甘藍(lán)型油菜BnMYC2基因克隆及對(duì)植物抗蟲脅迫的研究

姜 茜，楊 瑤，郭世星,2，吳永成，李 壯,2*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 油菜研究中心，成都 611130)

油菜(BrassicacampestrisL.)是中國具有傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)的重要油料作物，其種植面積和產(chǎn)量是繼水稻、小麥、玉米和大豆之后的第五大農(nóng)作物，在調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)和提高人民生活水平方面占居重要地位，在農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用[1]。甘藍(lán)型油菜是白菜(B.rapa)和甘藍(lán)(B.oleracea) 兩個(gè)二倍體物種通過種間雜交形成的異源四倍體[2]，是白菜型油菜(BrassicacampestrisL.)、芥菜型油菜(BrassicajunceaL.)和 甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)3種油菜中籽粒產(chǎn)量最高的一種類型。油菜作為中國重要的油料作物和潛在的生物能源作物[3]，受到了斜紋夜蛾和油菜蚜蟲等多種害蟲的危害，對(duì)油菜產(chǎn)量造成了極大的威脅[4-5]。胡留成等[6]研究發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲誘導(dǎo)的油菜抗蟲性與茉莉酸(JA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。JA的合成是對(duì)食草動(dòng)物取食造成傷害的反應(yīng)。一些昆蟲，如以韌皮部為食的煙粉虱，通過最大限度地減少組織損傷來避免JA防御。煙粉虱取食還能激活水楊酸的合成，從而抑制茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子(TF)MYC2調(diào)節(jié)不同的JA反應(yīng)，是第一個(gè)被JAZ(Jasmonate ZM-domain，JAZ)蛋白抑制的轉(zhuǎn)錄因子[8]，能夠與12種JAZ蛋白相互作用[9]。MYC2作為JA信號(hào)途徑中的主要調(diào)節(jié)因子，與創(chuàng)傷反應(yīng)相關(guān)，通常被認(rèn)為有助于防御草食性昆蟲[10]。在未誘導(dǎo)的低茉莉酸水平下，JAZ蛋白復(fù)合物通過直接與MYC2互作、招募組蛋白脫乙酰酶(HDAC)或抑制RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)復(fù)合物的活性等作用來抑制MYC2的轉(zhuǎn)錄活性[11-14]。當(dāng)植物受到昆蟲攻擊時(shí)，JA通過氧脂生物合成途徑快速合成[15-16]，在JA共軛合成酶的作用下，JA與異亮氨酸等氨基酸結(jié)合[17]，從而得到高生物活性的茉莉單酰異亮氨酸(JA-Ile)[18]。JA-Ile感知過程中，JAZ抑制子被SCFCOI1靶向蛋白酶體降解，釋放MYC2并激活JA應(yīng)答，正向調(diào)節(jié)植物對(duì)昆蟲的抗性[19]。

