甘草Pht1基因家族鑒定與表達(dá)分析

張亞麗，王 楠，高 靜*，張 崗，李 鉑，顏永剛

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，西安 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，陜西咸陽 712083)

磷是植物生長發(fā)育的三大營養(yǎng)元素之一，也是磷脂和核酸的重要成分，同時(shí)參與能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)、光合作用、糖和淀粉轉(zhuǎn)運(yùn)等過程[1]。雖然土壤中總磷含量非常高，但磷元素常常與Ca2+、Fe3+、Al3+形成難溶的磷酸鹽[2]，使得植物能利用的有效磷濃度偏低，導(dǎo)致其常常處于一個(gè)低磷或者缺磷的狀態(tài)。缺磷導(dǎo)致植物過多合成花青素，葉子和莖呈現(xiàn)輕微的紫色，葉表面積和作物分蘗減少，果樹新芽和花形成率降低，葉片過早脫落從而限制植物生長[3]。為了維持正常生長發(fā)育，植物通過基因調(diào)控來應(yīng)對(duì)磷元素的匱乏，其中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為磷元素跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的直接執(zhí)行者發(fā)揮重要作用。在低磷脅迫下磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白常被誘導(dǎo)表達(dá)，幫助植物攝取土壤中磷元素并進(jìn)行再分配，從而影響一系列代謝和發(fā)育過程，最終使得植物體內(nèi)磷水平維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[4]。

自第一個(gè)具有高親和力的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PHO84[5]從酵母(Saecharomyeescerevisiae)中分離得到后，相繼在一些高等植物中鑒定出了許多具有磷轉(zhuǎn)運(yùn)能力的基因，如易可可等[6]在水稻(Oryzasativa)中首次克隆了一種耐磷饑餓的轉(zhuǎn)錄因子基因OsPTF1。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依據(jù)亞細(xì)胞定位和功能的不同分為5個(gè)家族：Pht1、Pht2、Pht3、Pht4和PHO家族，其中Pht1(phosphate transporter 1)主要負(fù)責(zé)植物根系磷的吸收和體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)，是目前研究最多且最為深入的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族[7]。Pht1大多是膜整合蛋白，其大小相似，約為58 kD，含520～550個(gè)氨基酸殘基。Pht1家族蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)有高度相似性，GGDYPLSATIMSE為其特征性保守序列，Pht1在結(jié)構(gòu)上屬于MFS超家族的第9分支，該超家族可以通過化學(xué)滲透勢梯度來運(yùn)輸糖、離子、抗生素、氨基酸等各種溶質(zhì)分子，為高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在低磷或缺磷環(huán)境中一般被誘導(dǎo)表達(dá)而發(fā)揮重要的作用[8]。

目前，多個(gè)編碼Pht1的基因已經(jīng)在水稻[9]、大麥(Hordeumvulgare)[10]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[11]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[12]、番茄(Lycopersiconesculentum)[13]、蘋果(Maluspumila)[14]等植物中得到了鑒定。其中對(duì)于擬南芥和水稻在低磷脅迫下Pht1的分子機(jī)制研究較為清楚，多數(shù)AtPht1在根和芽中表達(dá)，AtPht1;1和AtPht1;4在根與土壤接觸面上的表皮、根毛細(xì)胞和根冠細(xì)胞中高度表達(dá)[15]。AtPht1;5在莖中和衰老葉組織中表達(dá)相對(duì)活躍，對(duì)磷從磷源到磷庫的轉(zhuǎn)運(yùn)起至關(guān)重要的作用[16]。AtPht1;6在花中高度表達(dá)，AtPht1;8和AtPht1;9在磷從根到莖的運(yùn)輸中起作用[17]。水稻中約有13個(gè)Pht1基因家族成員(OsPht1;1—1;13)，缺磷能顯著誘導(dǎo)OsPht1;2/1;4/1;8/1;9/1;10等的表達(dá)，OsPht1;2僅在主根和側(cè)根的中柱中表達(dá)，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)和積累磷[18]，OsPht1;4在根、葉、舌葉、雄蕊和穎果中均有表達(dá)，主要負(fù)責(zé)向根、莖和糙米中積累磷[19]，OsPht1;1基因的表達(dá)受菌根真菌的特異性誘導(dǎo)，不受外界磷濃度的影響[20]。此外，有研究表明Pht1基因不僅在磷脅迫下有表達(dá)，也對(duì)干旱、鹽、脫落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellic acid, GA3)具有不同的響應(yīng)，如在鹽脅迫下，馬鈴薯中StPHT1;3上調(diào)表達(dá)，StPHT1;5/1;6下調(diào)表達(dá)，GA3誘導(dǎo)StPHT1;1/1;2表達(dá)，ABA處理后StPHT1;1/1;2/1;5都下調(diào)表達(dá)[21]；青稞中PHO1;2基因在ABA處理后上調(diào)表達(dá)[22]。

