紅緣擬層孔菌菌絲的生物學(xué)特性研究*

吳龍?jiān)?，馬水麗，何小芳，蘇琮葆，葉麗云，湯坤鵬，吳小平**

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心，福建 福州 350002；2.福建省食用菌技術(shù)推廣總站，福建 福州 350003）

紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）隸屬于多孔菌目 （Polyporales）擬層孔菌科 （Fomitopsidaceae）擬層孔菌屬（Fomitopsis），是一種木腐菌。菌蓋半圓形或馬蹄狀，菌蓋在生長(zhǎng)中顏色由白色變?yōu)榧t褐色至黑褐色，邊緣從乳白色變?yōu)闇\黃色或紅褐色[1]。紅緣擬層孔菌是一種藥用價(jià)值較高的大型真菌，其味微苦、性平，具有補(bǔ)肺益腎、安神定志、扶正培本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯和祛風(fēng)除濕等作用；對(duì)腎炎、支氣管炎、癌癥、心臟病、糖尿病等有特效，民間常用于治療“寒腿”病[2-3]。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于紅緣擬層孔菌的研究較少，關(guān)于其生物學(xué)特性方面的研究更是未見報(bào)道，故擬對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲體的固體培養(yǎng)條件展開初步研究，以期為紅緣擬層孔菌的固體培養(yǎng)和人工馴化提供借鑒的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紅緣擬層孔菌菌種，由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心菌種保藏中心提供。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麥芽糖、糊精、蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、硝酸銨、干酪素和磷酸氫二銨均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基、氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基、pH試驗(yàn)培養(yǎng)基、溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基和正交試驗(yàn)培養(yǎng)基，則均參照參考文獻(xiàn)[4]和參考文獻(xiàn)[5]的方法配制。

1.4 紅緣擬層孔菌的生物學(xué)特性研究

1.4.l 碳源試驗(yàn)

參照張峰等[3]的研究方法，以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麥芽糖和糊精作為碳源進(jìn)行試驗(yàn)。將活化的紅緣擬層孔菌菌種分別接種于各種碳源培養(yǎng)基中，以不添加碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。接種后，每間隔24 h觀察一次菌落特征和菌絲長(zhǎng)勢(shì)，其中菌絲長(zhǎng)勢(shì)根據(jù)菌落特征和菌絲生長(zhǎng)速率綜合判斷；采用“十”字交叉法精確測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲日生長(zhǎng)速度并進(jìn)行方差分析，每處理重復(fù) 5 次[6-9]。

1.4.2 氮源試驗(yàn)

以上述的PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選用蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、硝酸銨、干酪素和磷酸氫二銨作為氮源進(jìn)行試驗(yàn)。將活化的紅緣擬層孔菌菌株接種于各種氮源培養(yǎng)基中，以不添加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。記錄方法同1.4.1。

1.4.3 pH試驗(yàn)

配制pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH試驗(yàn)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基滅菌后用滅過菌的1 mol·L-1NaOH和l mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH）。將活化的紅緣擬層孔菌菌株接種于這5種不同pH的培養(yǎng)基中，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。記錄方法同1.4.1。

計(jì)算機(jī)主要由硬件和軟件兩大部分組成。計(jì)算機(jī)的硬件設(shè)備構(gòu)成了計(jì)算機(jī)的外殼(包括輸入輸出設(shè)備、存儲(chǔ)設(shè)備、運(yùn)算設(shè)備和控制設(shè)備)，軟件(包括系統(tǒng)軟件、通用軟件和應(yīng)用軟件)則是支持計(jì)算機(jī)運(yùn)行的內(nèi)部構(gòu)件，計(jì)算機(jī)語(yǔ)言編程的正是這些軟件。計(jì)算機(jī)的具體組成可以參照?qǐng)D1。

1.4.4 溫度試驗(yàn)

將活化的紅緣擬層孔菌菌株接種于溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基中，將接種后的平板分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。記錄方法同1.4.1。

1.4.5 正交試驗(yàn)

依據(jù)碳源、氮源、pH和溫度的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇這4個(gè)因素中最優(yōu)的3個(gè)水平進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 影響紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 Design of factors and levels affecting mycelial growth of Fomitopsis pinicola

如表1所示進(jìn)行試驗(yàn)，記錄方法同1.4.1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示，采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05和P<0.01分別表示不同處理間的顯著差異和極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅緣擬層孔菌的生物學(xué)特性

2.1.1 碳源試驗(yàn)

不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of different carbon sources on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

2.1.2 氮源試驗(yàn)

氮源主要用于機(jī)體內(nèi)含氮化合物的合成，不同氮源對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 不同氮源對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由表3可知，紅緣擬層孔菌在不含氮源的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)，不同氮源培養(yǎng)基對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲體生長(zhǎng)的影響不同。其中在以酵母粉作為氮源時(shí)，紅緣擬層孔菌菌絲較密，生長(zhǎng)速度最快，長(zhǎng)勢(shì)最好；在以磷酸氫二銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速率快但菌絲稀疏；另外在以蛋白胨、尿素、牛肉膏和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲長(zhǎng)勢(shì)一般；而在以干酪素為氮源的培養(yǎng)基中，菌絲較稀疏且生長(zhǎng)緩慢。因此，最終選擇以酵母粉、牛肉膏和磷酸氫二銨為氮源進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 pH試驗(yàn)