隨著近幾年對(duì)MYC2轉(zhuǎn)錄因子研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)多種植物的MYC2蛋白在逆境脅迫應(yīng)答的過程中發(fā)揮了重要作用[20-23]。由于甘藍(lán)型油菜染色體組成復(fù)雜、遺傳轉(zhuǎn)化后連續(xù)自交多代才能獲得純系，因此其分子遺傳學(xué)的進(jìn)展緩慢。本研究將甘藍(lán)型油菜BnMYC2轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，研究轉(zhuǎn)基因植株對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的抗性，為深入探究甘藍(lán)型油菜對(duì)植食性害蟲的防御機(jī)制以及進(jìn)一步培育抗蟲的油菜品種具有參考借鑒意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用野生型擬南芥Col-0為本實(shí)驗(yàn)室保存，擬南芥突變體myc2-2(Salk_083483)購自擬南芥突變體庫，甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系R18的種子為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究中心提供，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)正常播種和田間管理，斜紋夜蛾蟲卵購自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，并參照杜鵑等[24]描述的人工飼養(yǎng)方法獲得實(shí)驗(yàn)所需的三齡幼蟲，大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、pEASY-T1載體、HiFi高保真酶和限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、SalⅠ購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，DNA凝膠回收試劑盒和細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑及定量 PCR 所需的熒光染料試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pCAMBIA1300-HA為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳學(xué)偉教授課題組惠贈(zèng)。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆利用CTAB法提取甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系R18新鮮葉片的基因組DNA(gDNA)，使用Primer Premier 3在線軟件(http://primer3. ut.ee/)，以BnMYC2 的 cDNA 序列 (GenBank 登錄號(hào)MK571811.1)設(shè)計(jì)引物(表1)。根據(jù)下列體系對(duì)BnMYC2基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增：DNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，BufferⅠ2.5 μL，HiFi DNA聚合酶 0.5 μL，正反引物各0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性30 s，68 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1.5 min，以后依次降低2 ℃，直到60 ℃，每個(gè)退火溫度循環(huán)2次，95 ℃ 變性30 s， 58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)20次，共30個(gè)循環(huán)。72 ℃ 延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，目的片段做膠回收連接到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α做菌落PCR檢測(cè)，將陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)送擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.2 序列分析參照程奕秋等[25]的方法應(yīng)用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)BnMYC2的全長CDS序列進(jìn)行翻譯獲得其所編碼的蛋白序列，利用Pfam軟件對(duì)BnMYC2的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。借助DNAMAN軟件預(yù)測(cè)基因所在染色體上的位置。參照邱曉杰等[26]的方法利用MEGA7.0軟件，將得到的BnMYC2和其他一些常見物種中該基因編碼的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.2.3 基因表達(dá)分析根據(jù)BnMYC2基因的cDNA序列比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)引物(表1)，分別以甘藍(lán)型油菜的根、莖、葉、花以及授粉后27 d和授粉后35 d果莢的cDNA為模板，BnActin基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)甘藍(lán)型油菜BnMYC2基因在不同組織中的表達(dá)水平。PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)在C1000TM Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行，CFX96 Real-Time System進(jìn)行熒光收集，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，參照高玉龍等[27]的方法采用2-ΔΔCT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和處理。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)(XbaⅠ/SalⅠ)的引物(表1)，以基因克隆的菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段連接到線性化的pCAMBIA1300-HA載體上使BnMYC2與HA標(biāo)簽融合表達(dá)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌做菌落PCR檢測(cè)，將陽性菌落送擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序顯示正確的轉(zhuǎn)化子保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 轉(zhuǎn)化擬南芥利用浸花法將攜帶重組載體pCAMBIA1300-BnMYC2-HA的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，22 ℃避光培養(yǎng)24 h后在長日照條件下培養(yǎng)(22 ℃、16 h光照/8 h黑暗)。單株收取T0代種子。利用含有潮霉素的平板進(jìn)行陽性苗篩選獲得T1代幼苗，提取T1代幼苗葉片gDNA，利用hygromycin、BnMYC2兩對(duì)引物篩選陽性植株(表1)。檢測(cè)為陽性的植株，收獲種子T2代后再利用抗性平板依據(jù)植株的表型進(jìn)行純合株系篩選，篩選到T3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗蟲性鑒定參考You等[28]的實(shí)驗(yàn)方法將斜紋夜蛾卵在27 ℃孵化，飼料喂養(yǎng)至3齡后轉(zhuǎn)移到塑料盒中，饑餓12 h后進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。從4周齡植株上取45片大小相近的成熟蓮座葉并稱重，每種基因型放入150 mm塑料培養(yǎng)皿，將15只斜紋夜蛾3齡幼蟲，按3個(gè)獨(dú)立重復(fù)，每種基因型在一個(gè)培養(yǎng)皿中稱重，放在葉片上飼養(yǎng)，取食5 h后對(duì)葉片進(jìn)行拍照及稱重同時(shí)計(jì)算葉片損失量。斜紋夜蛾幼蟲在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4 d，每2 d更換1次培養(yǎng)皿內(nèi)的45片鮮葉，取食后4 d稱15頭幼蟲的體重。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗蟲基因VSP2的表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的T3代純系播種在1/2MS培養(yǎng)基上，發(fā)芽后生長10 d，再轉(zhuǎn)移幼苗至含 100 μmol/L MeJA的 1/2MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)6 h，同時(shí)以轉(zhuǎn)移幼苗至只含 1/2MS 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h為對(duì)照，收取處理的葉片液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，提取RNA做熒光定量PCR檢測(cè)抗蟲基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜BnMYC2基因的克隆

利用引物BnMYC2F/BnMYC2R (表1) 對(duì)甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系R18的gDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得2 000 bp左右的片段(圖1)，將目的條帶回收純化后連接轉(zhuǎn)化，陽性克隆用特異性引物檢測(cè)后送擎科生物科技有限公司測(cè)序，并用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，該基因從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA之間具有一個(gè)1 833 bp完整的開放閱讀框(ORF)，與甘藍(lán)型油菜Brassicanapus(MK571811)相似性為97.44%，其基因編碼的蛋白由610個(gè)氨基酸殘基組成。