甘草為豆科多年生草本植物，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅、青海等偏干旱的黃土高原地區(qū)，而這些地區(qū)降雨量少導(dǎo)致有效磷含量偏低[23]，往往限制了甘草的產(chǎn)量和品質(zhì)，磷元素短缺成為甘草種植栽培中的難題之一。因此，解析甘草中磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的生物學(xué)機(jī)理對(duì)提高甘草耐受脅迫有重要意義。本研究對(duì)甘草中Pht1家族成員進(jìn)行鑒定，并克隆GuPht1;1/1;2/1;4/1;5基因。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析GuPht1在干旱、高鹽和低磷下的表達(dá)情況，并對(duì)其在低磷、鹽、干旱、ABA、GA3處理后的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行分析，為闡述甘草磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，挖掘甘草高效磷利用率基因提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

2020年3月在新疆維吾爾自治區(qū)，烏魯木齊市采集甘草成熟種子，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)黃文靜副教授鑒定為烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)。將甘草種子用30%的過氧化氫消毒30 min，于25 ℃恒溫氣候箱中催芽萌發(fā)，挑選生長一致的幼苗移栽于水培裝置中，采用霍格蘭全營養(yǎng)液水培法進(jìn)行育苗。4周后以缺磷的霍格蘭營養(yǎng)液配制10 μmol/L KH2PO4[24]溶液模擬低磷脅迫(Low P)，霍格蘭全營養(yǎng)液配置15% PEG-6000、150 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA、100 μmol/L GA3溶液分別模擬干旱(PEG)、鹽脅迫(NaCl)和ABA、GA3處理，霍格蘭全營養(yǎng)液處理作為對(duì)照(CK)，均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理3、6、12、24 h后取甘草根、葉部分，蒸餾水洗凈后液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1GuPht1基因家族的篩選和鑒定基于Mochida等[25]發(fā)表的甘草基因組序列，構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫，從TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)[26]下載擬南芥Pht1序列，以該序列作為查詢序列進(jìn)行Blast同源序列比對(duì)，初步獲取甘草GuPht1家族成員的候選序列。運(yùn)用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)對(duì)所獲得的候選序列成員進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，去除無典型保守結(jié)構(gòu)域的基因，得到GuPht1基因家族所有基因。用ExPASy中的ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測其蛋白質(zhì)的氨基酸分子量理論等電點(diǎn)(pI)等理化性質(zhì)[27]。用TMHMM在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測甘草GuPht1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。使用在線工具Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對(duì)亞細(xì)胞定位預(yù)測分析[27]。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與氨基酸多序列比對(duì)分析從NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載水稻、密花豆(Spatholobussuberectus)、木豆(Cajanuscajan)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)序列，使用MEGA7.0軟件通過最大似然法將甘草與擬南芥、水稻、密花豆、木豆的Pht1蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000；用Clustal W比對(duì)功能和GeneDoc軟件得到甘草和擬南芥Pht1家族蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果。

