不同方法檢測淋球菌的臨床應(yīng)用評價

韓 磊，楊麗娟，曹守勤

淋病是由淋病奈瑟菌(簡稱淋球菌)感染引起的以泌尿生殖系統(tǒng)、化膿性感染為主要特征的一種性傳播疾病，如不及時治療可向周圍組織擴(kuò)散引起各類相應(yīng)的并發(fā)癥和后遺癥[1]。因此，探討淋球菌特異性和敏感性的檢測方法以及對抗菌藥物的敏感性程度具有重要意義。本文將寧夏銀川市婦幼保健院性病門診以及婦科門診就診的300例宮頸或尿道分泌物標(biāo)本進(jìn)行直接涂片鏡檢法、分離培養(yǎng)鑒定法和熒光定量PCR法檢測，比較檢測結(jié)果，從而為臨床檢測和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2018年1月至2019年12月在寧夏銀川市婦幼保健院性病門診以及婦科門診就診的患者300例，其中男性患者120例，女性患者180例，年齡在18～60歲之間，平均年齡為(28.9±3.6)歲。選取同期于我院健康體檢者100例為健康對照組，其中男性體檢者25例，女性體檢者75例，年齡在22～65歲之間，平均年齡為(31.7±7.6)歲。

1.2 標(biāo)本采集：男性以無菌拭子采集尿道口分泌物送檢，女性取宮頸分泌物送檢。 將拭子插入男性尿道口或女性宮頸口2～3 cm，旋轉(zhuǎn)2～3周并停留5～10 s 后取出；尿道口出現(xiàn)分泌物時，可直接用棉拭子醮取分泌物送檢。所有樣品均采樣一式三份，分別置于無菌采樣管中并立即送檢[2]。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器：光學(xué)顯微鏡是日本生產(chǎn)的OLYMU型，CO2培養(yǎng)箱是芬蘭生產(chǎn)的 2306型，生物安全柜是美國生產(chǎn)的LABCONCO型，實時熒光定量PCR是羅氏診斷公司生產(chǎn)的。

1.3.2 試劑：T-M培養(yǎng)基購自杭州濱河微生物試劑有限公司、革蘭氏染液購自bioMerieux sa公司，氧化酶試劑購自珠海迪爾生物工程有限公司，糖發(fā)酵管購自杭州濱河微生物試劑有限公司，PCR試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，試劑均在有效期內(nèi)。

1.4 檢測方法[3]

1.4.1 直接涂片法：將拭子在載玻片上輕輕滾動涂片，在室溫中自然干燥，經(jīng)火焰固定，再進(jìn)行革蘭氏染色，待干，油鏡下在膿細(xì)胞內(nèi)外查找形態(tài)典型的革蘭氏陰性雙球菌。

1.4.2 培養(yǎng)法：在T-M培養(yǎng)基上，用接種環(huán)從涂有分泌物處進(jìn)行四區(qū)劃線分離接種。在35～36 ℃、濕度大于70%、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，孵育24～48 h可出現(xiàn)疑似菌落。

1.4.3 鑒定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)菌落形態(tài)挑取可疑菌落，涂片固定后進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下尋找革蘭氏陰性雙球菌，然后做氧化酶試驗為陽性者，初步鑒定為淋球菌，再做淋球菌生化試驗(葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、蔗糖和乳糖)，最后鑒定是否為淋球菌。

1.4.4 熒光定量PCR法：試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的淋球菌核酸擴(kuò)增(NGH-DNA)檢測試劑盒；擴(kuò)增儀為羅氏診斷公司生產(chǎn)的LightCyclerR480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀。檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明書和本中心性病實驗室的SOP要求進(jìn)行操作。淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由寧夏疾病預(yù)防控制中心提供，作為試驗的陽性對照菌株使用。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法結(jié)果作為檢測淋球菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，直接涂片法檢測的靈敏性和特異性分別為75.0%和92.0%；熒光PCR法檢測的靈敏性和特異性分別為95.0%和89.0%。熒光PCR法檢測的敏感性明顯高于直接涂片法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同方法檢測淋球菌檢測結(jié)果比較

