霍山石斛DhGMDS基因克隆及低溫脅迫下表達(dá)

吳麗萍，蘇興隆，王兆健，俞年軍，彭代銀,2，邢世海,2*

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，合肥 230012；2 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，合肥 230012)

霍山石斛 (Dendrobiumhuoshanense)又名米斛，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬多年生附生草本植物，莖為其主要的藥用部位，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[1]。現(xiàn)代研究表明，霍山石斛含有多糖、生物堿、酚酸、氨基酸等多種藥用成分[2-4]。其中多糖是其主要的活性成分，主要由葡萄糖、甘露糖等單糖構(gòu)成，具有抗白內(nèi)障、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝等藥理活性[5-7]。GDP-甘露糖 4,6-脫水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase,GMDS)是GDP-L-巖藻糖合成途徑中的關(guān)鍵酶，可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖，在GDP-酮-6-脫氧甘露糖3,5-表異構(gòu)酶的催化作用下，轉(zhuǎn)化成GDP-L-巖藻糖, 從而參與多糖的形成[8]。GDP-L-巖藻糖是一種廣泛存在于生物中的糖基供體和代謝中間產(chǎn)物，參與生命代謝的調(diào)節(jié)，合成工藝十分復(fù)雜[9]。有關(guān)GDP-甘露糖4，6-脫水酶基因在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、發(fā)菜(Nostocflagelliforme)及高山被孢霉(Mortierellaalpina)等[8-14]物種中已被報(bào)道，目前對(duì)DhGMDS基因的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

石斛屬多數(shù)植物對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格, 喜溫怕冷，生長適溫為18～32 ℃，一般最佳生長溫度為25 ℃， 在5 ℃以下或35 ℃以上會(huì)停止生長[15-16]。北方地區(qū)常年氣溫極低，低溫造成的冷害、凍害，嚴(yán)重影響其生存、產(chǎn)量和品質(zhì)?；羯绞鳟a(chǎn)于大別山區(qū)安徽霍山及鄰近地區(qū)，低溫不利于霍山石斛在北方的引種栽培和推廣。因此，研究霍山石斛的耐寒性，克隆霍山石斛抗性相關(guān)基因，解析其脅迫響應(yīng)和抗性機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值[17]。

本研究基于前期霍山石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)霍山石斛GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因(DhGMDS)及其啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析DhGMDS基因在霍山石斛不同部位的相對(duì)表達(dá)情況，并分析低溫(4 ℃)脅迫處理下DhGMDS基因的表達(dá)，為進(jìn)一步解析霍山石斛抗寒機(jī)制和遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與脅迫處理

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)成熟未開裂的蒴果采自安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)王家店村，由“霍山石斛非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳人”何祥林先生提供。1)前期處理。將蒴果用洗衣粉水(5 g洗衣粉加入300 mL水) 浸泡15 min，流水沖洗 30 min；置于無菌條件下，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡震蕩45 s，無菌水潤洗2次；再用體積分?jǐn)?shù)30% NaClO溶液浸泡15 min，無菌水潤洗5次；吸干蒴果表面水分，橫向切開，接種于萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2 MS，含0.2 mg·L-1NAA、30.0 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1瓊脂粉，pH 6.0)，于溫度(23±2) ℃、光照11 h·d-1、光照度1 500～2 000 Lx條件下，培養(yǎng)霍山石斛實(shí)生苗。2)低溫(4 ℃)脅迫處理。取長勢相近的一年生霍山石斛實(shí)生苗，于溫度4 ℃、光照11 h·d-1、光照度1 500～2 000 Lx條件下培養(yǎng)，處理0、24、48和72 h后分別取整株霍山石斛，清水洗凈，濾紙吸干水分，用于總RNA和gDNA的提取。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3盆霍山石斛。

1.2 方 法

1.2.1 霍山石斛總RNA及基因組DNA的提取采取Liu等[18]方法提取霍山石斛總RNA，使用FastQuant RT Kit (Tiangen Biotech，北京) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用改良的CTAB方法[19]提取霍山石斛基因組DNA。

1.2.2DhGMDS基因克隆根據(jù)課題組前期的霍山石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]及序列相似性比對(duì)結(jié)果，篩選了一個(gè)參與多糖合成途徑的編碼GDP-甘露糖 4,6-脫水酶的候選基因，命名為DhGMDS，用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成(表1)。以霍山石斛總RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA為模板，DhGMDS-F和DhGMDS-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PrimeSTAR?DNA Polymerase 25 μL，上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，模板1 μL，無菌水22 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒(Tiangen Biotech，北京)純化回收 PCR產(chǎn)物，純化后與 pMD18-T 載體過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，進(jìn)行挑斑篩選，將含有目的片段的陽性菌送生工生物工程上海股份有限公司測序。使用引物DhGMDS-F′和DhGMDS-R′，以霍山石斛基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆該基因在基因組上的全長序列，送生工生物工程上海股份有限公司測序。