1.2.3 GuPht1 Motif、三級(jí)結(jié)構(gòu)與基因Scaffold定位、順式作用元件分析使用MEME(https://meme-suite.org/ meme/tools/meme)網(wǎng)站分析甘草GuPht1蛋白的保守基序(Motif)[27]。通過PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站對(duì)GuPht1基因啟動(dòng)子上游4 000 bp的序列進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測[28]。用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線工具繪制Scaffold定位圖。使用在線工具SWISS-MODEL(https:// swiss model.expasy.org/)進(jìn)行GuPht1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4 非生物脅迫下GuPht1轉(zhuǎn)錄組分析以本課題組前期獲得的甘草在低磷、高鹽和干旱脅迫處理7 d后的莖葉、根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)[29]，使用RPKM法對(duì)reads count進(jìn)行均一化處理，以q< 0.05、|Log2FC| >1為差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從DEGs中篩選出GuPht1基因并對(duì)其做熱圖。

1.2.5 非生物脅迫及激素處理下GuPht1基因的表達(dá)分析以生物信息學(xué)方法從甘草數(shù)據(jù)庫中獲得GuPht1基因家族CDS序列，由上海生工生物工程股份有限公司(上海)設(shè)計(jì)并合成(表1)。RNA的提取用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(天根，北京)，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，用NanoDrop One 核酸蛋白濃度檢測儀(賽默飛)檢測RNA濃度與純度(OD260/OD280)。模板cDNA合成采用FastKing RT Kit (With gDNase)試劑盒(天根，北京)，qRT-PCR采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒(天根，北京)，儀器為qTOWER2.0實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(德國)。以Actin作為內(nèi)參基因[30]，反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA，上、下游引物(0.3 μmol/L)各0.6 μL，10 μL SYBR，7.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，試驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)程序結(jié)束后對(duì)熒光值變化曲線及熔解曲線進(jìn)行分析。GuPht1基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算[31]。

表1 GuPht1s基因家族實(shí)時(shí)熒光定量PCR和克隆引物序列

1.2.6GuPht1基因克隆由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成克隆引物(表1)，以甘草葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 2 μL，2×HieffTM PCR Master Mix酶(上海翊圣)10 μL。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收后送測序，根據(jù)測序結(jié)果驗(yàn)證目的基因序列的正確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GuPht1基因鑒定及生物信息學(xué)分析

利用比對(duì)分析，經(jīng)過保守結(jié)構(gòu)域確認(rèn)最終在甘草基因組中共鑒定得到8條甘草GuPht1蛋白的編碼基因，其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)見表2，氨基酸長度介于521(GuPht1;3)～570(GuPht1;8)aa之間，分子量介于57.51(GuPht1;3)～62.22(GuPht1;8) kD之間。GuPht1;1—1;7的等電點(diǎn)介于8.37～8.88之間，屬于偏堿性蛋白，GuPht1;8的等電點(diǎn)為6.33，屬于偏酸性蛋白。亞細(xì)胞定位和跨膜預(yù)測結(jié)果表明GuPht1都位于細(xì)胞膜上，且有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)氨基酸序列保守基序分析，共預(yù)測了8個(gè)Motif(圖1)。該家族成員的Motif相對(duì)保守，各成員間Motif數(shù)量差異較少。除了GuPht1;1/1;7/1;8、AtPht1;6/1;8/1;9不具有Motif 8外，其余均含有Motif 1—8。通過Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)Motif 1—2、4—5編碼Sugar_t結(jié)構(gòu)域，Motif 7編碼MFS_1結(jié)構(gòu)域，Motif 3/8編碼Transmembrane region結(jié)構(gòu)域，Motif 6功能未知(表3)。根據(jù)注釋可以發(fā)現(xiàn)GuPht1保守的特征序列GGDYPLSATIMSE屬于Motif 1，該特征序列所編碼的結(jié)構(gòu)域?yàn)镾ugar_t。

