龍眼WOX家族基因鑒定及在體胚發(fā)生早期的表達(dá)分析

馬湘瑋，張舒婷，陳 燕，賴鐘雄，林玉玲

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

WUSCHEL相關(guān)的同源異型盒(WUSCHEL-related homeobox, WOX)家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，屬于同源異型盒(homeobox，HB)超家族中的一個(gè)亞家族[1]。在HB轉(zhuǎn)錄因子家族中，包含一個(gè)典型的DNA 結(jié)合螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序的60～66個(gè)氨基酸殘基的同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)[1-2]。在WOX轉(zhuǎn)錄因子家族中此結(jié)構(gòu)域非常的保守，證明此結(jié)構(gòu)域在HD功能完整性方面起著重要的作用[3]。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，將WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為3個(gè)分支，WUS支(WUS clade)、中間支(intermediate clade)和古老支(ancient clade)[4]。古老支演化較早，發(fā)現(xiàn)于藻類和被子植物中；中間支出現(xiàn)在蕨類植物起源之后，且不存在于藻類和苔蘚植物中；而WUS分支則僅在被子植物中發(fā)現(xiàn)，表明它是最先進(jìn)的分支。

隨著高通量測(cè)序的發(fā)展(next generation sequencing，NGS)，WOX基因家族在植物中也被廣泛鑒定[5-9]，如毛果楊(PopulustrichocarpaTorr.)[10]、小立碗蘚(Physcomitrellapatens.)[5]和歐洲云杉[Piceaabies(L.) Karst.][6]等。WOX家族成員在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面起著重要作用，如調(diào)控植物胚的形成、干細(xì)胞維持、調(diào)控體胚發(fā)生、側(cè)器官發(fā)育以及器官再生[11]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtWOX1可能通過調(diào)節(jié)多胺的合成來調(diào)節(jié)側(cè)向器官的發(fā)育[12]。AtWOX3在葉和花器官原基的邊緣表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂與器官的橫向發(fā)展[13-14]。在胚胎發(fā)育過程中，過表達(dá)擬南芥AtWUS基因可促進(jìn)陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生并誘導(dǎo)器官發(fā)生[15-16]。AtWOX8和AtWOX9最初在卵細(xì)胞和合子中共表達(dá)，然后通過不對(duì)稱分裂分別限制在合子胚的頂端和胚柄細(xì)胞中，并且都參與了擬南芥早期胚胎發(fā)育[17]。PaWOX2可能調(diào)節(jié)云杉中的胚胎細(xì)胞分裂和分化[18]；WOX基因是葡萄體胚發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子[19]。綜合前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WOX基因家族的功能涉及范圍很廣，這些功能的發(fā)揮與它們可以促進(jìn)細(xì)胞分裂或阻止未成熟細(xì)胞的提前分化密不可分[20]。

