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    典型水環(huán)境介質中整合酶基因分布特征研究

    2022-04-06 10:17:02李紫涵張徐祥任洪強
    環(huán)境監(jiān)控與預警 2022年2期
    關鍵詞:飲用水典型水產

    李紫涵,張徐祥,任洪強

    (污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京大學環(huán)境學院,江蘇 南京 210023)

    0 前言

    整合子是一種攜帶多種耐藥基因并能夠使其在不同細菌間進行水平轉移的可移動遺傳元件[1],主要由整合酶基因(Integrase gene,intI)和可攜帶耐藥基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)的基因盒2部分組成[2-3]。據文獻報道,目前至少有9類整合酶基因[4],有研究表明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因和耐藥基因的關系最密切[5]。

    由于人類生產生活的影響,大量整合子和耐藥基因進入水環(huán)境[6-7]。醫(yī)療廢水被認為是污水處理廠和自然環(huán)境中人為釋放整合子和耐藥基因的主要來源,含高濃度抗生素與抑菌劑的水體為耐藥細菌、可移動遺傳元件和耐藥基因提供了選擇性環(huán)境[8-9]。生活污水則是整合子和耐藥基因排放到自然水體中的主要途徑,污水處理設施中高密度、多種類的細菌環(huán)境成為了整合子及其攜帶的耐藥基因的巨型反應器[10]。由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用,水產養(yǎng)殖廢水分離菌株亦被檢測出含有整合酶基因[11-12]。飲用水是與人體健康息息相關的極為重要的水體環(huán)境,已有報道發(fā)現飲用水攜帶Ⅰ、Ⅱ類整合子[13],而Ⅲ類整合子少有文獻報道。

    目前對水環(huán)境介質中整合酶基因的檢測大多集中于用熒光實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)擴增整合酶基因的特定片段[7, 14-16],該方法對樣品濃度和整合酶基因豐度有一定要求,引物的選擇也會影響整合酶基因的檢測結果。宏基因組測序技術可以全面地對不同環(huán)境樣品進行針對性分析,近年來,宏基因組測序技術也運用到整合酶基因的檢測中[7, 17],其主要依賴整合子數據庫,如INTEGRALL[18-19]?,F選取4種典型水環(huán)境介質:飲用水、生活污水、水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水,通過宏基因組高通量數據與數據庫比對的方法對數據庫中已有的多種整合酶基因同時進行比對,全面地檢測樣品中的整合酶基因和ARGs的種類,分析不同種類整合酶基因的多樣性及均勻度特征,并采用多元統(tǒng)計分析方法揭示水環(huán)境介質中整合酶基因和ARGs豐度的相關性。從而有助于識別水環(huán)境中ARGs的水平轉移風險,為水環(huán)境中ARGs的有效控制提供科學依據。

    1 材料與方法

    1.1 宏基因組數據收集

    選擇4種典型水環(huán)境介質(飲用水、生活污水、水產養(yǎng)殖廢水及醫(yī)療廢水)作為研究對象。

    飲用水樣品分別采集自上海、蘇州、無錫、南京、蕪湖、安慶、九江、武漢、岳陽、荊州、萬州、重慶12個城市的自來水管網;生活污水樣品采集自中國東部某城市的2個生活污水處理廠的進、出水口及活性污泥工藝段。采集得到的樣品使用FastDNA SPIN試劑盒提取樣品總DNA并送至生工生物工程(上海)有限公司進行宏基因組測序,測序平臺為Hiseq 2500。

    水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水數據下載自美國國家生物技術信息中心(NCBI)的序列讀取存檔(Sequence Read Archive,SRA)平臺,上傳時間為2017—2019年。樣品宏基因組數據信息見表1。

    表1 4種典型水環(huán)境樣品的宏基因組高通量測序數據的基本信息

    1.2 生物信息分析流程

    (1)數據格式轉化。水產養(yǎng)殖廢水、醫(yī)療廢水數據下載自NCBI的SRA平臺,使用sratoolkit工具包中fastq-dump工具將下載的SRA數據轉換為fastq文件。