表3 GuPht1s的8個(gè)保守基序注釋

表2 GuPht1s的蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

2.2 GuPht1s氨基酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

多序列比對(duì)分析結(jié)果表明GuPht1和AtPht1的氨基酸具有高度相似性，且在GuPhtl和AtPhtl中均含有Pht1保守的特征序列GGDYPLSATIMSE(圖2)。將GuPht1與擬南芥、水稻等的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，如圖3所示(線條加粗表示自展值大于95)，GuPht1;1與AtPht1;8—1;9、OsPht1;9—1;10聚為一支，GuPht1;3/1;6與AtPht1;4/1;7聚為一支，GuPht1;2/1;4/1;5與AtPht1;5聚為一支，GuPht1;2與SsPT6、GuPht1;3與SsPT2顯示出較短的進(jìn)化距離，GuPht1;7與OsPht1;11聚為一支?？傮w上GuPht1與SsPht1、CcPht1的進(jìn)化距離較AtPht1、OsPht1短，說明甘草Pht1與豆科植物親緣關(guān)系較近。

2.3 GuPht1s三級(jí)結(jié)構(gòu)及基因Scaffold定位、順式作用元件分析

用SWISS-MODEL對(duì)GuPht1蛋白進(jìn)行建模，預(yù)測結(jié)果如圖4，A所示，GuPht1蛋白為單體，都具有12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，蛋白之間具有高度相似的空間結(jié)構(gòu)。Scafflod定位顯示GuPht1基因在Scaffold上均勻分布(圖4，B)。為分析GuPht1基因可能參與的生物學(xué)調(diào)控，對(duì)GuPht1基因的啟動(dòng)子前4 000 bp區(qū)域進(jìn)行分析。由圖5可知，GuPht1基因含有眾多順式作用元件，如啟動(dòng)子核心元件(TATA-box和CAAT-box)；調(diào)控植物生長發(fā)育的相關(guān)元件，如分生組織特異性元件(CAT-box、A-box)；光調(diào)節(jié)相關(guān)元件(AE-box、Box 4、GT1-motif、MER、GATA-motif)；3類激素相關(guān)元件：生長素(TGA-element)，茉莉酸甲酯(TGACG-motif)，赤霉素(P-box、TATC-box)等；2類與逆境脅迫相關(guān)元件：干旱(MBS、MYB、CCAAT-box)和低磷(W-box、PHO-like、P1BS和G-box)。其中GuPht1;6所含順式作用元件種類最多，并且8個(gè)GuPht1基因均含有和低磷相關(guān)的元件。

2.4 非生物脅迫下GuPht1s轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，在鹽處理后莖葉中GuPht1;2/1;4/1;6基因表達(dá)上調(diào)，GuPht1;1/1;5/1;7表達(dá)下調(diào)。GuPht1;1/1;2/1;4/1;5/1;6/1;7在干旱和低磷處理后其表達(dá)量都下調(diào)，GuPht1;1/1;5/1;8在鹽和干旱處理后其表達(dá)量在根中都上調(diào)。低磷脅迫下根中GuPht1;2/1;5/1;7表達(dá)量上調(diào)。在對(duì)照組的根中GuPht1;3/1;4/1;6的表達(dá)量顯著較莖葉中高，GuPht1;5/1;7的表達(dá)量顯著較莖葉中低。

2.5 非生物脅迫及激素處理下GuPht1s基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究GuPht1基因的功能，本研究對(duì)甘草分別進(jìn)行了非生物脅迫和激素處理，GuPht1表達(dá)結(jié)果如圖7、8所示。低磷處理后，GuPht1;1/1;6在根中3、6、12、24 h都顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，24 h時(shí)除GuPht1;2/1;4外其余基因都顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)；葉中低磷處理3、6、12、24 h后GuPht1;5/1;6都顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，GuPht1;3只在24 h后顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，GuPht1;1/1;7只在處理3、6 h后上調(diào)表達(dá)。ABA處理后根中除GuPht1;6在24 h顯著上調(diào)表達(dá)外其余基因都顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)；葉中GuPht1;5顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，GuPht1;3顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。GA3處理6、12、24 h后根中GuPht1;5顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，而其余基因都下調(diào)表達(dá)或不表達(dá)；葉中GuPht1;5在處理3、6、12、24 h后都顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，而GuPht1;2在3、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)表達(dá)。PEG處理后根中沒有顯著上調(diào)表達(dá)的基因；葉中GuPht1;5/1;2在處理3、6、12、24 h后都顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。NaCl處理后根中GuPht1;1/1;6在24 h顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，GuPht1;7/1;8在3、6、12 h后都顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)；葉中GuPht1;5在3、6、12、24 h都顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。進(jìn)一步分析得，ABA、GA3、PEG處理24 h后對(duì)甘草根中GuPht1的表達(dá)影響較其他時(shí)間明顯。