龍眼(DimocarpuslonganLour.) 是無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)的熱帶亞熱帶常綠果樹。龍眼在中國(guó)廣東、福建、廣西、云南、四川和海南等地廣泛種植，是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。此外，龍眼還有豐富的藥理用途，富含大量的多酚，對(duì)炎癥、癌癥和心血管疾病有預(yù)防作用[21]。龍眼胚胎發(fā)育的狀態(tài)影響龍眼果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)[22]。龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生(體胚發(fā)生)系統(tǒng)是研究龍眼胚胎發(fā)育較好的替代材料[23]，也可以解決自然條件下龍眼胚胎取樣難、材料一致性差等問題?；诒緦?shí)驗(yàn)室建立的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[24]及DlWUS基因的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[25]，本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)WOX家族成員基本理化性質(zhì)及系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行分析；基于龍眼體胚發(fā)生早期和不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，分析WOX家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期胚性愈傷組織(EC)、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(incomplete compact pro-embryogenic cultures, ICpEC)與球形胚(globular embryos, GE)3個(gè)階段的表達(dá)(FPKM值)；采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其在龍眼體胚發(fā)生早期及不同激素處理下胚性愈傷組織中的表達(dá)模式。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料采用福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所培養(yǎng)的‘紅核子’龍眼胚性愈傷組織(EC)、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(ICpEC)和球形胚(GE)等體胚早期3個(gè)階段的材料，參考賴鐘雄培養(yǎng)方法培養(yǎng)[23]。取0.2 g生長(zhǎng)狀態(tài)良好的EC，分別于0、50、100和200 μmol/L脫落酸(ABA)或茉莉酸甲酯(MeJA)的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，120 r/min、(25士2)℃搖床上黑暗培養(yǎng)24 h后收樣，經(jīng)液氮凍存后放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 龍眼WOX家族成員的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析在線網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html)下載擬南芥WOX(AtWOX)家族成員蛋白序列與CDS序列，以AtWOX蛋白序列為探針序列(E<0.001)，并結(jié)合‘紅核子’龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[24]進(jìn)行篩選，初步獲得14條候選的龍眼WOX(DlWOX)家族蛋白序列。使用HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)及SMART(http://smart.embl-eidelberg.de/)在線網(wǎng)站進(jìn)行WOX家族結(jié)構(gòu)域鑒定，最終在龍眼基因組中確定13條含完整結(jié)構(gòu)域的WOX蛋白序列。使用擬南芥基因組網(wǎng)站TAIR進(jìn)行Blast比對(duì)，參考AtWOX家族成員的命名方法，對(duì)DlWOX家族成員進(jìn)行命名。在線軟件Ex-pasyprotparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析DlWOX蛋白的基本理化性質(zhì)；MEGA6.1軟件基因鄰近法構(gòu)建龍眼、擬南芥WOX家族成員系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，自展法系數(shù)(Bootstrap)設(shè)置為1000次進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)，利用在線工具iTOL (https://itol.embl.de/upload.cgi) 對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.2.2 龍眼WOX家族蛋白保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析采用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析DlWOX蛋白序列的保守基序(motif)，使用Tbtools軟件進(jìn)行可視化作圖。利用龍眼基因組的gff3文件，使用TBtools軟件對(duì)DlWOX家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.3 龍眼WOX基因啟動(dòng)子順式作用元件分析從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取DlWOX基因起始密碼子(ATG)上游2 000 bp序列作為DlWOX的啟動(dòng)子序列，采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html)在線軟件分析龍眼WOX家族基因啟動(dòng)子的順式作用元件，使用Excel軟件對(duì)分析所得到的順式作用元件結(jié)果進(jìn)行繪圖。

1.2.4 龍眼體胚發(fā)生早期及不同組織部位中WOX基因的表達(dá)分析從龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(SRA050205)中，提取WOX家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段(EC、ICpEC、GE)及9個(gè)不同組織部位(種子、根、莖、葉、花、花蕾、果肉、幼果、果皮)中的FPKM值，通過取對(duì)數(shù)(log2)轉(zhuǎn)換，并利用TBtools軟件繪制熱圖進(jìn)行分析。

1.2.5 龍眼體胚發(fā)生早期及不同激素處理下WOX基因的表達(dá)分析使用Trizol up試劑盒(全式金，北京)提取龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段(EC、ICpEC、GE)的總RNA，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit TransScript RNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(翊圣，上海)的說明書進(jìn)行cDNA合成。以cDNA 10倍稀釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，于羅氏LightCycler 480儀器中進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)(表1)。以Beta-actin(ACTB)及Ubiquitin(UBQ)為龍眼不同激素處理及早期體胚發(fā)生過程qRT-PCR的內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算DlWOX的相對(duì)表達(dá)量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件分析差異顯著性，利用GraphpadPrism7制作圖表。

表1 qRT-PCR引物及相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼WOX家族成員鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過比對(duì)分析在龍眼中共鑒定出13個(gè)WOX家族成員，參考擬南芥WOX家族成員命名方法，分別將龍眼WOX家族成員命名為DlWUS、DlWOX1、DlWOX1.1、DlWOX1.2、DlWOX1.3、DlWOX14.1、DlWOX14.2、DlWOX2、DlWOX5B、DlWOX6、DlWOX7、DlWOX9A與DlWOX14.2(表2)。對(duì)龍眼WOX家族13個(gè)成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，WOX家族分子量在10 390.99～202 745.36 Da之間，氨基酸數(shù)目在87～1 809 aa之間，不同成員之間的氨基酸數(shù)目差異較大；等電點(diǎn)在5.55～9.37之間，其中DlWOX6、DlWOX5B、DlWUS、DlWOX1.2、DlWOX2與DlWOX1.3為堿性蛋白，其余7個(gè)成員都為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)在55.25～89.07之間，且只有DlWOX14.2為穩(wěn)定蛋白，其余12個(gè)成員均為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示除DlWOX6定位在細(xì)胞骨架上外，其余成員均定位在細(xì)胞核上。

