PI3K/AKT信號(hào)通路參與地塞米松促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的研究

程鎖利，鞏 凡，牛東生，孫璽淳，白志剛，黃 朋，郭崇軍，梁鈺琪，郭舟桐

激素性股骨頭缺血性壞死是由大量使用糖皮質(zhì)激素引起的全身性多發(fā)性骨壞死,最常見發(fā)生的部位是股骨頭，其主要癥狀是髖關(guān)節(jié)的活動(dòng)性疼痛,如果不及時(shí)有效的治療，會(huì)進(jìn)行性的加重，最終導(dǎo)致患者殘疾和畸形[1]。雖然糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激素性股骨頭缺血壞死的確切機(jī)制尚不清楚，但它似乎與骨細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。最近的證據(jù)表明，骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白積累的結(jié)果,長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下和蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷大于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力的情況下，往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞功能障礙和死亡[2-4]。因此，了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激如何在骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞病理生理學(xué)中起作用，是對(duì)激素性股骨頭缺血壞死疾病進(jìn)行治療調(diào)整的重要一步。本研究探討DEX對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖和凋亡及BMSCs細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步闡明了部分相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制,為 SANFH 的臨床治療提供基礎(chǔ)性的研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：原代人BMSCs(深圳Otwo Biotech公司)；Thapsi-gargin (T135258，Aladdin 純度95%)；BYL719(購(gòu)自 AbMole，M8791)；ELISA試劑盒(武漢恒意賽)；Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo)；流式細(xì)胞儀器(Bio-Rad)；Western-blot儀(Bio-Rad)；SYBR Green PCR 試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng):原代人 BMSCs購(gòu)自 Otwo Biotech (ShenZhen) Inc.。BMSCs在 Dulbecco 改良鷹培養(yǎng)基 (DMEM)/1% 青霉素/鏈霉素/10% 去除外泌體的胎牛血清中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)物保持在37°C 的 5% CO2中，每3天更換一次培養(yǎng)基，并用0.05% 胰蛋白酶/EDTA 傳代細(xì)胞。Thapsi-gargin(毒胡蘿卜素)(T135258，Aladdin,≥95%) 是ERS的特異性誘導(dǎo)劑。在本研究中，將終濃度為 100 nM 的毒胡蘿卜素加入培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)48 h，以誘導(dǎo) ERS 作為陽(yáng)性對(duì)照BYL719(一種 PI3K抑制劑，購(gòu)自 AbMole，M8692)用于進(jìn)一步驗(yàn)證 DEX 是否通過PI3K/AKT 信號(hào)通路激活ERS，并且該方法如前所述。將BYL719 溶于含有 5% DMSO 的PBS中，濃度設(shè)為10 μM。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):將BMSC以1×105細(xì)胞/孔的密度一式三份接種在 96孔板中，并在 37 ℃和5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。根據(jù)制造商的說明使用Quantikine ELISA Kit Human IGF-1 (R&D Systems)來測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IGF-1水平。通過內(nèi)插法從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算對(duì)照和樣品中的抗原量。

1.4 細(xì)胞增殖試驗(yàn):將 BMSCs以1×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板上含有10%FBS的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞與指定濃度的DEX孵育24 h，然后使用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo)進(jìn)行計(jì)數(shù)。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù):用DEXCSR-CK001(Cosmo Bio)處理后，根據(jù)制造商的說明，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche Applied Science)對(duì)BMSCs進(jìn)行熒光標(biāo)記。收集BMSCs顆粒并用冷 PBS 洗滌兩次，然后輕輕重懸在500 μL含有5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI的結(jié)合緩沖液中，室溫下15 min。然后，使用流式細(xì)胞術(shù)(BD Biosciences)分析樣品。

1.6 Western-blot BMSC:用冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并在2X十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液100 mM Tris-HCl(pH 6.8)、10 mM EDTA、4%SDS和10%甘氨酸)中裂解1 h。12,000 μg離心15 min，然后用增強(qiáng)型BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Beyotime)測(cè)量蛋白質(zhì)含量。每個(gè)泳道中等量(30 μg)的蛋白質(zhì)通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。為了檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)，使用了以下抗體：PI3K(CST，3 192，1∶1 000)、ATF6 (Cosmo Bio，AM-73-500-B，1∶1 000)、TFAR19 (Abcam，ab83958，1∶1 000)、IGF1 (Cosmo Bio，KM2076，1∶1 000)，IRE1a (Abcam，ab146176，1∶1 000)，AKT (Abcam，ab62352，1∶1 000)，β-catenin (CST 84800，1)。抗兔 (111-035-003) 和抗小鼠 (115-035-003) HRP 偶聯(lián)二抗購(gòu)自 Jackson ImmunoResearch，使用蛋白質(zhì)印跡魯米諾試劑 (Santacruz，sc-2048) 顯示信號(hào)。