2.6 GuPht1s基因全長克隆

以甘草葉片cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的4對(duì)PCR引物對(duì)GuPht1;1/1;2/1;4/1;5進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得長度為1 562、1 618、1 625和1 616 bp的片段(圖9)，大小均與預(yù)期目的條帶一致。純化回收目的條帶，測序結(jié)果顯示成功克隆GuPht1;1/1;2/1;4/1;5基因，且分別編碼522、538、540、537個(gè)氨基酸。

3 討 論

磷是植物所必需的礦質(zhì)元素，它在核酸和磷脂、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶調(diào)控等過程中具有不同的生物學(xué)功能，植物通過磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控植物根際磷元素?cái)z取、體內(nèi)磷元素轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使得植物免受低磷脅迫的傷害[3]。本研究在甘草中鑒定出的8個(gè)GuPht1的生物信息學(xué)特征與前人研究的結(jié)果一致[32]，說明通過生信數(shù)據(jù)挖掘出的8個(gè)GuPht1基因具有可信性。甘草中的Pht1數(shù)目與其他植物相差不大，一方面說明可能在整個(gè)進(jìn)化的過程中植物對(duì)于低磷脅迫的耐受性較強(qiáng)，另外也有可能植物為適應(yīng)缺磷環(huán)境而進(jìn)化出了一套和MFS超家族中其他基因共同吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)磷元素的體系，例如磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互協(xié)同作用[33]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明Pht1在單子葉植物和雙子葉植物中的聚類沒有偏好性，這說明遠(yuǎn)在單子葉植物和雙子葉植物分離前，Pht1基因就已經(jīng)產(chǎn)生[10]。大多數(shù)GuPht1蛋白和其他植物一樣，與AtPht1蛋白存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，這些蛋白可能與AtPht1蛋白具有相似的功能。GuPht1;1與AtPht1;8—1;9聚在一起，表明GuPht1;1負(fù)責(zé)磷的攝取及地上部分與根之間磷的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可能與其他GuPht1互作[11]；GuPht1;2/1;4/1;5與AtPht1;5同源關(guān)系較近，說明GuPht1;2/1;4/1;5可能對(duì)無機(jī)磷從源到庫的分配起一定作用[16]。

Pht1作為高親和性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的代表，大多表現(xiàn)根部特異或優(yōu)勢表達(dá)的特征，且呈現(xiàn)出低磷誘導(dǎo)表達(dá)特性[34]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtPht1;1—1;5[11,16]、丹參(Salviamiltiorrhiza)Smpht1、Sm1/3/5/7/11[35]及陸地棉(Gossypiumhirsutum)GhPT6/7/15/16基因[36]在磷脅迫下的根中表達(dá)量增加，證明這類基因在植物對(duì)磷的獲取和吸收中起重要作用[37]。本研究結(jié)果顯示GuPht1;1/1;3/1;4/1;6/1;7/1;8基因受低磷脅迫后在根中上調(diào)表達(dá)，推測這些基因參與甘草磷元素的攝入[38]。其中GuPht1;6在葉中也上調(diào)表達(dá)，說明其不僅在磷的吸收過程中起作用，還可能參與磷在體內(nèi)根葉間轉(zhuǎn)運(yùn)的平衡調(diào)節(jié)[32]。總體分析表明，GuPht1在低磷下的時(shí)空表達(dá)模式具有差異性，說明它們是動(dòng)態(tài)調(diào)控的，一方面可能是不同Pht1基因?qū)Νh(huán)境中的磷濃度或缺磷時(shí)間響應(yīng)不一致所導(dǎo)致[39]，另一方面可能由于該類基因的表達(dá)不僅受磷脅迫的影響還受菌根真菌或根瘤菌的誘導(dǎo)，如大豆的GmPT8—10在受菌根侵染后其表達(dá)量增加[40]。