表2 龍眼WOX家族成員基本理化性質(zhì)分析

2.2 龍眼WOX家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步研究龍眼WOX家族成員間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA6.10軟件構(gòu)建擬南芥14個(gè)WOX家族基因(AtWOX1～AtWOX13、AtWUS)和龍眼13個(gè)WOX成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。參考擬南芥的分類方法并結(jié)合同源比對(duì)，將龍眼WOX家族13條成員初步分成3個(gè)支系。遠(yuǎn)古支、中間支和WUS支。遠(yuǎn)古支包含了DlWOX1.2和DlWOX5B是樹上最小的分支，是WOX家族基因在擬南芥和龍眼中最小的類群。中間支是樹上最大的分支，包含了DlWOX7、DlWOX2、DlWOX11、DlWOX1、DlWOX1.1、DlWOX1.3。WUS支包含了DlWOX9A、DlWOX14.2、DlWOX6、DlWOX14.1、DlWUS。從進(jìn)化樹的結(jié)果可以看出，所篩選的龍眼WOX家族基因并沒有出現(xiàn)單獨(dú)分支的情況且大多與擬南芥具有較高相似性。

2.3 龍眼WOX家族成員基因結(jié)構(gòu)與蛋白基序(motif)分析

為進(jìn)一步了解龍眼WOX家族成員的基因結(jié)構(gòu)，對(duì)WOX家族成員的DNA序列與相對(duì)應(yīng)基因組的cDNA序列進(jìn)行比較(圖2，A)，確定了13條基因的內(nèi)含子、外顯子數(shù)量以及位置。結(jié)果表明，龍眼WOX家族基因成員外顯子數(shù)目在1-19之間，其中DlWOX7含有的外顯子數(shù)目最多有19個(gè)；DlWOX6與DlWOX11只有1個(gè)外顯子，DlWOX1、DlWOX14.2和DlWUS有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子；DlWOX1.1、DlWOX1.3和DlWOX9A有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子。分析發(fā)現(xiàn)龍眼WOX家族基因成員的基因長(zhǎng)度存在比較大的跨度，DlWOX7基因最長(zhǎng)，基因長(zhǎng)度為12 000 bp左右；DlWOX6與DlWOX11最短。

對(duì)WOX家族成員蛋白序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守基序分析，結(jié)果(圖2，B)發(fā)現(xiàn)，除DlWOX14.1、DlWOX6和DlWOX7外，其他成員都含有基序motif1；除DlWOX14.1外其他成員都包含motif2。推測(cè)這2個(gè)保守基序共同組成HD保守結(jié)構(gòu)域。Motif9只存在于DlWOX1.2和DlWOX7中；motif4只存在于DlWOX14.1、DlWOX6和DlWOX7中，推測(cè)DlWOX家族成員在進(jìn)化的過程中出現(xiàn)了特有的保守結(jié)構(gòu)域，功能產(chǎn)生了分化。DlWOX11和DlWOX14.2除了包含兩個(gè)基礎(chǔ)的保守基序motif1和motif2，并沒有其他基序，推測(cè)DlWOX14.1、DlWOX6和DlWOX7同其他龍眼WOX基因家族成員的功能冗余有關(guān)。

2.4 龍眼WOX家族成員啟動(dòng)子順式作用元件分析

為深入了解龍眼WOX家族成員不同成員啟動(dòng)子的功能之間差異，使用PlantCARE在線軟件對(duì)龍眼WOX家族起始密碼子上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析(表3)。龍眼WOX家族啟動(dòng)子區(qū)域均含有光(Light)響應(yīng)元件與生長(zhǎng)素(Auxin)響應(yīng)元件，推測(cè)WOX家族在光響應(yīng)與生長(zhǎng)素響應(yīng)過程中起著重要的作用。大部分成員含有茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)元件、干旱(Drought)響應(yīng)元件、脫落酸(ABA)響應(yīng)元件及厭氧誘導(dǎo)(Anoxic)響應(yīng)元件。此外，DlWUS、DlWOX1.3、DlWOX2含有水楊酸(SA)響應(yīng)元件；DlWOX2、DlWOX1.1、DlWOX5B、DlWUS、DlWOX14.1含有赤霉素(GA3)響應(yīng)元件。以上結(jié)果表明龍眼WOX家族成員可能通過響應(yīng)不同激素，參與龍眼不同生長(zhǎng)發(fā)育過程。