    (2)雙端測序數據質量控制。為確保數據分析的準確性,采用fastp軟件對下載數據和SRA轉化數據進行質量控制,得到最終的高質量序列。

    1.3 整合酶基因注釋

    (1)數據庫構建。整合酶基因數據庫選用INTEGRALL數據庫(http://integrall.bio.ua.pt/),包含整合酶基因1 498條及基因盒8 562條。

    (2)數據庫比對結果篩選。將質控后的fastq文件轉化為fasta文件與下載到本地的INTEGRALL數據庫進行BLAST比對,比對軟件為BLAST 2.2.7,比對條件:E-value≤ 10-5,num_alignments為1。

    (3)整合酶基因注釋。按相似性≥90%、比對長度≥50%篩選比對結果,將篩選后的BLAST比對結果與INTEGRALL數據庫中整合酶基因列表進行再次比對,保留注釋結果為整合酶基因的條目。

    1.4 ARGs注釋

    ARGs數據庫比對選用耐藥基因分析工具ARGs-OAP v2.0[20],該數據庫包含24個ARGs類型、1 208個抗性亞型、12 307條ARGs參考序列。比對共有2個步驟:(1)對高通量數據進行比對及過濾,以E-value≤10-7,相似度≥80%為過濾條件輸出meta-data文件;(2)使用SARGfam數據庫,將ARGs基因進行定性定量分析和types及subtypes分類。

    根據公式(1)、(2)計算出整合酶基因及ARGs絕對豐度[21]。

    (1)

    (2)

    式中:CAbundance——基因絕對豐度;n——屬于某ARGs類型的映射ARGs參考序列的數量;NARG-like sequence——注釋到某特定ARGs參考序列的類ARGs序列的數量;Lreads——該類ARGs reads的長度;LARG reference sequence——對應的特定ARGs參考序列的序列長度;Ncell number——細胞數;N16S sequence——16S rRNA基因序列的數量;L16S sequence——16S rRNA基因的全長;m——根據提取的超可變區(qū)域信息,從宏基因組數據檢測出的總類群;Mi——CopyRighter數據庫中分類單元i的拷貝數;ai——宏基因組數據集中分類單元i的豐度;A——所有m分類群的總豐度。

    1.5 數據分析

    使用SPSS軟件對整合酶基因和ARGs豐度相關性進行Pearson檢驗,顯著性分析則選用雙側檢驗并標記顯著性相關關系,判斷不同典型水環(huán)境介質中,不同種類整合酶基因和24個類型ARGs相關性關系,當r≥0.6且P<0.05時,認為結果具有統(tǒng)計學意義。為分析不同典型水環(huán)境介質中整合酶基因豐度和類型的多樣性,使用R語言中vegan包對整合酶基因進行alpha多樣性分析,計算其Shannon-wiener多樣性指數和Pielou均勻度指數。Vegan包和ggplot2包還被用于分析與繪制Bray-Cutis距離下4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因相似性,并使用多元方差分析(Adonis)、相似性分析(ANOSIM)和多響應置換過程分析(MRPP)3種統(tǒng)計學方法對其組間與組內差異進行顯著性檢驗。

    2 結果與分析

    2.1 典型水環(huán)境介質中整合酶基因豐度分析

    將4種典型水環(huán)境高通量數據與整合子數據庫INTEGRALL進行比對及結果篩選,各類整合酶基因的檢出率見表2。intI1和intI3基因在4種水環(huán)境介質中均有檢出。除飲用水外,intI2在其他3種水環(huán)境介質樣品中部分檢出,分別為生活污水26.7%(8/30個),水產養(yǎng)殖廢水4.8%(1/21個)、醫(yī)療廢水41.7%(10/24個)。

