丙二醛、超氧化物歧化酶在糖尿病腎病患者血清中的表達(dá)及作用

曹釋露，田文竹，包 喜，保 莉，羅紅艷，馬風(fēng)珍，李紅梅，鄭亞莉

糖尿病(DM)是一種代謝性疾病，2017年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)指出目前全世界共有4.25億成人糖尿病患者，中國(guó)成人糖尿病患者數(shù)量高達(dá)1.14億，位居全球第一[1]。糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，約占糖尿病患者的30%～40%，是終末期腎病的主要原因之一[2]。大量研究證實(shí)尿微量白蛋白是糖尿病腎病早期診斷和心血管事件發(fā)生的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是并發(fā)心血管疾病死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。體內(nèi)、體外研究發(fā)現(xiàn)[4,8-10]，氧化應(yīng)激在糖尿病患者和糖尿病動(dòng)物模型中均有增強(qiáng)，同時(shí)一系列的研究表明，氧化應(yīng)激是糖尿病腎病進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵原因[5,11-13]。然而關(guān)于尿微量白蛋白與氧化應(yīng)激之間的研究尚少，因此本文通過(guò)分析氧化應(yīng)激因子丙二醛(MDA)、抗氧化應(yīng)激因子超氧化物歧化酶(SOD)與尿微量白蛋白的關(guān)系，進(jìn)一步探究氧化應(yīng)激在早期糖尿病腎病中的作用及其與蛋白尿形成的關(guān)系，為早期預(yù)防及治療糖尿病腎病蛋白尿的形成提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究為橫斷面研究。收集2018年12月至2020年5月于寧夏區(qū)人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科及內(nèi)分泌科的住院的2型糖尿病(DM)患者120例，DM患者均符合1999年WHO制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6,14]，DN患者均符合2019年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7,15]。120例患者中，男85例，女35例，平均年齡(56±12)歲，檢測(cè)其身高、體重、血壓，收集其臨床資料及血、尿標(biāo)本。

1.2 分組：根據(jù)24 h尿白蛋白定量分為3組[8]，①無(wú)蛋白尿組40例，即24 h尿白蛋白定量<30 mg;②微量蛋白尿組40例，即24 h尿白蛋白定量為30～300 mg;③大量蛋白尿組40例，即24 h尿白蛋白定量>300 mg。3組間性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組選擇同期于本院體檢的健康體檢者40 例。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)：①糖尿病腎病合并原發(fā)性腎臟病和其他原因引起的繼發(fā)性腎臟病，如慢性腎炎、高血壓腎損害、系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、惡性腫瘤等;②糖尿病腎病合并急慢性感染性疾病及發(fā)熱;③1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病、糖尿病酮癥酸中毒及其他急性并發(fā)癥;④近期使用對(duì)腎臟有害的藥物。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)本收集：所有受試者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血標(biāo)本，取3～4 mL標(biāo)本當(dāng)即于3 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，取上清液分裝于EP管中，放置于-80 ℃冰箱，余血液標(biāo)本送至我院檢驗(yàn)科檢測(cè)血紅蛋白、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均血小板體積、紅細(xì)胞分布寬度、尿酸、肌酐、尿素氮、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、糖化血紅蛋白、糖化血清白蛋白等指標(biāo)；所有患者于抽血當(dāng)日留取晨中段尿標(biāo)本送至我院檢驗(yàn)科測(cè)定尿微量白蛋白定量、24 h尿蛋白定量。

1.4.2 MDA、SOD測(cè)定：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測(cè)定血清中MDA、SOD含量，MDA試劑盒從武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司購(gòu)買(mǎi)，SOD試劑盒從武漢華聯(lián)科生物有限公司購(gòu)買(mǎi)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.3 結(jié)果判定：采用 CurveExpert 1.3軟件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度、OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣品在該曲線上的OD值，分別計(jì)算出相應(yīng)血清中MDA、SOD的含量。

1.4.4 估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)計(jì)算公式(CKD-EPI公式)：

eGFR = 141×min(Scr/k,1)α×ma×(Scr/k,1)-1.209×0.993Age×1.018(女性)×1.159(黑人)

単位：mL/min/1 .73m2

k = 0.7(女性)，0.9(男性)

α= -0.329(女性)，-0.411(男性)

Scr =血清肌酐,單位mg/dl

1 mg/dl = 88 .4 μmol/L

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較：各組間性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓等指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同受試者的一般資料比較

2.2 實(shí)驗(yàn)室資料的比較：患者的總膽固醇、甘油三酯、糖化血紅蛋白、糖化血清白蛋白在各組間無(wú)差異，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血紅蛋白、估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率在大量蛋白尿組與對(duì)照組、無(wú)蛋白尿組、微量蛋白尿組比較，明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尿酸、肌酐在大量蛋白尿組中較對(duì)照組、無(wú)蛋白尿組、微量蛋白尿組的值高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尿微量白蛋白、尿蛋白定量在大量蛋白尿組的值高于無(wú)蛋白尿組、微量蛋白尿組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 糖尿病腎病患者不同分期的臨床資料