1.7 定量實(shí)時(shí) PCR (qRT-PCR) 驗(yàn)證:使用 TRIzol 試劑(Invitrogen)從組織中提取總 RNA(根據(jù)試劑盒說明書操作流程進(jìn)行)。使用 ImProm Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega) 逆轉(zhuǎn)錄總RNA(根據(jù)試劑盒說明書操作流程進(jìn)行)。使用SYBR Green PCR試劑盒 (Ta Ka Ra)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用 2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)倍數(shù)變化，并使用甘油醛3-磷酸脫氫酶 (GAPDH) mRNA 作為內(nèi)部對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)均在相同條件下進(jìn)行，至少重復(fù)3次。合成了以下序列特異性引物：

GAPDH正義：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′；

GAPDH 反義：5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′；

IRE1 α正義：5′-GAATTCATGCCGGCCCGGCGGCTGCTGCTG-3′；

IRE1 α反義：5′-AAGCTTGAGGGCGTCTGGAGTCACTGGGGGC-3′;

PI3K正義：5′-TCATCCAGCCTTAGCAAACC-3′；

PI3K 反義：5′-ATGCTTTCACGGTCTTGGTC-3′；

ATF6 正義：5′-CTTCCTCCAGTTGCTCCATC-3′；

ATF6 反義：5′-CAACTCCTCAGGAACGTGCT-3′。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DEX抑制BMSCs增殖結(jié)果比較:DEX的濃度設(shè)定為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L和10-6mol/L，以不含DEX的培養(yǎng)基為對(duì)照，隨著DEX濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，BMSCs的細(xì)胞活性逐漸降低(P<0.05),見圖1。然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)因子IGF1的表達(dá)，結(jié)果表明，隨著DEX濃度的增加，IGF1的表達(dá)逐漸降低，表明DEX可以抑制BMSCs的增殖見圖2。ELISA法定量分析 BMSCs中IGF1 的分泌見圖3，數(shù)據(jù)表明，隨著濃度的增加，IGF11的濃度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在20 d時(shí)趨于穩(wěn)定，DEX的濃度為10-7mol/L。

2.2 不同濃度DEX對(duì)BMSCs凋亡的影響:流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，隨著DEX濃度的增加，BMSCs的凋亡百分比逐漸增加(圖4A和圖4B，目錄后)。隨著DEX濃度的增加，凋亡相關(guān)蛋白 TEAR19 的表達(dá)增加(P<0.05)，見圖5(目錄后)，表明DEX可以促進(jìn)BMSCs的凋亡。

2.3 DEX激活BMSCs的ERS:檢測(cè)BMSCs經(jīng)DEX處理后兩種ERS相關(guān)因子(IRE1a 和 ATF6)的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，隨著DEX濃度的增加，ATF6和IRE1a的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見圖6(目錄后)。此外，從蛋白質(zhì)印跡分析中獲得了類似的結(jié)果，隨著DEX濃度的增加，ATF6、p-IRE1a/IRE1a蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖7(目錄后)。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡分析均表明，DEX 處理可能通過調(diào)節(jié) ERS 相關(guān)蛋白(ATF6和 IRE1a)來激活 BMSCs 的 ERS。

2.4 DEX通過PI3K/AKT通路激活BMSCs的ERS:Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMSCs經(jīng)DEX處理后，PI3K、AKT蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見圖7(目錄后)。考慮到當(dāng)DEX濃度增加時(shí)PI3K的表達(dá)增加，使用BYL719(一種PI3K抑制劑)進(jìn)一步驗(yàn)證DEX是否通過PI3K/AKT信號(hào)通路激活ERS。在這個(gè)過程中，毒胡蘿卜素用于誘導(dǎo)ERS。DEX顯著促進(jìn)PI3K和AKT蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)TEAR19的增加和IGF1的減少(P<0.05)，見圖8(目錄后)。Thapsigargin 是一種 ERS特異性誘導(dǎo)劑，對(duì)這些蛋白質(zhì)的作用與 DEX 相似，而且作用更明顯。在 DEX 的基礎(chǔ)上聯(lián)合 BYL719顯著降低了DEX對(duì)PI3K、AKT和TEAR19 的促進(jìn)作用，以及對(duì) IGF1 的抑制作用。這表明使用 BYL719可能會(huì)部分緩解DEX引起的ERS。圖9(目錄后)顯示，BYL719不僅促進(jìn)細(xì)胞活力，而且挽救了DEX對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用 (P<0.05)。此外，BYL719的加入也減弱了 DEX 對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明抑制PI3K/AKT減少了DEX對(duì)增殖的抑制和對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)。以上均表明DEX通過PI3K/AKT途徑激活ERS，影響B(tài)MSCs的細(xì)胞行為。