    表2 4種典型水環(huán)境介質中各類整合酶基因檢出率 %

    4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因總豐度見圖1,圖中*為P<0.05;**為P<0.01。由圖1可見,生活污水、水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水中整合酶基因相對豐度顯著大于飲用水整合酶基因(P<0.05),生活污水相對豐度顯著大于水產養(yǎng)殖廢水(P<0.05),而其與醫(yī)療廢水和水產養(yǎng)殖廢水的整合酶基因相對豐度無顯著性差異(P>0.05)。生活污水的整合酶基因在30個樣品中分布最為集中,相對豐度為2.23×10-2~6.31×10-1copy/cell,有研究表明生活污水中整合酶基因豐度變化受時間的影響較小[22]。醫(yī)療廢水中整合酶基因相對豐度最低為7.43×10-3copy/cell,最高為1.34 copy/cell,顯著高于飲用水(P<0.05),但與生活污水和水產養(yǎng)殖廢水中整合酶基因相對豐度無顯著性差異(P>0.05)。水產養(yǎng)殖廢水的整合酶基因相對豐度為1.64×10-3~2.11×10-1copy/cell,介于生活污水和飲用水之間。飲用水中整合酶基因相對豐度雖在4種水環(huán)境介質中最低(P<0.05),為2.47×10-4~1.40×10-1copy/cell,但其分布范圍廣,在采樣的12個城市飲用水管網末梢均有檢出。

    圖1 4種典型水環(huán)境介質中整合酶相對豐度

    4種典型水環(huán)境介質中各類整合酶基因相對豐度見圖2(a)(b)(c)(d),除文獻中已明確報道的intI1—intI9外,將數據庫比對結果中未分類的整合酶基因統(tǒng)一歸為“others”。

    圖2 4種典型水環(huán)境介質中各類整合酶基因相對豐度

    由圖2可知,4種典型水環(huán)境介質中intI1的檢出率和相對豐度均高于其他種類整合酶基因。intI2在生活污水和醫(yī)療廢水中相對豐度分別為1.74×10-4~4.27×10-3copy/cell和2.80×10-4~1.31×10-1copy/cell,只在一個水產養(yǎng)殖廢水樣品中檢測出intI2基因,飲用水樣品中未檢測出intI2基因。intI3在生活污水、水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水中豐度分別為6.48×10-5~6.60×10-2,3.51×10-5~3.59×10-5和5.05×10-5~1.59×10-2copy/cell,僅在1個飲用水樣品中檢測出intI3基因,其相對豐度為2.13×10-5copy/cell。intI9基因也在生活污水、水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水中檢出。intI6基因僅在1個醫(yī)療廢水樣品中檢測出。intI1和intI2基因在醫(yī)療廢水中平均豐度最高,生活污水次之,而intI3和intI9在生活污水中平均豐度最高,醫(yī)療廢水次之。

    2.2 典型水環(huán)境介質中整合酶基因多樣性及均勻度分析

    4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因種類多樣性及均勻度相關性分析結果見圖3(a)(b),圖中*為P<0.05;**為P<0.01。Shannon-Wiener指數用于表征整合酶基因組成的豐富程度,指數越大,表明該種水環(huán)境介質中整合酶基因的多樣性越高[23]。Pielou指數用于表征環(huán)境中不同基因分布的均勻程度(Species evenness)[24-25],Pielou指數越高,表明環(huán)境中各類整合酶基因豐度越接近,均勻度越大。

    圖3 4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因種類多樣性及均勻度

    由圖3(a)可見,4種典型水環(huán)境介質兩兩之間Shannon-Wiener指數均有顯著性差異(P<0.05),醫(yī)療廢水中含intI1、intI2、intI3、intI6和intI9共5種整合酶基因,多樣性最高,其次是生活污水,水產養(yǎng)殖廢水整合酶基因多樣性顯著大于飲用水。由圖3(b)可見,4種典型水環(huán)境介質中,醫(yī)療廢水均勻度最大,說明醫(yī)療廢水中各類整合酶基因的分布較為平均,飲用水的Pielou指數最小,生活污水和水產養(yǎng)殖廢水均勻度指數無顯著性差異。綜上所述,4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因多樣性大小為:醫(yī)療廢水>生活污水>水產養(yǎng)殖廢水>飲用水;均勻度大小為:醫(yī)療廢水>水產養(yǎng)殖廢水、生活污水>飲用水。

