖1可見，5和9月的進(jìn)水與生化處理出水樣品檢出的HPB種類個數(shù)相同，但對比發(fā)現(xiàn)，2類樣品中檢出的HPB種類并不完全相同。首先，在5月的樣品中，巴頓氏菌(Bartonellahenselae)、布魯氏菌(Brucellasuis)、白喉桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)在進(jìn)水中檢出，經(jīng)過氧化溝生化處理后，未在出水中檢出。而產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjeikeium)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)只在生化處理出水樣品中檢出。其次，在9月的樣品中，流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)在進(jìn)水中檢出，經(jīng)過氧化溝生化處理后，未在生化處理出水中檢出。而蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)只在生化處理出水中檢出。2個月份中不同的HPB種類并無重合，說明不同季節(jié)進(jìn)水的多變性和復(fù)雜性往往直接影響生化處理的效果以及出水中的HPB群落變化。

同時，在生化處理出水中，HPB的相對豐度還表現(xiàn)出一定的月份差異。糞腸球菌在4—7月，其相對豐度達(dá)到1.5% ～ 3.5%，遠(yuǎn)超出年度平均值1.0%。而某些HPB則在秋、冬季節(jié)的生化處理出水中相對豐度較高。鮑氏志賀菌在9—11月，相對豐度分別為0.08% ～ 0.13%，也高于年內(nèi)其余月份的相對豐度。結(jié)核分枝桿菌則在8—10月相對豐度較高。此外，鮑氏不動桿菌在4—5月，以及8—11月出現(xiàn)了2個高相對豐度的時間段。

在生化處理出水中，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、鮑氏志賀菌(Shigellaboydii)、脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)、副百日咳博德特菌(Bordetellaparapertussis)等10種HPB在超過6個月的樣品中檢出。此外，還有5種HPB僅在少數(shù)月份的生化處理出水中檢出，主要包括多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjeikeium)等。

2.4 生化處理出水理化指標(biāo)與HPB群落組成的相關(guān)性

圖3 生化處理出水理化指標(biāo)與HPB群落組成的冗余分析

表2 出水HPB豐度與理化指標(biāo)的Spearman相關(guān)性系數(shù)

3 結(jié)論

(1)進(jìn)水、生化處理出水中HPB的檢出種類數(shù)量較為平穩(wěn)，總相對豐度變化不大。污泥中HPB的檢出種類數(shù)量變化較大，夏、秋季多于冬、春季；HPB總相對豐度隨季節(jié)變化有明顯差異，2月總相對豐度最低，5月最高。污泥中HPB的總相對豐度普遍高于進(jìn)水、生化處理出水。

(2)進(jìn)水、污泥、生化處理出水3種樣品中檢出的HPB具有相似性。其中，優(yōu)勢HPB包括鮑氏志賀菌、腸道沙門氏菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核桿菌、糞腸球菌和鮑氏不動桿菌。