1.2.3DhGMDS基因的生物信息學(xué)分析根據(jù)得到的cDNA序列，在線進(jìn)行該基因及其他同源序列的相似性比對(duì)(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測分析(http://web.expasy.org/protparam)[21]；用TMHMM在線程序 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)[22]分析該蛋白質(zhì)的可能跨膜區(qū)；利用PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)[23]預(yù)測該基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位；利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測該蛋白的二維結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)[24]進(jìn)行編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；并利用MEGA X軟件[25](neighbor-joining，鄰位相連法) 構(gòu)建該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4DhGMDS基因啟動(dòng)子的克隆和元件功能分析利用Primer 5.0設(shè)計(jì)Genome Walking特異引物SP1、SP2和SP3(表1)，使用染色體步移試劑盒(Genome Walking Kit, TaKaRa公司)克隆DhGMDS啟動(dòng)子。PCR反應(yīng)體系：染色體步移三輪PCR模板依次為霍山石斛基因組DNA、第一輪PCR產(chǎn)物(稀釋100倍)、第二輪PCR產(chǎn)物(稀釋100倍)1.0 μL、dNTPs (2.5 mmol·L-1) 8.0 μL、10 × LA PCR 緩沖液5 μL、TaKaRa LA Taq 0.5 μL、AP2 (100 μmol·L-1) 1.0 μL和SP(10 μmol·L-1) 1.0 μL；ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)充到50 μL。將每輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取第三輪得到的特異片段，膠回收試劑盒回收純化片段；再將目的片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化、測序。采用數(shù)據(jù)庫(http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)[26]分析預(yù)測順式作用元件。

表1 霍山石斛 DhGMDS 基因分析所需引物

1.2.5DhGMDS基因的qRT-PCR表達(dá)分析分別提取霍山石斛根、莖、葉、花各組織的RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用Roche Z480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，分析DhGMDS基因在霍山石斛根、莖、葉、花各組織表達(dá)情況；分別提取不同時(shí)間(0、24、48和72 h)低溫處理后整株霍山石斛RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，分析DhGMDS基因低溫處理的表達(dá)規(guī)律。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以DhGMDS-RT-F和DhGMDS-RT-R為引物，以18SrRNA作為內(nèi)參基因，參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑 (TaKaRa) 說明書進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，使用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANONVA)，用Duncan’s 多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DhGMDS基因的克隆

為了獲得DhGMDS基因的cDNA序列，以霍山石斛總RNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA為模板，DhGMDS-F和DhGMDS-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物如圖1的第1條帶，約1 100 bp，測序結(jié)果顯示，該基因的開放閱讀框(ORF) cDNA序列為1 134 bp，編碼377個(gè)氨基酸，DhGMDS基因GenBank登錄號(hào)MW855573。 為了獲得DhGMDS基因的gDNA序列，以霍山石斛的基因組DNA為模板，采用特異性引物DhGMDS-F′和DhGMDS-R′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物如圖1的第2條帶，約1 500 bp,經(jīng)測序表明該基因的gDNA序列為1 523 bp，其GenBank登錄號(hào)MZ439829。與該基因的cDNA序列比較，發(fā)現(xiàn)DhGMDS基因無內(nèi)含子，只有1個(gè)外顯子。

2.2 DhGMDS蛋白的特征分析

霍山石斛DhGMDS蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為42.04 kD，包含377個(gè)氨基酸，蛋白分子式為C1867H2887N527O561S11，原子總數(shù)為5 853，等電點(diǎn)6.54，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為43.88，預(yù)估的半衰期在體外哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞是30 h、酵母體內(nèi)大于20 h、大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，脂肪族指數(shù)76.10，總平均親水性為-0.423?？缒^(qū)分析顯示該蛋白的1～377個(gè)氨基酸未形成跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域，屬非跨膜蛋白。

霍山石斛DhGMDS蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明：該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，為52.2%；定位于細(xì)胞核和線粒體可能性分別為34.8%和13.0%。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，約有36.87% 的氨基酸(139個(gè))以α螺旋形式存在，13.53% 的氨基酸(51個(gè))為延伸主鏈，49.60% 的氨基酸(187個(gè))為無規(guī)則卷曲，表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。用SWISS-MODEL對(duì)DhGMDS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，經(jīng)該軟件數(shù)據(jù)庫比對(duì)，將與數(shù)據(jù)庫中相似度最高的1n7h.1.A建模[24]，GMQE(global model quality estimation，全局模型質(zhì)量評(píng)估)值為0.83，該預(yù)測模型可靠，結(jié)果如圖2所示其結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。

2.3 一致性分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建

采用DNAMAN軟件對(duì)霍山石斛等 7 種植物的GDP-甘露糖 4,6-脫水酶氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。結(jié)果(圖3)顯示，霍山石斛的 DhGMDS與黃花石斛 (Dendrobiumcatenatum, LOC110093839)、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris, LOC110020353)、油棕(Elaeisguineensis, LOC105054659)等物種的GMDS氨基酸序列一致性較高，在79.00%～99.03%之間。

將DhGMDS基因的核苷酸序列在NCBI上進(jìn)行同源搜索，選取霍山石斛DhGMDS與馬來西亞蕉(M.acuminatasubsp.malaccensis)、水稻(Oryzasativa)、盾葉薯蕷(D.cayenensissubsp.rotundata)等12種植物的GMDS核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。結(jié)果 (圖4) 表明，霍山石斛的DhGMDS基因與黃花石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭的GMDS基因聚為一類，其親緣關(guān)系近。