    2.3 典型水環(huán)境介質中整合酶基因組成相似性分析

    為探討4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因組成的相似性,對111個樣品進行主坐標分析(PCoA),結果見圖4。Bray-Cutis距離是根據均一化豐度表定量度量基因組成差異的距離計算方式。由圖4可見,在Bray-Cutis距離下,生活污水整合酶基因豐度和飲用水差異較大,與水產養(yǎng)殖廢水的相似性較高,飲用水、水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水的整合酶基因差異性小,即這3種水環(huán)境的整合酶基因豐度及組成結構的相似性較高。通過Adonis、ANOSIM、MRPP 3種統(tǒng)計方法對Bray-Cutis距離下4種水環(huán)境整合酶基因組成的組間差異進行顯著性檢驗,結果見表3。Adonis利用距離矩陣對總方差進行分解,常用于分析不同分組因素對樣品差異的解釋度,r2越大時,分組方案對差異的解釋度越高,表3中Adonis的r2=0.261,說明整體上4種典型水環(huán)境整合酶基因的組成有顯著性差異(P<0.001)。ANOSIM是一種非參數檢驗,主要用于比較組內和組間差異的大小,r值趨近1時,組間差異大于組內差異,r值趨近-1時,組內差異大于組間差異。MRPP是另一種基于組內和組間差異的置換檢驗,當Expected δ>Observed δ時,組間差異大于組內差異。表3中,ANOSIM的r=0.305,MRPP的Expected δ=0.686>Observed δ=0.576,說明4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因的組成有顯著性差異,且組間差異大于組內差異(P<0.001)。

    圖4 4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因組成基于Bray-Cutis距離的PCoA分析

    表3 Bray-Cutis距離下3種統(tǒng)計方法對4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因組成的顯著性檢驗

    2.4 典型水環(huán)境介質中整合酶基因與ARGs相關性分析

    水環(huán)境介質中intI1基因與磺胺類、大環(huán)內酯-林肯酰胺-鏈陽霉素、四環(huán)素類、氯霉素和甲氧芐氨嘧啶5類抗生素耐藥基因豐度具有強相關性(r≥0.6且P<0.05);intI2基因與磺胺類抗生素耐藥基因豐度具有強相關性(r≥0.6且P<0.05);intI3基因與18種抗生素耐藥基因豐度均為弱相關或無相關性(r<0.4)。

    對4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因豐度和抗生素耐藥基因豐度相關性分別進行分析,結果見圖5。由圖5可見,飲用水中I類整合酶基因intI1豐度與氨基糖苷類和磺胺類耐藥基因豐度呈顯著相關。由于磺胺類耐藥基因是I類整合子3′保守末端的組成部分,因此氨基糖苷類耐藥基因可能是飲用水中I類整合子基因盒中的常見ARGs。Adesoji等[26]研究發(fā)現飲用水中分離的假單胞菌intI1基因盒內含有2種抗氨基糖苷類耐藥基因(aadA1和aadA2)和一種抗磺胺類耐藥基因(sul1),胡亞茹等[27]也發(fā)現飲用水水源地中intI1與磺胺類耐藥基因sul1、sul2存在正相關關系,認為intI1在磺胺類ARGs的水平轉移過程中起到了重要作用,與本研究分析結果一致。

    生活污水中intI1基因與磺胺類、氯霉素、β-內酰胺類、氨基糖苷類等15種抗生素耐藥基因顯著相關,Harnisz等[28]用實時熒光定量(qPCR)方法檢測17個污水處理廠的污水樣品中ARGs和intI1基因豐度,發(fā)現intI1基因與磺胺類sul1、β-內酰胺類blaTEM、氨基糖苷類aac(6′)-lb-cr、大環(huán)內酯類ermF和四環(huán)素類tet(A)基因具有良好的正相關性(Spearman相關系數r= 0.69~0.83,P<0.05),An等[29]在污水樣品I類整合子基因盒克隆文庫中檢測出氯霉素catB8基因、β-內酰胺類blaOXA-101基因、氨基糖苷類aadA2基因、甲氧芐氨嘧啶drfA14基因等。生活污水中intI2基因與博來霉素、大環(huán)內酯-林肯酰胺-鏈陽霉素和四環(huán)素耐藥基因顯著相關,有文獻還發(fā)現Ⅱ類整合子可與I類整合子攜帶相同基因盒,且I類整合子的整合酶基因可能協助Ⅱ類整合子基因盒內ARGs表達[30]。intI3基因與比對出的18種耐藥基因均無顯著相關性。生活污水中攜帶耐藥基因盒的主要為I類整合子和Ⅱ類整合子。