不同pH對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 不同pH對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.4 Effects of different pH on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由表4可知，紅緣擬層孔菌菌絲體生長(zhǎng)速率受培養(yǎng)基pH的變化影響較大。pH為5.0和6.0時(shí)，紅緣擬層孔菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，菌絲濃密，且pH為5.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率最快，達(dá)到6.36 mm·d-1；當(dāng)pH為4.0和7.0時(shí)，菌絲較密但菌絲長(zhǎng)勢(shì)一般；隨著pH繼續(xù)升高，當(dāng)pH為8.0時(shí)，紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)速率最?。?.62 mm·d-1），菌絲長(zhǎng)勢(shì)最弱?？梢娂t緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)偏好于酸性環(huán)境，因此選擇以pH為4.0，5.0和6.0進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.4 溫度試驗(yàn)

不同溫度對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可知，在20℃～40℃的溫度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度升高，紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)速度呈先增加后降低的趨勢(shì)。15℃時(shí)菌絲雖密卻長(zhǎng)勢(shì)弱，生長(zhǎng)速度僅為 0.70 mm·d-1；在 20℃、25℃、30℃、35℃培養(yǎng)時(shí)，菌絲越來越密，菌絲生長(zhǎng)速率也一直在上升；在35℃培養(yǎng)時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率達(dá)到峰值（7.32 mm·d-1），菌絲密，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)；而在40℃的培養(yǎng)條件下，菌絲生長(zhǎng)速率受高溫影響而完全無法生長(zhǎng)?？梢娕囵B(yǎng)溫度對(duì)會(huì)紅緣擬層孔菌的菌絲生長(zhǎng)有很大影響，因此選擇以培養(yǎng)溫度為25℃、30℃和35℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表5 不同溫度對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.5 Elfects of different temperatures on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

2.1.5 紅緣擬層孔菌培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，從4個(gè)因素中各選取較好的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表6。

如表6所示，極差（r）最大的是溫度，為2.5；極差從大到小依次表現(xiàn)為溫度、氮源、pH、碳源，說明4因素對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響大小依次為溫度＞氮源＞pH＞碳源。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，最優(yōu)組合A3B2C2D1為紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)條件組合，為以麥芽糖為碳源，酵母粉為氮源，培養(yǎng)基pH為4，培養(yǎng)溫度為30℃。在最適的培養(yǎng)條件下，紅緣擬層孔菌菌絲的生長(zhǎng)速度最快，為13.10 mm·d-1。

表6 紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)影響因素的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Orthogonal experimental results of factors affecting mycelial growth of Fomitopsis pinicola

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

如表7所示，4個(gè)因素對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)速率均有顯著影響，其差異顯著性最大的是溫度，其次是氮源、pH、碳源，方差分析的結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.7 Orthogonal experimental results of F-test

3 討論

紅緣擬層孔菌的單因素試驗(yàn)表明，在碳源為單糖或雙糖時(shí)更適合菌絲體生長(zhǎng)，這一特性與黃毛黃側(cè)耳的生物學(xué)特性相一致[10]。在氮源為干酪素和磷酸氫二銨時(shí)，則幾乎不能為紅緣擬層孔菌所利用，而在氮源為蛋白胨、尿素、牛肉膏和硝酸銨時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中含有可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的成分，如微量元素、核苷酸、維生素等一些非氮成分[4，11]。紅緣擬層孔菌的菌絲生長(zhǎng)速率在pH為5.0時(shí)生長(zhǎng)最快，說明紅緣擬層孔菌偏好在弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，這與迷宮栓孔菌ZT-055菌絲體的生物學(xué)特性的研究一致[3]。培養(yǎng)溫度試驗(yàn)表明，35℃時(shí)紅緣擬層孔菌長(zhǎng)勢(shì)最好，生長(zhǎng)最快，正交試驗(yàn)結(jié)果也表明，溫度對(duì)紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響最大，這與郝金斌等[12]的研究一致，屬中高溫性菌。通過試驗(yàn)得到紅緣擬層孔菌菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)條件為：以麥芽糖為碳源、酵母粉為氮源，培養(yǎng)基pH為4，培養(yǎng)溫度為30℃。因培養(yǎng)基滅菌前后pH變化較大，故本次試驗(yàn)在培養(yǎng)基滅菌后再通過加鹽酸或氫氧化鈉來調(diào)整pH。紅緣擬層孔菌的生長(zhǎng)速率不高，而本研究中對(duì)紅緣擬層孔菌的固體培養(yǎng)與菌種保藏具有指導(dǎo)意義，為紅緣擬層孔菌的人工培養(yǎng)提供了理論依據(jù)。