2.2 油菜BnMYC2基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用Pfam軟件對(duì)甘藍(lán)型油菜BnMYC2編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白在第400到500個(gè)氨基酸之間有一個(gè)HLH(Helix-Loop-Helix)保守結(jié)構(gòu)域(圖2，A)，表明BnMYC2為典型的bHLH型轉(zhuǎn)錄因子。

2.3 油菜BnMYC2進(jìn)化樹分析

使用NCBI中的Blastp工具對(duì)甘藍(lán)型油菜BnMYC2基因序列進(jìn)行同源檢索，利用MEGA 7.0軟件對(duì)檢索到的數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化數(shù)(圖2，B)。結(jié)果表明，克隆得到的甘藍(lán)型油菜BnMYC2基因與甘藍(lán)型油菜A5染色體Brassicanapus(CAF2098906)、甘藍(lán)型油菜C7染色體Brassicanapus(XP_013648964)、甘藍(lán)型油菜C6染色體Brassicanapus(XP_013735805)、甘藍(lán)Raphanussativus(XP_018492851.1)、擬南芥Arabidopsisthaliana(NP 174541.1)、蘿卜Brassicaoleracea(XP_013586726.1)親緣關(guān)系最近。推測(cè)BnMYC2基因的功能可能與甘藍(lán)、擬南芥和蘿卜中的同源基因功能類似。

2.4 油菜BnMYC2基因的染色體位置分析

利用DNAMAN軟件對(duì)BnMYC2基因編碼蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示其與甘藍(lán)型油菜A5染色體Brassicanapus(CAF2098906)、甘藍(lán)型油菜C7染色體Brassicanapus(XP_013648964)及甘藍(lán)型油菜C6染色體Brassicanapus(XP_013735805)氨基酸的相似性分別達(dá)到97.87%、81.54%、99.34%，推測(cè)克隆得到的BnMYC2基因是位于甘藍(lán)型油菜基因組C6染色體的拷貝。

2.5 BnMYC2基因熒光定量PCR分析

通過熒光定量PCR分析BnMYC2基因在油菜各組織的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，該基因在油菜各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異，授粉后27 d果莢中BnMYC2基因表達(dá)量最顯著，葉和根中次之，授粉后35 d果莢中該基因表達(dá)量最低(圖3)。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選鑒定及表達(dá)檢測(cè)

為了研究BnMYC2的功能，將pCAMBIA1300-BnMYC2-HA過表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每一代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)同樣個(gè)體PCR同時(shí)檢測(cè)目的基因和抗性基因片段直至獲得純系。結(jié)果(圖4)顯示，5個(gè)轉(zhuǎn)基因純系株系中均擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的特異性條帶，選擇株系 1用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。對(duì)Col-0、myc2和BnMYC2-OE進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有過表達(dá)植株中檢測(cè)到BnMYC2基因的表達(dá)，表明BnMYC2確實(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)入擬南芥(圖5，A)。由于MYC2是JA信號(hào)傳導(dǎo)路徑中的關(guān)鍵因子，為了研究轉(zhuǎn)基因植株在JA誘導(dǎo)下的表現(xiàn)，用100 mmol/L的茉莉酸處理BnMYC2-OE轉(zhuǎn)基因擬南芥，發(fā)現(xiàn)處理后BnMYC2基因表達(dá)量比對(duì)照顯著上調(diào)(圖5，B)，表明BnMYC2響應(yīng)外源JA的誘導(dǎo)，推測(cè)其通過調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，傳導(dǎo)甘藍(lán)型油菜的JA信號(hào)。

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥飼養(yǎng)斜紋夜蛾分析

為研究BnMYC2基因?qū)ハx脅迫的響應(yīng)，用4周齡Col-0、myc2和BnMYC2-OE的擬南芥葉片飼養(yǎng)饑餓12 h后的3齡斜紋夜蛾幼蟲，4 d后觀察幼蟲形態(tài)，結(jié)果顯示，以myc2飼養(yǎng)的斜紋夜蛾幼蟲體型最大，Col-0的次之，取食BnMYC2-OE的最小(圖6，A-C)，幼蟲形態(tài)與葉片危害癥狀一致(圖6，D-F)。對(duì)斜紋夜蛾幼蟲進(jìn)行稱重統(tǒng)計(jì)(圖6，G)，顯示饑餓處理后，斜紋夜蛾幼蟲體重有所下降，取食各基因型葉片后體重均大幅度提升，但取食各基因型擬南芥的幼蟲體重與喂食后各基因型擬南芥葉片損失量保持一致(圖6，H)，即：myc2>Col-0>BnMYC2-OE，表明BnMYC2基因正向調(diào)控?cái)M南芥對(duì)抗蟲脅迫的響應(yīng)。