2.3 血清MDA和SOD在不同組別的表達(dá)水平及分析：MDA在大量蛋白尿組較對(duì)照組、無(wú)蛋白尿組、微量蛋白尿組的值明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SOD在無(wú)蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組的表達(dá)較對(duì)照組比較明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3及圖1-圖2(封二)。

表3 糖尿病腎病患者不同組別的MDA、SOD水平

2.4 血清MDA、SOD的表達(dá)水平與尿蛋白的相關(guān)性分析：MDA表達(dá)與尿蛋白水平呈正相關(guān)性(r=0.667，P<0.05)。SOD表達(dá)與尿蛋白水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.51，P<0.05)。

2.5 血清MDA、SOD的表達(dá)水平與尿微量白蛋白的相關(guān)性分析：MDA表達(dá)與尿微量白蛋白水平呈正相關(guān)性(r=0.767，P<0.05)。SOD表達(dá)與尿微量白蛋白水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.863，P<0.05)。

2.6 血清MDA、SOD的表達(dá)水平與糖化血紅蛋白的相關(guān)性分析：MDA與糖化血紅蛋白呈正相關(guān)性(r=0.446，P<0.05)。SOD與糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.467，P<0.05)。

2.7 血清MDA、SOD的表達(dá)水平與尿酸的相關(guān)性分析：MDA與尿酸呈正相關(guān)性(r=0.489，P<0.05)。SOD與尿酸呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.38，P<0.05)。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病微血管的主要并發(fā)癥之一，早期DN的主要臨床表現(xiàn)是微量蛋白尿，隨著病情進(jìn)展，大多數(shù)DN患者會(huì)出現(xiàn)大量蛋白尿，腎功能衰竭，最終發(fā)展至尿毒癥[9]。約有50%的糖尿病腎病患者隨著病情的進(jìn)展進(jìn)入終末期腎臟病需要行透析或腎移植[10]，給社會(huì)和家庭造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前對(duì)DN的治療主要是以降糖、降壓、降尿蛋白為主[11]，但并沒(méi)有減少終末期腎臟病的發(fā)生率，因此防治早期糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展尤為重要。MDA是脂質(zhì)最終的過(guò)氧化產(chǎn)物，其表達(dá)水平可反映體內(nèi)氧自由基的水平，衡量氧化應(yīng)激的損傷程度[12]。SOD將超氧化物轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化物酶將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水，是一種抗氧化劑，可以催化超氧化物自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，其活性可反映機(jī)體抗氧化能力[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDA在糖尿病患者體內(nèi)的表達(dá)水平比正常人高，在糖尿病伴有腎損害患者的表達(dá)比無(wú)腎損害患者的表達(dá)高；SOD在糖尿病患者的活性比正常人低，提示氧化應(yīng)激可能在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，這與Parul Thakur[14]等人研究一致。

已有研究證明[15]，糖尿病腎病的病理生理與長(zhǎng)期血糖控制不良有關(guān)。長(zhǎng)期的高糖狀態(tài)可引起腎小球氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)數(shù)量的增加，啟動(dòng)腎小球纖維化造成組織損傷[16]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血糖控制不佳的患者M(jìn)DA的表達(dá)水平升高，SOD的表達(dá)水平降低，考慮血糖控制不佳，是血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激增加所致。

更重要的是，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDA在早期糖尿病腎病患者(微量蛋白尿組)的表達(dá)水平較正常組表達(dá)明顯升高，而在臨床糖尿病腎病(大量蛋白尿組)中的表達(dá)水平較早期糖尿病腎病的表達(dá)水平更高。相反，抗氧化應(yīng)激因子SOD在早期糖尿病腎病患者的表達(dá)較正常組表達(dá)明顯降低。這一結(jié)果說(shuō)明氧化應(yīng)激在糖尿病、糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起著很重要的作用，且隨著蛋白尿的進(jìn)展，氧化應(yīng)激程度更重，進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激在糖尿病腎病進(jìn)展中的作用。

本文進(jìn)一步觀察氧化應(yīng)激在早期糖尿病腎病發(fā)生的作用發(fā)現(xiàn)，MDA和SOD與尿微量白蛋白的相關(guān)系數(shù)較其與尿蛋白的相關(guān)系數(shù)更高，相關(guān)性更好，我們認(rèn)為氧化應(yīng)激可能參與早期糖尿病腎病微量尿蛋白的形成，在早期糖尿病腎病發(fā)生中起重要作用。所以，對(duì)糖尿病不伴腎臟損害的患者應(yīng)重視抗氧化應(yīng)激的治療，從而延緩疾病的進(jìn)展。近年來(lái)Bolignano[17]做的一項(xiàng)薈萃分析顯示，抗氧化劑可改善糖尿病腎病患者的早期腎損傷，降低發(fā)生蛋白尿的風(fēng)險(xiǎn)，本研究結(jié)果進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。

另外，本研究結(jié)果顯示，隨著尿酸水平的升高，MDA水平升高，SOD的活性降低，兩者有很好的相關(guān)性，說(shuō)明尿酸可能參與氧化應(yīng)激，加重腎臟病的損害。其機(jī)制可能與高尿酸增加內(nèi)皮細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)[18]。因此將尿酸控制在一定水平也可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕蛋白尿，延緩疾病進(jìn)展。