表3 龍眼WOX家族基因成員啟動(dòng)子順式作用元件

2.5 WOX家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期的表達(dá)分析

為了解WOX家族基因在龍眼體胚早期的表達(dá)情況，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取該家族基因的FPKM值，分析其在龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段(EC、ICpEC、GE)的表達(dá)模式(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlWOX6、DlWOX5B、DlWOX2、DlWOX11從EC到GE階段逐漸上調(diào)；DlWOX9A在龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段都有較高表達(dá)；DlWOX14.1、DlWOX9A、DlWOX1.2、DlWOX14.2、DlWOX7、DlWUS在EC到GE階段逐漸下調(diào)。以上結(jié)果表明，不同DlWOX基因在龍眼體胚發(fā)生早期不同階段發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證DlWOX家族成員的表達(dá)模式，基于FPKM值篩選出在龍眼體胚發(fā)生早期表達(dá)趨勢(shì)差異較大的DlWOX11、DlWOX14.1、DlWOX14.2、DlWOX2、DlWOX9A、DlWOX6和DlWOX7等7個(gè)基因，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在EC、ICpEC、GE階段的相對(duì)表達(dá)(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlWOX6、DlWOX7、DlWOX11和DlWOX14.2在龍眼體胚發(fā)生早期的qRT-PCR結(jié)果與FPKM表達(dá)趨勢(shì)相似。FPKM顯示DlWOX14.1在EC階段表達(dá)量最高，GE階段表達(dá)量最低，而qRT-PCR顯示該基因在GE階段的表達(dá)量相較于EC階段和ICpEC階段顯著上升，這一結(jié)果與FPKM值完全相反；qRT-PCR顯示DlWOX9A與DlWOX2在EC至ICpEC階段的表達(dá)沒有顯著差異，與FPKM值表達(dá)趨勢(shì)不同。以上結(jié)果說明DlWOX基因具有一定的時(shí)空表達(dá)特異性。

2.6 龍眼WOX家族成員不同器官的特異表達(dá)分析

在不同器官中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，除DlWOX14.1、DlWOX14.2、DlWOX7、DlWOX6、DlWUS外，其余成員在不同器官中表達(dá)量低甚至不表達(dá)。DlWOX14.2在花、花蕾、莖和幼果中高表達(dá)；DlWOX14.1在花蕾和種子中高表達(dá)；DlWUS在根和莖中高表達(dá)；DlWOX7在所有的器官中都有著較高的表達(dá)量，在果肉中的表達(dá)量最高。推測(cè)DlWOX7在不同器官中特異表達(dá)。

2.7 GA3和MeJA處理下WOX家族成員在龍眼胚性愈傷組織中的表達(dá)分析

結(jié)合啟動(dòng)子順式作用元件結(jié)果，采用qRT-PCR檢測(cè)不同激素處理下DlWOX基因的表達(dá)模式。GA3處理中(圖6，A)，除DlWOX6以外其余成員對(duì)不同濃度GA3均有響應(yīng)；DlWOX6、DlWOX11、DlWOX14.2、DlWOX7在200 μmol/L GA3時(shí)表達(dá)量最高，而DlWOX9A和DlWOX2在50 μmol/L GA3時(shí)表達(dá)量最高；DlWOX11表達(dá)量隨著GA3濃度的增加而增加；DlWOX6在100 μmol/L GA3時(shí)表達(dá)量受到了抑制。

MeJA處理中(圖6，B)，除DlWOX6以外其余WOX家族成員對(duì)不同濃度MeJA均有響應(yīng)，呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的表達(dá)趨勢(shì)，且在濃度為100 μmol/L時(shí)表達(dá)量最高；DlWOX6在濃度為50 μmol/L時(shí)表達(dá)量受到抑制。推測(cè)龍眼WOX家族激素MeJA處理的最適濃度為100 μmol/L。

3 討 論

3.1 龍眼WOX家族成員具有進(jìn)化保守性及功能多樣性

WOX家族是一類在植物中特異存在的轉(zhuǎn)錄因子家族且廣泛作用于植物關(guān)鍵的發(fā)育過程[17]。目前，WOX家族已在多個(gè)物種中被鑒定，在龍眼中WOX家族還沒有被報(bào)道。本研究利用龍眼全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)首次在龍眼中鑒定到了13個(gè)具有完整HD結(jié)構(gòu)域的DlWOX家族成員，少于擬南芥(15個(gè))[4]、簸箕柳(15個(gè))[26]，多于蘋果(12個(gè))[27]?？傮w來講，龍眼WOX家族成員的數(shù)目與多數(shù)物種相近，推測(cè)在生物進(jìn)化的過程中其并沒有發(fā)生大規(guī)模的擴(kuò)增事件，這與擬南芥的研究結(jié)果一致[28]。DlWOX家族成員的外顯子數(shù)目為1～19個(gè)，多于番茄SlWOX成員的2～4個(gè)[7]和黃瓜CsWOX成員的2～5個(gè)[29]。

