肺泡灌洗液與血清GM試驗在侵襲性肺曲霉菌病中的診斷判定評價

袁立志,孟凡珍，崔 華,尹 梅，周 瑋

侵襲性肺曲霉病(IPA)主要發(fā)生于免疫功能障礙或有多種基礎疾病的患者,病死率可達60%以上[1],其臨床表現不典型、特異性不高，胸部影像學表現多變，不利于早期診斷，嚴重影響患者的預后。組織病理學是IPA診斷的金標準，但獲取標本困難限制了它在臨床的廣泛應用。微生物檢測，易受標本合格與否、運送過程是否有污染等多種因素的干擾，其敏感度不高，僅為30%～50%[2-3]。真菌抗原檢測技術目前已在臨床中廣泛應用，半乳甘露聚糖(GM)是曲霉菌細胞壁上的一種重要成分，可早期釋放于體液，對于IPA的早期診斷具有一定的特異性和敏感性。本研究通過分析擬診IPA患者的BALF與血清兩種標本的GM實驗結果，結合真菌培養(yǎng)，探討兩種標本在 IPA診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2018年1月至2020年12月入住寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院及其分支醫(yī)院各個科室的擬診肺部真菌感染住院患者374例，其中男性214例，女性160例，年齡41～78歲。所有患者均接受血清GM試驗、肺泡灌洗液真菌培養(yǎng)及GM試驗檢查。入選標準：患者多為免疫力低下或有缺陷者，多合并基礎疾病，包括2型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、慢性腎功能不全、心功能不全、晚期腫瘤接受放化療，或者曾多次住院接受多種、多類廣譜抗生素抗感染治療以及接受糖皮質激素治療患者。入選病例主要以發(fā)熱，咳嗽、咳痰、胸悶、氣短為主要臨床表現，常規(guī)抗感染治療效果不佳，胸部影像學以支氣管囊柱狀擴張，空洞形成，暈輪征、新月體征為主要表現;多有發(fā)熱、咳痰、氣短癥狀，普通感染治療后癥狀無好轉，甚至加重，胸部影像學為肺部結節(jié)、空洞及暈癥等表現。排除標準：不能耐受氣管鏡檢查或近期有大咯血、合并嚴重心腦血管疾病、惡性心律失常等氣管鏡檢查禁忌證患者。

1.2 儀器和試劑：沙保弱式培養(yǎng)基(鄭州人福博賽生物技術有限公司)；酶標儀(Tecan公司)Bio-rad 洗板機(美國伯樂)；高速冷凍離心機(賽默飛世爾)；旋渦混合器(其林貝爾VORTEX-5)；生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)；SSW-600-2S 型電熱恒溫水槽(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；曲霉菌抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法，96 人份/盒，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

1.3 IPA診斷標準：IPA診斷標準根據我國制定的《肺真菌病診斷和治療專家共識》[4]及《侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則》[5]等有關標準，同時根據宿主因素、臨床癥狀、病原學檢查結果3個標準對IPA診斷進行綜合判斷。

1.4 樣本收集

1.4.1 肺泡灌洗液收集：按照電子支氣管鏡操作流程對患者進行術前霧化麻醉，測量生命體征。術前準備完畢后患者取平臥位，氣管鏡自鼻孔通過聲門到達主支氣管，然后對各葉段支氣管進行常規(guī)檢查、拍照。隨后電子支氣管鏡頂端置入病變所在的亞段支氣管，經活檢孔分2～3次注入常溫生理鹽水，每次用量約為20 mL，用負壓吸引器迅速回收灌洗液，盡量回收充分，將回收液裝入硅塑瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 血液標本采集：在氣管鏡檢查當日清晨按照標準操作規(guī)程采集非抗凝血3 mL，放入4 ℃冰箱保存等待檢測。

1.5 樣本GM實驗檢測原理：血清標本與BALF標本檢測方法相同，實驗采用ELISA方法，使用特異性抗體檢測曲霉半乳甘露聚糖抗原。先將預處理過的待檢測血清或BALF標本與抗半乳甘露聚糖抗體分別加入包被有曲霉菌半乳甘露聚糖酶的微板小孔里，經育溫和洗板后加入酶標抗體，再次沖洗除去沒有結合的物質，加顯色液發(fā)生顯示反應，用酶標儀測定吸光度。每次檢測均設陰性對照、陽性對照、臨界值對照以驗證實驗結果的有效性。樣本要求與檢測方法嚴格按照試劑說明書進行操作，BALF和血清GM試驗以待測標本的指數I≥0.5為診斷界值。