3 討論

淋病是目前國內(nèi)廣泛流行的性傳播疾病(STD)之一，其病原體為淋球菌，它是一種嚴(yán)格的人體寄生菌，存在于急慢性尿道炎和陰道炎的膿性分泌物及新生兒眼分泌物中，可引起女性的不育癥、宮內(nèi)感染、流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎以及新生兒失明[4]等嚴(yán)重疾病。同時，在發(fā)病過程中可誘發(fā)附睪炎、盆腔炎等，對患者的身心健康帶來了較大的傷害，因此，對于淋病奈瑟菌的早期診斷至關(guān)重要。近年來，淋球菌病原體的發(fā)病率在我國雖然沒有梅毒感染率高，但也是梅毒之后的第二大性傳播疾病[5]。淋病感染者多數(shù)臨床癥狀較輕或無臨床癥狀，不容易引起感染淋病的人重視，甚至濫用抗生素的治療等，因此常常導(dǎo)致隱匿感染，慢性持續(xù)感染狀態(tài)及帶菌狀態(tài)[6]，容易在性伴侶之間交叉?zhèn)鞑?。因為淋球菌感染有機(jī)會在性伴之間交叉?zhèn)鞑ィ藗儗TD的認(rèn)知有所提高，在性病門診和婦科門診就診的患者會要求進(jìn)行淋球菌檢測。因此我院應(yīng)該選擇臨床上更適合淋球菌檢出的檢驗方法，對性病門診患者進(jìn)行淋球菌篩查，早發(fā)現(xiàn)、早治療甚至減少慢性感染與并發(fā)癥發(fā)生率顯得更為重要[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，以分離培養(yǎng)法作為診斷淋球菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，直接涂片法的敏感性(75.0%)，明顯低于熒光PCR法的敏感性(95.0%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1，與國內(nèi)文獻(xiàn)報道基本一致[8]。這有可能是患者曾經(jīng)治療過或者不愿去醫(yī)院進(jìn)行正規(guī)治療，使患者的病情減輕或轉(zhuǎn)化成慢性炎癥，以致淋球菌數(shù)目減少，分泌物中其他雜菌干擾導(dǎo)致的。

淋球菌的實驗室檢測方法多種多樣，不同的檢測方法有各自的優(yōu)缺點和各自的使用范圍，本文主要研究了臨床上比較常用的三種檢測淋球菌的方法。分離培養(yǎng)法是WHO推薦的檢測和診斷淋球菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但淋球菌營養(yǎng)要求較高，對外界環(huán)境中的濕度、溫度等抵抗力比較差，離體后容易死亡和自溶，另外在性病門診和婦科門診采集的分泌物有時不能及時送檢會出現(xiàn)不合格的標(biāo)本，此外分離培養(yǎng)的時間需要數(shù)日，容易耽誤病情。傳統(tǒng)的直接涂片法操作簡單，也不需要特殊的儀器，結(jié)果直觀、快速，候診時間短，費用低，能夠起到臨床提示再用，但女性標(biāo)本受多種因素的影響，結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，因此對檢驗人員的檢測技術(shù)和臨床經(jīng)驗要求較高。熒光PCR法雖說具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確和快速等特點，但是也容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，要嚴(yán)格按照PCR的SOP進(jìn)行操作，建立防污染措施，防止殘留污染和標(biāo)本間擴(kuò)增序列交叉感染，試驗全過程一定要設(shè)立陰、陽性對照[9]，所需費用較高，無法在基層醫(yī)院普遍適用。

淋病是危害人類身體健康的重要性病之一，隨著人們思想意識的開放，人口流動的加劇，淋病的發(fā)病率逐年增加，淋病的防治已成為十分重要的社會和醫(yī)學(xué)問題。實驗室應(yīng)選擇一種快速，且敏感性和特異性好的方法，以便能盡早、準(zhǔn)確地診斷淋病[10]。本文認(rèn)為，我院檢驗科對疑似病例先后采用直接涂片法和熒光PCR法檢測，基本能夠滿足臨床需要；對于慢性或者治療后的患者，我們宜采用分離培養(yǎng)法。選擇正確的檢測方法，結(jié)合患者的病史、臨床表現(xiàn)及淋病治療情況等進(jìn)行綜合分析，及早、準(zhǔn)確地為淋病診斷和治療提供重要的依據(jù)。