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，將龍眼WOX家族分為遠(yuǎn)古支、中間支和WUS支，位于同一分支的成員在功能上可能也具有相似性，這很有可能是由于龍眼WOX家族基因在發(fā)生進(jìn)化的過程中沒有出現(xiàn)明顯的功能分化而導(dǎo)致的結(jié)果，因此使龍眼WOX家族基因與擬南芥的WOX同源性較高，值得注意的是WOX家族基因在擬南芥中最大的分支是WUS支而在龍眼中最大的分支是中間支，但是每一條基因的具體調(diào)控位置及功能還需后期進(jìn)行功能驗(yàn)證。在擬南芥中，AtWOX1及其同源體的主要功能是控制外側(cè)器官增殖與分化[30]，而在矮牽牛中PtWOX1也同樣具有調(diào)控器官的橫向發(fā)育的功能[31]。蛋白基序分析發(fā)現(xiàn)幾乎所有的龍眼WOX家族成員都含有motif1和motif2，這兩個(gè)保守基序共同構(gòu)成同源結(jié)構(gòu)域HD，某些成員含有特異性的基序，可能造成龍眼WOX家族的功能分化。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，大部分龍眼WOX家族成員編碼的蛋白都為不穩(wěn)定蛋白，均定位在細(xì)胞核。通過分析龍眼WOX家族在不同器官中的特異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)龍眼WOX家族成員在花、花蕾、葉、果皮、果肉、根、種子、莖中都有表達(dá)且在葉中的表達(dá)量較高，值得注意的是DlWOX7在龍眼不同器官中高表達(dá)且在果肉中的表達(dá)量最高。研究發(fā)現(xiàn)，DoWOX7可能通過在鐵皮石斛合蕊柱中高表達(dá)來調(diào)控鐵皮石斛花發(fā)育[32]；在擬南芥中，WOX7在根中高表達(dá)以介導(dǎo)糖類對(duì)側(cè)根形成的抑制作用[33]；而在黃瓜中CsWOX7并無明顯的特異表達(dá)模式[29]。由此推測(cè)，WOX7的表達(dá)模式在物種間存在差異，可能由于其在不同物種中具有不同的功能。

3.2 龍眼WOX家族成員可能調(diào)控龍眼早期體胚發(fā)生過程

植物體胚發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，基因差異表達(dá)決定了不同細(xì)胞的命運(yùn)分化。WOX家族成員在促進(jìn)體胚發(fā)生、維持干細(xì)胞以及細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變等方面發(fā)揮著重要的作用[34]。PaWOX2影響云杉體胚早期表達(dá)[35]，AtWOX2在胚胎頂端區(qū)域調(diào)控胚的形成[17]；除此之外，AtWOX9作為擬南芥胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生的早期，其突變體還會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞胚胎發(fā)育受損、胚胎基部發(fā)育不全、下胚軸和子葉的缺陷、球形胚或更早期的發(fā)育受阻和細(xì)胞分裂頻率降低[36]，PaWOX9在莖尖和根尖分生組織調(diào)節(jié)體胚早期發(fā)生并且促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在本研究中，為了進(jìn)一步探究DlWOX家族在龍眼體胚發(fā)生過程中的作用，對(duì)龍眼WOX家族在龍眼體胚發(fā)生早期過程表達(dá)趨勢(shì)差異較大的7個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)大部分成員(DlWOX14.2、DlWOX11、DlWOX6、DlWOX7、DlWOX14.1)都在GE階段高表達(dá)；DlWOX2在ICpEC階段表達(dá)量最高；DlWOX9A在龍眼體胚發(fā)生早期三個(gè)階段沒有顯著差異性。據(jù)前人的報(bào)道，WOX家族成員已被證明在協(xié)調(diào)參與胚胎發(fā)生早期階段的基因轉(zhuǎn)錄，芽、根和分生組織功能以及植物器官發(fā)生中發(fā)揮重要作用，且WOX2、WOX8、WOX9是體胚發(fā)生早期的重要調(diào)控因子[17]；在挪威云杉中PaWOX2和PaWOX8/9在體胚發(fā)生早期GE階段的表達(dá)量最高[37]；海島棉中GbWOX9在GE階段的表達(dá)量是EC階段和心形胚(heart embryo,HE)階段的2倍多[38]。本研究發(fā)現(xiàn)DlWOX9A轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果的表達(dá)量存在差異并且趨勢(shì)也不完全相同，還需后期的試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。VvWOX5參與了葡萄的魚雷型(torpedo stage，SE1)胚早期，在EC和早期的SE1中，其表達(dá)水平顯著高于子葉期(cotyledonary stage，SE2)和體胚發(fā)芽期(somatic embryos in germination，SEG)[19]。張東敏等[25]分離克隆了龍眼WOX家族的WUS成員，發(fā)現(xiàn)DlWUS在整個(gè)龍眼體胚發(fā)生過程均有表達(dá)，在GE階段發(fā)揮作用，并影響體細(xì)胞胚胎發(fā)育后期的形態(tài)建成。DlWOX14.2、DlWOX11、DlWOX6、DlWOX7、DlWOX14.1在EC、ICpEC與GE三個(gè)階段高表達(dá)，在GE階段的表達(dá)量最高，這一研究結(jié)果與前人的一致。推測(cè)WOX家族在龍眼的整個(gè)體胚發(fā)生早期起著重要的作用，尤其是在GE階段。