1.6 真菌培養(yǎng)與結果鑒定：用無菌接種針蘸取BALF 10 μL，接種于瓊脂培養(yǎng)基中，放置在37 ℃溫箱中培養(yǎng)。 分別在接種24、48和72 h后對培養(yǎng)基上菌落的生長顏色與形態(tài)進行觀察，初步判斷是否為曲霉菌。然后取少量沙保羅平皿上疑似曲霉菌放置在潔凈的玻片上，經棉藍染色后鏡檢觀察，若是鏡下發(fā)現分隔的，呈45°角分支的菌絲即可以判定為曲霉菌培養(yǎng)陽性。

1.7 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，按照廠家推薦標準，BALF和血清GM試驗以待測標本的指數I≥0.5 為診斷界值。 采用χ2檢驗分析GM試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值的差異，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺泡灌洗液(BALF)真菌培養(yǎng)結果及GM實驗I值分布情況：374例入選病例中，共培養(yǎng)出真菌患者226例，其中曲霉菌陽性患者103例，念珠菌陽性患者123例；148例培養(yǎng)結果陰性。與相同I值的曲霉菌陽性組病例數量比較，念珠菌陽性組與培養(yǎng)陰性組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。曲霉菌陽性患者中，75例(72.82%)GM實驗I值結果大于2，I值小于0.5患者2例(1.94%)，0.5～1為6例(5.83%)，1～1.5為8例(7.77%)，1.5～2為12例(11.65%)，平均I值結果為(3.54±1.06)；念珠菌陽性組與培養(yǎng)陰性組GM實驗I值結果均小于0.5，所占比例分別為74例(60.16%)與120例(77.70%)，2組與相同I值的曲霉菌陽性組進行比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中I>2時差別最為明顯，見表1。

表1 肺泡灌洗液(BALF)真菌培養(yǎng)結果及GM實驗I值分布情況

2.2 肺泡灌洗液(BALF)GM實驗檢測I值與肺曲霉菌病(IPA)診斷符合率:在所有入選病例中共有103例曲霉菌培養(yǎng)結果陽性，在判斷肺泡灌洗液GM實驗結果I值與IPA診斷符合率時，如果將臨界值設定為0.5，診斷敏感性為98.60%，特異性為74.50%，陽性預測值55.19%，陰性預測值98.95%；如果將臨界值設定為1.0，診斷敏感性為92.30%，特異性為84.10%，陽性預測值67.86%，陰性預測值96.58%；將臨界值設定為1.5，診斷敏感性為84.50%，特異性為92.60%，陽性預測值79.82%，陰性預測值93.96%；如果將臨界值設定為2.0，診斷敏感性為71.80%，特異性為96.70%，陽性預測值89.29%，陰性預測值90.34%。見圖1(目錄后)，當GM實驗值為1.369 ng/mL時，ROC曲線下面積最大為0.954，此時敏感性為89.30%，特異度為91.10%，將GM值設定為1.369 ng/mL為最佳閾值。

2.3 肺泡灌洗液(BALF)真菌培養(yǎng)結果與血清GM實驗I值分布情況:103例經肺泡灌洗液真菌培養(yǎng)確診的肺曲霉菌病患者中，在行灌洗液GM實驗檢測的同時，也接受了血清GM實驗檢測，其中47例(45.63%)患者實驗結果I值小于0.5；23例(22.33%)I值在0.5～1,18例(17.48%)在1～1.5，9例(8.74%)在1.5～2，6例(5.83%)I值大于2。念珠菌陽性組與培養(yǎng)陰性組患者肺泡灌洗液GM實驗I值均以小于0.5為主，所占比例分別為84例(68.29%)，124例(83.78%),見表3。

表3 肺泡灌洗液(BALF)真菌培養(yǎng)結果與血清GM實驗I值分布情況

2.4 血清GM實驗檢測不同臨界值I與IPA診斷符合率:在判斷血清GM實驗結果I值與IPA診斷符合率時，如果將臨界值設定為0.5，診斷敏感性為54.30%，特異性為77.10%，陽性預測值47.10%，陰性預測值81.60%；如果將臨界值設定為1.0，診斷敏感性為32.00%，特異性為87.10%，陽性預測值56.90%，陰性預測值77.80%；如果將臨界值設定為1.5，診斷敏感性為14.60%，特異性為94.50%，陽性預測值51.70%，陰性預測值94.50%；如果將臨界值設定為2.0，診斷敏感性為5.80%，特異性為98.50%，陽性預測值60.00%,陰性預測值為73.40%。見圖2(目錄后)，當血清GM實驗值為0.512 ng/mL時，ROC曲線下面積最大為0.649，此時敏感性為54.40%，特異度為77.10%，將血清GM實驗閾值設定為0.512 ng/mL為最佳閾值。