    水產養(yǎng)殖廢水中intI1、intI2、intI3基因與18種耐藥基因均無顯著相關,僅有intI1與喹諾酮(r= 0.462,P<0.05)、利福霉素(r= 0.442,P<0.05)和四環(huán)素(r=0.439,P<0.05)呈中等相關。

    醫(yī)療廢水中intI1與磺胺類、氨基糖苷類、β-內酰胺類、甲氧芐氨嘧啶、大環(huán)內酯-林肯酰胺-鏈陽霉素和四環(huán)素類6種抗生素耐藥基因豐度呈顯著相關(r>0.6,P<0.05)。intI2與磺胺類、氨基糖苷類、β-內酰胺類和甲氧芐氨嘧啶4種抗生素耐藥基因顯著相關(r>0.6,P<0.05),有文獻發(fā)現Ⅱ類整合子基因盒中攜帶drfA1、aadA1、blaCARB-4、catB2、ereA、sat2等耐藥基因,其中抗甲氧芐氨嘧啶類、氨基糖苷類和鏈陽霉素(dfrA1-sat2-aadA1)耐藥基因盒最為常見[31-32]。intI3與喹諾酮、膦胺霉素、春日霉素和多粘菌素4種耐藥基因有顯著相關性(r> 0.6,P<0.05)。

    近年來,有關Ⅲ類整合子基因盒攜帶耐藥基因的報道較少,Elizabeth、Yamamoto等[33-34]分別在分離菌株發(fā)現1株基因盒中攜帶blaCTX-M的Ⅲ類整合子和1株攜帶aacA31-fosE-blaIMP-1的Ⅲ類整合子,本研究中氨基糖苷類和β-內酰胺類耐藥基因與intI3的相關性系數分別為0.22和0.30(P>0.05),無顯著相關關系,可能是由于Ⅲ類整合子基因盒中大多為功能基因,如insB、iroB、glpK等,而耐藥基因攜帶的數量和種類有限,無法從豐度上顯示其相關關系。

    圖5 4種水環(huán)境介質中3種整合酶基因與各類ARGs豐度的Pearson相關性

    3 結論

    (1)在4種典型水環(huán)境介質中檢測出intI1、intI2、intI3、intI6和intI9共5種已明確分類的整合酶基因,整合酶基因相對豐度為:生活污水>水產養(yǎng)殖廢水>飲用水,且醫(yī)療廢水>飲用水;多樣性為:醫(yī)療廢水>生活污水>水產養(yǎng)殖廢水>飲用水;均勻度為:醫(yī)療廢水>水產養(yǎng)殖廢水、生活污水>飲用水,生活污水與水產養(yǎng)殖廢水的均勻度無顯著性差異。

    (2)在Bray-Cutis距離下進行主成分分析,結果表明4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因的組成有顯著性差異(P<0.001),且組間差異大于組內差異(Expected δ = 0.686>Observed δ = 0.576)。生活污水和飲用水中整合酶基因的組成差異性最大,而生活污水和水產養(yǎng)殖廢水中整合酶基因組成和豐度的相似性較高,飲用水、水產養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水中整合酶基因的相似性較高。

    (3)4種典型水環(huán)境介質中整合酶基因和ARGs豐度相關性分析結果表明,生活污水整合酶基因豐度最高,其I類整合子的基因盒攜帶磺胺類、氯霉素、β-內酰胺類、甲氧芐氨嘧啶等15種ARGs的可能性較高,Ⅱ類整合子攜帶博來霉素、大環(huán)內酯-林肯酰胺-鏈陽霉素和四環(huán)素ARGs的可能性高;醫(yī)療廢水I類整合子的基因盒中磺胺類、氨基糖苷類、β-內酰胺類、甲氧芐氨嘧啶等6種ARGs較為常見,而Ⅱ類整合子基因盒中磺胺類、氨基糖苷類、β-內酰胺類和甲氧芐氨嘧啶4種ARGs較為常見;飲用水中主要存在I類整合子,其基因盒中可能攜帶氨基糖苷類ARGs;而水產養(yǎng)殖廢水中整合子豐度較高,但與ARGs的相關性較弱,無法從數據分析上判斷其主要攜帶的ARGs類型,亟待進一步研究。

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