2.8 BnMYC2調(diào)節(jié)抗蟲基因VSP2的表達(dá)

VSP2是茉莉酸誘導(dǎo)響應(yīng)損傷脅迫的標(biāo)記基因[29]，對(duì)植物防御植食性昆蟲有著重要作用。為了驗(yàn)證BnMYC2在擬南芥抗蟲脅迫中的作用，對(duì)BnMYC2-OE擬南芥中VSP2基因表達(dá)水平進(jìn)行分析(圖7)，結(jié)果顯示BnMYC2-OE中的VSP2表達(dá)量比Col-0略高，該基因在myc2中的表達(dá)水平最低。用MeJA誘導(dǎo)6 h后，VSP2基因在不同基因型擬南芥的表達(dá)量都明顯增加，與誘導(dǎo)前相比差異顯著，表明BnMYC2正向調(diào)控VSP2基因的表達(dá)，推測(cè)BnMYC2通過調(diào)控包括VSP2在內(nèi)的多個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)使植物響應(yīng)蟲害脅迫。

3 討 論

甘藍(lán)型油菜是中國重要的油料作物，菜籽油在食品加工和工業(yè)生產(chǎn)上都具有重要作用。油菜的生物學(xué)產(chǎn)量受到多種因素的影響，其中蟲害脅迫是其主要的制約因素之一[4]。為了提高油菜產(chǎn)量，深入了解其抗蟲生理機(jī)制十分重要。近年來，針對(duì)模式植物擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)MYC2 是茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)路徑的關(guān)鍵因子，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)影響植物的生長發(fā)育。分析基因在多種組織器官的表達(dá)模式，可以為充分理解基因的生物學(xué)功能提供新的信息[30]。本研究選取了甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系R18的根、莖、葉、花及授粉后不同時(shí)期的果莢，發(fā)現(xiàn)授粉后27 d的果莢中BnMYC2表達(dá)量最顯著，在根、葉中表達(dá)水平較高。前人對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)AtPLT1和AtPLT2基因能編碼維持根莖細(xì)胞活性的轉(zhuǎn)錄因子AP2和ERF，AtMYC2通過結(jié)合AtPLT1和AtPLT2基因啟動(dòng)子的G-box元件抑制基因的表達(dá)參與JA介導(dǎo)對(duì)根的生長抑制[31]。李罡[32]的研究顯示過表達(dá)MYC2純合的大青楊比野生型的不定根生長速度快，而MYC2表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株的不定根生長較遲緩且生長速度慢。Huang等[33]的研究表明MYC2通過抑制生長素合成負(fù)向調(diào)控葉脈發(fā)育。Qi 等[34]的研究表明MYC2通過與bHLH IIId亞族轉(zhuǎn)錄因子相互作用進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥的葉片衰老。甘藍(lán)型油菜與擬南芥同屬十字花科植物，BnMYC2與AtMYC2基因同源性高，且具有bHLH型轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域HLH，推測(cè)其在抑制主根生長，正向調(diào)控側(cè)根生長、調(diào)控葉片衰老等植物生長發(fā)育方面具有類似AtMYC2的功能。

斜紋夜蛾是油菜種植過程中最常見的害蟲，二齡前幼蟲主要危害葉肉，二齡后危害不同的植物組織，受害嚴(yán)重的油菜上半部成光桿，對(duì)產(chǎn)量影響很大[5]。通過模式植物擬南芥的研究，前人發(fā)現(xiàn)MYC2正向調(diào)控受茉莉酸誘導(dǎo)的多個(gè)抗蟲基因，從而增強(qiáng)對(duì)蟲害的抵御能力[19, 33]。本研究發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲對(duì)過表達(dá)BnMYC2擬南芥植株的取食量最少，幼蟲的體重相應(yīng)增加的程度最小，反之斜紋夜蛾幼蟲對(duì)myc2缺失突變體的取食量最多，幼蟲的體重相應(yīng)增加的程度最大?？瓜x基因VSP2的表達(dá)水平也表現(xiàn)出相應(yīng)的變化，并且其表達(dá)量用MeJA短暫處理后呈現(xiàn)顯著的變化趨勢(shì)。該研究結(jié)果與前人的報(bào)道類似[35-38]。上述結(jié)果為深入探究BnMYC2介導(dǎo)抗蟲脅迫的機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)，也為培育抗蟲的油菜品種提供一些新的思路。