3 討論

侵襲性肺曲霉菌病(IPA)是曲霉菌侵犯肺組織后引起的深部真菌感染性疾病，為侵襲性肺真菌感染(IPFI)的一種，該病以發(fā)展成壞死性出血性肺炎，形成多發(fā)性肺膿腫或肉芽腫為特征，病情進展迅速，臨床癥狀兇險，常因漏診、誤診致使患者未得到及時治療從而使死亡率有所上升[6]。目前該病診斷的金標準是組織病理學，但是臨床上因病灶部位、患者特征、主觀意愿等因素存在取材困難，陰性結果無法有效排除曲霉菌肺炎等問題，臨床普遍開展存在困難。病原學檢查是診斷肺曲霉病重要的基礎方法，經痰或血液培養(yǎng)出曲霉菌可以作為確診標準之一[7]。但傳統(tǒng)的實驗室培養(yǎng)，存在耗時長、陽性率低、敏感性差等缺點，在一定程度上限制了臨床上對IPA的早期診斷。目前G試驗與GM試驗等真菌抗原檢測技術已經在臨床中廣泛應用。曲霉菌肺炎的早期病變局限在肺部，相關抗原暫未釋放入血或者少量釋放入血，容易導致血清GM試驗出現假陰性結果，同時血清GM實驗，容易受如輸注血液制品，進行血液透析，使用抗腫瘤、磺胺類抗生素等藥物，使用半合成青霉素等各種因素影響而出現假陽性或者假陰性結果，不利于IPA的早期診斷[8-10]。在BALF中，存在大量的吞噬細菌，能將真菌吞噬后釋放較多的半乳甘露聚糖，半乳甘露聚糖廣泛分布于曲霉菌細胞壁中，當這些成分進入人體血液或深部組織，被吞噬細胞吞噬消化后，半乳甘露聚糖從細胞壁中釋出[11-13]。 因此，BALF標本GM試驗檢測可以成為IPA輔助診斷的重要手段之一，但是目前國內外尚無公認的BALF樣本GM實驗對于IPA的診斷閾值，致使臨床醫(yī)師對該病的診斷率也參差不齊。為此，本研究通過分析374例BALF及血清的GM試驗結果，根據真菌培養(yǎng)結果進行比較和分析，為BALF樣本GM試驗在診斷IPA時I值的臨界值設定提供參考。

本研究共納入患者374例，對所有患者BALF標本進行培養(yǎng)后，共培養(yǎng)出真菌感染患者226例，其中曲霉菌陽性患者103例。不同培養(yǎng)結果組BALF標本的GM結果具有明顯統(tǒng)計學差異，說明BALF標本GM實驗可以對IPA診斷判定提供有效依據。從表2我們可以看出，按全國臨床檢驗操作規(guī)程[14]，如果將診斷閾值設定為0.5，有82例假陽性患者，特異度為69.74%。根據IPA診治指南推薦，IPA的抗真菌療程一般為6～12周，加之抗真菌治療藥物價格昂貴，如將診斷閾值設定為0.5，會明顯增加誤診率，從而增加患者經濟負擔以及抗真菌治療藥物可能出現的患者肝腎功能損傷概率。為此，本研究進一步分析了肺泡灌洗液GM實驗檢測I值與肺曲霉菌病診斷符合率的關系，當把臨界值分別設定為0.5、1.0、1.5、2.0時敏感性、陰性預測值逐步下降，但是特異性、陽性預測值逐漸增高。根據圖1的ROC曲線我們可以看出，當把肺泡灌洗液GM閾值設定為1.369 ng/mL時，此時AUC最大為0.954，診斷意義最佳。此結論與Zhang XB[15]等人建議的將BALF閾值設定為1.0不符。在本研究統(tǒng)計的BALF標本中，有些病例真菌培養(yǎng)為陰性，但是GM 試驗結果明顯升高，表現為假陽性，可能原因為BALF在收集過程中與外界相通，呈非密閉性，產生了一些病原體污染樣本，或某些外抗原與GM 試驗發(fā)生交叉反應導致GM 實驗呈現假陽性[16]。

按照GM實驗試劑盒推薦閾值0.5統(tǒng)計，103例BALF培養(yǎng)陽性患者中，有56例(54.37%)患者血液GM實驗結果符合，而有47例(45.63%)患者為假陰性，明顯低于肺泡灌洗液101例(98.06%)的陽性率。根據血清GM實驗診斷侵襲性肺曲霉菌病的ROC曲線我們可以看出，當GM閾值設定為0.512 ng/mL時診斷意義最佳。但是與肺泡灌洗液GM實驗診斷曲霉菌肺炎的ROC曲線相比，其敏感性、特異性均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與國內外眾多相關研究結論[17-18]相符合。

綜上所述，在IPA診斷過程中，肺泡灌洗液GM試驗診斷侵襲性肺曲霉菌感染更具有準確性。我們可以將BALF的GM實驗診斷閾值設定為1.369 ng/mL。對于不能耐受氣管鏡的患者，可以通過血清GM實驗輔助診斷，這些患者將I值設定為0.512 ng/mL比較合理。