植物在生長發(fā)育的過程中會(huì)受到各種傷害或者脅迫，順式作用元件與反式作用因子相互作用調(diào)控基因的表達(dá)是植物抵御非生物脅迫的方法之一。MBS、MYB、W-box等順式作用元件存在于許多植物防御基因的啟動(dòng)子中，這些基因?qū)Ψ巧锩{迫做出反應(yīng)以免植物受到傷害。干旱、鹽等使得植物遭受滲透脅迫，MBS和MYB是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)，在干旱、鹽等引起的滲透脅迫相關(guān)基因的表達(dá)中起到調(diào)節(jié)作用[41]。先前有研究顯示AtPHO1可以對(duì)病原體、鹽和冷應(yīng)激作出反應(yīng)[42]，AtPHT3;1和AtPHT3;2基因在鹽脅迫條件下表達(dá)顯著上調(diào)，過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥幼苗對(duì)鹽脅迫反應(yīng)的敏感性增強(qiáng)[43]。本研究中GuPht1;1/1;5對(duì)于鹽、干旱等非生物脅迫在根和葉中都有不同程度響應(yīng)，這可能是因?yàn)镚uPht1;1/1;5基因含有MBS和MYB元件，說明這兩個(gè)基因可能在滲透脅迫中起到緩解作用。

研究表明WRKY75[44]、WRKY6[45]、WRKY42[46]、WRKY45[47]等轉(zhuǎn)錄因子可以直接和Pht1基因啟動(dòng)子上的W-box結(jié)合從而在植物磷饑餓響應(yīng)過程中發(fā)揮作用，其中WRKY6和WRKY75轉(zhuǎn)錄因子可以參與ABA、GA3等激素協(xié)同調(diào)控Pht1基因的表達(dá)[48-49]。WRKY6可以抑制PHO1基因表達(dá)，WRKY42可以正向調(diào)控Pht1和PHO1轉(zhuǎn)錄，并與葉片的衰老過程有緊密聯(lián)系。已有研究表明激素在生長、發(fā)育和脅迫響應(yīng)中起著重要作用，擬南芥中激素對(duì)磷饑餓反應(yīng)具有調(diào)控作用[50]。本研究中GuPht1;1/1;2/1;5/1;6在GA3處理后上調(diào)表達(dá)，推測這些基因?qū)A3的響應(yīng)可能依賴于W-box元件的調(diào)控作用[34]。外源添加ABA抑制了AtPHO1、AtPHO1;H1、AtPHT1;1的表達(dá)，這與2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶ABI1有關(guān)[51]，甘草根中GuPht1;2/1;3/1;4/1;7/1;8在ABA處理后也下調(diào)表達(dá)，推測這幾個(gè)基因的表達(dá)可能與涉及ABI1的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)相關(guān)，而MBS和MYB作為ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)可能對(duì)這幾個(gè)基因表達(dá)也起到調(diào)控作用。

綜上所述，本研究首次從甘草中鑒定了8個(gè)Pht1基因，并探討了其在甘草中的時(shí)空表達(dá)模式，GuPht1不僅只調(diào)控磷饑餓，也響應(yīng)非生物脅迫和激素處理。成功克隆GuPht1;1/1;2/1;4/1;5基因，分別編碼522、538、540、537個(gè)氨基酸。本實(shí)驗(yàn)為甘草Pht1基因的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)，也為Pht1基因克隆、功能驗(yàn)證等相關(guān)基因分子作用機(jī)制研究提供參考。GuPht1的表達(dá)是否受生物因素誘導(dǎo)，以及不同成員參與響應(yīng)低磷過程的機(jī)理還有待后續(xù)接種AMF進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步解析GuPht1在植物生長發(fā)育與抗逆性中的作用，并結(jié)合遺傳和分子構(gòu)建GuPht1過表達(dá)的甘草毛狀根體系研究GuPht1基因是否對(duì)次生代謝物合成有影響。