3 討論

糖皮質(zhì)激素是一種由人腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇激素，參與調(diào)節(jié)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的生物合成和代謝以及炎癥反應(yīng)[5-6]。1953年，Pietrogrande 等人報(bào)道了首例應(yīng)用糖皮質(zhì)激素后股骨頭壞死的病例[7]。近年來，由于糖皮質(zhì)激素的廣泛使用，SANFH的患病率不斷上升，約占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的51%，并呈年輕化趨勢(shì)。大量研究表明，SANFH的發(fā)生與多種因素有關(guān)[8-9]。目前其發(fā)病機(jī)制和病理過程尚未闡明，但提出了多種假說，主要包括兩種學(xué)說：①細(xì)胞壞死學(xué)說，包括脂肪代謝障礙、骨質(zhì)疏松、骨內(nèi)壓增高、血管內(nèi)凝血等。②細(xì)胞凋亡學(xué)說，包括激素代謝、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化、基因多態(tài)性等的影響。疾病的發(fā)展可能對(duì)股骨頭造成不可逆的損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，任何治療都不能完全逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展。因此，研究SANFH的發(fā)病機(jī)制對(duì)于預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

研究表明在糖皮質(zhì)激素作用下，BMSCs可分化為脂肪細(xì)胞，引起細(xì)胞增殖肥大，導(dǎo)致骨缺血性壞死[10]、大劑量DEX可影響B(tài)MSCs的脂質(zhì)代謝[11-12]。本研究證明DEX可以抑制BMSCs的增殖和促進(jìn)其凋亡，并且這種作用以與劑量無(wú)關(guān)的方式增強(qiáng)。我們的結(jié)果與之前的研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)DEX既可以抑制BMSCs的增殖，也可以促進(jìn)BMSCs的凋亡。BMSCs功能異常會(huì)導(dǎo)致ERS，早期ERS反應(yīng)由三種跨膜受體即PERK、ATF6 和 IRE1 介導(dǎo)[13]。這是非常經(jīng)典的理論，但在實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)并非是單一的，這恰恰支持了生物經(jīng)濟(jì)學(xué)的基本原理，在正常細(xì)胞中ATF6和IRE1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的分子伴侶GRP78結(jié)合以維持非激活狀態(tài)。當(dāng)壓力發(fā)生時(shí)，兩個(gè)受體分離，導(dǎo)致受體激活和 ERS。早期ERS是一種促生存反應(yīng)，可以幫助減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不足以保護(hù)細(xì)胞存活時(shí)，ERS會(huì)作為凋亡信號(hào)的起源誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]，我們已經(jīng)證明DEX可以激活BMSCs的ERS。在ATF6和IRE1中，PI3K/AKT的表達(dá)隨DEX濃度的變化而變化。因此，我們?cè)诮酉聛淼难芯恐兄饕接懥薖I3K/AKT通路涉及 DEX 介導(dǎo)的 BMSCs 增殖和凋亡的潛在分子機(jī)制。

眾所周知，PI3K/AKT是非常經(jīng)典的調(diào)控通路，參與了很多的細(xì)胞活動(dòng)。先前的研究報(bào)告稱，PI3K/AKT的下游因子非常多[15]，可以誘導(dǎo)細(xì)胞狀態(tài)。我們檢測(cè)了不同濃度DEX下相關(guān)細(xì)胞蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)DEX可以增加PI3K/AKT的磷酸化水平，DEX 還可以誘導(dǎo)蛋白的易位，當(dāng)ERS過多時(shí)，會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡加入。BYL719可以逆轉(zhuǎn)DEX對(duì)BMSCs細(xì)胞行為的影響，但三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明其逆轉(zhuǎn)的強(qiáng)度似乎在細(xì)胞的傳代有下降的趨勢(shì)，所以說調(diào)控肯定是多節(jié)點(diǎn)、多通路的[15]。

本研究探討了DEX對(duì)BMSCs細(xì)胞行為的影響，結(jié)果表明DEX可促進(jìn)BMSCs凋亡，抑制細(xì)胞活力，在調(diào)節(jié)BMSCs的ERS中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步深入的機(jī)制研究表明，DEX可以通過激活PI3K通路來激活或者部分激活BMSCs的ERS現(xiàn)象，并影響B(tài)MSCs 的細(xì)胞行為。本研究可為DEX在SANFH臨床治療中的應(yīng)用提供部分基礎(chǔ)理論依據(jù)。