3.3 龍眼WOX家族成員可能通過響應(yīng)赤霉素和茉莉酸甲酯從而調(diào)控龍眼早期體胚發(fā)生過程

GA在植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面發(fā)揮重要作用，例如種子發(fā)育和萌發(fā)、體細(xì)胞胚萌發(fā)和再生、莖伸長(zhǎng)、無核果實(shí)的發(fā)育和花朵發(fā)育[39-41]。在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的后期、合子胚胎發(fā)生的早期階段、胚胎開始發(fā)育和分化，這些形態(tài)發(fā)生事件也受GA調(diào)節(jié)并且缺乏GA也會(huì)導(dǎo)致種子敗育[42]。本研究中，6個(gè)龍眼WOX家族成員經(jīng)GA處理后除DlWOX6外均呈上調(diào)表達(dá)，而DlWOX11和DlWOX2都含有GA響應(yīng)元件，進(jìn)一步說明了龍眼WOX家族可以響應(yīng)GA的處理；值得注意的是DlWOX6、DlWOX14.2、DlWOX7、DlWOX9A雖然不含有GA響應(yīng)元件，但qRT-PCR結(jié)果顯示其也能在一定程度下響應(yīng)GA處理并大部分成員呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，說明其他龍眼WOX家族成員可能也在一定程度上響應(yīng)GA的調(diào)控。前人研究發(fā)現(xiàn)DlWUS含有赤霉素應(yīng)答元件(P-box)且施加低濃度的GA可以促進(jìn)DlWUS的表達(dá)，從而調(diào)控龍眼體胚發(fā)生過程[25]。結(jié)合qRT-PCR結(jié)果，推測(cè)龍眼WOX家族可能通過響應(yīng)GA來調(diào)控龍眼體胚發(fā)生。

研究表明MeJA的應(yīng)用以濃度依賴性方式抑制愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)、胚性懸浮液的增殖、分化以及體細(xì)胞胚的萌發(fā)和轉(zhuǎn)化[43-44]。在紫苜蓿的體細(xì)胞胚胎中，MeJA以不同的方式影響1-氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)積累；在愈傷組織中檢測(cè)到ACC的增加，而在球形胚中發(fā)現(xiàn)ACC水平降低[45]；適宜濃度的MeJA能使雜交鵝掌楸的體胚發(fā)生率和成熟率升高并且降低畸形率[46]；在橡膠樹中MeJA可以誘導(dǎo)體胚過程中的花青素積累[47]。通過分析qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龍眼WOX家族成員都在一定程度上響應(yīng)MeJA調(diào)控，除DlWOX6外其余成員均呈上調(diào)表達(dá)。DlWOX6、DlWOX11、DlWOX9A、DlWOX2都含有MeJA響應(yīng)元件，DlWOX14.2和DlWOX7不包含該響應(yīng)元件，在MeJA的處理下也能呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，猜測(cè)龍眼WOX家族可能有復(fù)雜的激素調(diào)控關(guān)系。

本研究通過qRT-PCR檢測(cè)龍眼WOX家族在GA和MeJA處理下的表達(dá)模式，大部分DlWOX家族成員在GA和MeJA處理下表達(dá)上調(diào)。值得注意的是DlWOX9A在GA和MEJA處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)該成員可能與一些激素互作，共同參與龍眼體胚發(fā)生，但是具體的過程還需要更進(jìn)一步的研究。