2.4 DhGMDS基因啟動(dòng)子的克隆及元件分析

依據(jù)克隆的DhGMDS基因cDNA序列，設(shè)計(jì)3條特異性引物SP1、SP2和SP3(表1)，采用染色體步移的方法，克隆到DhGMDS基因5′端上游啟動(dòng)子區(qū)1 071 bp(圖5)，DhGMDS基因啟動(dòng)子GenBank登錄號(hào)MZ363640。由Plant CARE在線軟件[27]分析結(jié)果可知 (表2)，在DhGMDS基因上游啟動(dòng)子區(qū)含有基本元件 CAAT-box 和 TATA-box，光響應(yīng)順式作用元件G-box和Box-4，與干旱、低溫脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件MYC、LTR等。此外，還有與轉(zhuǎn)錄因子MYB結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)順式作用元件。

2.5 DhGMDS基因表達(dá)的qRT-PCR分析

對(duì)霍山石斛根、莖、葉、花中DhGMDS基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果(圖6，A)顯示，DhGMDS基因在不同部位均有表達(dá)，在花中相對(duì)表達(dá)量較高，其次是莖和葉，在根中的表達(dá)量最低，可推測DhGMDS基因?yàn)榛ㄖ刑禺惐磉_(dá)的基因。

對(duì)霍山石斛整株植物進(jìn)行低溫處理，分析DhGMDS基因低溫響應(yīng)情況。結(jié)果(圖6，B)表明，在低溫脅迫過程中，DhGMDS基因相對(duì)表達(dá)量迅速上調(diào)，后稍有下降，在低溫處理24 h時(shí)表達(dá)量最高。

3 討 論

多糖是霍山石斛主要活性成分，目前對(duì)霍山石斛多糖的研究多集中在藥理、藥效方面[28-29]，從分子角度解析霍山石斛植物體內(nèi)多糖合成途徑尚無相關(guān)的深入研究。本研究以霍山石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆霍山石斛關(guān)鍵酶基因DhGMDS，為進(jìn)一步研究DhGMDS基因在霍山石斛多糖代謝中的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，DhGMDS蛋白與蘭科的黃花石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭聚為一類，說明DhGMDS基因序列在蘭科中的保守性相對(duì)較高，在基因進(jìn)化中不屬于活躍型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，DhGMDS基因在花中相對(duì)表達(dá)量較高，其次是莖和葉，在根中的表達(dá)量最低。然而通常認(rèn)為莖是霍山石斛主要的藥用部位，這說明在藥用植物中含有主要有效成分的組織部位，其DhGMDS基因的表達(dá)量不一定高，該基因在霍山石斛中的表達(dá)存在組織特異性。

啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合，并啟動(dòng)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的DNA序列[30]。DhGMDS基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析表明，其啟動(dòng)子區(qū)除了含有基本元件，還含有多個(gè)逆境響應(yīng)元件，如激素響應(yīng)元件(脫落酸、水楊酸、乙烯)、低溫響應(yīng)元件、干旱響應(yīng)元件，推測DhGMDS基因可能參與植物逆境響應(yīng)過程。有報(bào)道指出，白樺BpTCP7基因啟動(dòng)子序列中具有低溫、干旱、激素響應(yīng)等相關(guān)順式作用元件，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因參與逆境脅迫應(yīng)答[31]。茶樹CsLEA5基因啟動(dòng)子序列中包含與低溫、干旱等多種逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，分析發(fā)現(xiàn)該基因在低溫、干旱中發(fā)揮重要作用[32]。蔡國強(qiáng)等[12]采用 RNA-Seq 技術(shù)對(duì)高鹽脅迫下的發(fā)菜樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)相比較正常培養(yǎng)條件， GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因在0.3 mol·L-1鹽濃度下轉(zhuǎn)錄水平提高了2.18倍，且多糖含量明顯增加，表明GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因在發(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，DhGMDS基因在低溫脅迫下顯著表達(dá)，脅迫24 h的相對(duì)表達(dá)量最高。由上可推測DhGMDS基因參與植物逆境響應(yīng)過程。

DhGMDS基因啟動(dòng)子中還含有 MYB轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn), 大量研究證明MYB轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)初級(jí)和次級(jí)代謝、防御和應(yīng)對(duì)非生物脅迫及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子[33]。也有研究表明，蘋果中MdMYB88 和MdMYB124 通過CBF依賴和非依賴的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)低溫應(yīng)答基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)蘋果的低溫抗性[34]，表明DhGMDS基因表達(dá)可能受 MYB轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)。因此，推測低溫脅迫對(duì)霍山石斛DhGMDS基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能依賴于上游的MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其具體的調(diào)控機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究克隆獲得了霍山石斛DhGMDS基因及其啟動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和低溫脅迫應(yīng)答分析，為進(jìn)一步研究DhGMDS基因的功能，解析霍山石斛抗寒機(jī)制和遺傳改良提供理論依據(jù)。