甘蔗線條花葉病毒P1蛋白基因原核表達(dá)及抗血清制備

徐小偉 陳雯 丁詩(shī)文 甘海鋒 張坤 賀振

摘要 甘蔗線條花葉病毒Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV）是引起甘蔗花葉病的主要病原之一，在世界各大蔗區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重威脅甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。建立快速有效的檢測(cè)方法對(duì)于SCSMV的防控有著重要意義。本研究依據(jù)SCSMV P1基因序列合成一對(duì)引物，擴(kuò)增獲得1 074 bp的目的基因，將目的基因與原核表達(dá)載體pET28a連接，獲得pET28a-P1SCSMV。將連接正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示在分子量約為42 kDa處有目的蛋白帶，與預(yù)期的SCSMV P1大小一致。融合蛋白主要是以可溶性蛋白的形式存在。利用鎳柱親和純化重組的SCSMV P1蛋白，并免疫健康新西蘭大白兔，制備兔抗血清。Western blot分析顯示，在對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)制備的抗血清能特異性地識(shí)別SCSMV的P1蛋白，在受SCSMV侵染的甘蔗植株中能檢測(cè)到P1蛋白的表達(dá)，而在健康植株中檢測(cè)不到P1蛋白的表達(dá)。制備的抗血清稀釋至1∶20 000時(shí)仍能特異地檢測(cè)到目的蛋白條帶，說(shuō)明通過(guò)大腸桿菌表達(dá)P1制備的SCSMV抗血清特異性強(qiáng)，效價(jià)高。本研究為SCSMV的快速檢測(cè)提供了有效方法。

關(guān)鍵詞 甘蔗線條花葉病毒; P1蛋白; 原核表達(dá); 抗血清

中圖分類號(hào)： S435.661

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021042

Abstract Sugarcane streak mosaic virus （SCSMV） is one of the main pathogens that cause sugarcane mosaic disease. It occurs in major sugarcane-growing regions around the world and seriously threatens the development of the sugarcane industry. The establishment of rapid and effective detection methods to prevent and control SCSMV is of great significance. In this study， a pair of primers were synthesized based on the SCSMV P1 gene sequence， and the target gene with a size of 1 074 bp was amplified. The target gene was connected with the prokaryotic expression vector pET28a to obtain pET28a-P1SCSMV. The correct recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta strain. After induction by IPTG， SDS-PAGE electrophoresis showed that there was a band of the target protein at a molecular weight of about 42 kDa， which was consistent with the expected size of SCSMV P1. Fusion protein mainly existed in the form of soluble protein. The recombinant SCSMV P1 protein was obtained by affinity purification with a Ni2+-NTA column and healthy New Zealand white rabbits was immunized with recombinant SCSMV P1 protein to prepare rabbit antiserum. Western blot analysis showed that the prepared antiserum could specifically recognize the SCSMV P1 protein when testing multiple samples. The expression of P1 protein could be detected in sugarcane plants infected by SCSMV， but not in healthy plants. When the prepared antiserum was diluted to 1∶20 000， the target protein band could still be detected specifically. This suggested that the SCSMV antiserum prepared by expressing P1 in E.coli had strong specificity and high titer， which provides favorable conditions for rapid detection of SCSMV.

Key words Sugarcane streak mosaic virus; P1 protein; prokaryotic expression; antiserum

甘蔗線條花葉病毒Sugarcane streak mosaic virus（SCSMV）屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae禾草病毒屬Poacevirus，是引起甘蔗花葉病的主要病原之一[1]。SCSMV病毒于1978年由Gillaspie等在美國(guó)引自巴基斯坦的甘蔗種質(zhì)上首次檢測(cè)到[2]。2008年-2011年，李世訪研究員團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)SCSMV在我國(guó)云南省甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生，后續(xù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)SCSMV在云南省的主要甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為頻繁，并且在某些地區(qū)出現(xiàn)了流行趨勢(shì)，對(duì)中國(guó)甘蔗產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。SCSMV是無(wú)包膜、彎曲線狀的病毒粒體，平均大小為890 nm×15 nm。SCSMV大小為10 kb左右，其外殼蛋白（coat protein， CP）包裹著正單鏈RNA基因組，其編碼一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)水解酶酶切后分為10個(gè)成熟的蛋白質(zhì)，從N端到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP，且在P3蛋白的氨基末端以+2移碼方式編碼一個(gè)額外的蛋白質(zhì)P3N-PIPO （N-terminus of P3-pretty interesting Potyviridae ORF）[4]。

甘蔗與高粱作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在自然條件下都可被SCSMV侵染。此外，SCSMV也可通過(guò)人工接種的方式侵染高粱Sorghum bicolor、玉米Zea mays、御谷Pennisetum glaucum等禾本科植物[5]。甘蔗被SCSMV侵染后引起的花葉病癥狀與甘蔗花葉病毒Sugarcane mosaic virus（SCMV）和高粱花葉病毒Sorghum mosaic virus（SrMV）侵染造成的癥狀相似。SCSMV主要危害甘蔗葉片，甘蔗被侵染后，葉片上出現(xiàn)黃綠色條紋或斑駁癥狀，尤其是新葉受到的危害更嚴(yán)重;SCSMV能系統(tǒng)地侵染甘蔗，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受損，分蘗減少，汁液量減少，口感變差，進(jìn)而影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。

常見(jiàn)的病毒檢測(cè)技術(shù)主要包括生物學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)以及血清學(xué)檢測(cè)等。生物學(xué)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)在于可準(zhǔn)確、直觀地體現(xiàn)病毒的生物學(xué)特性;分子生物學(xué)檢測(cè)具有精確度和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但其步驟較多，容易污染[78];血清學(xué)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)主要是具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，操作簡(jiǎn)單等，由于其步驟較繁瑣，在許多細(xì)節(jié)上需加以注意和改進(jìn)才能在節(jié)省時(shí)間的同時(shí)得到背景較為清晰的條帶[9]。通過(guò)從病株汁液中提純得到的病毒制備抗血清不能完全排除寄主蛋白的影響，導(dǎo)致制備的抗血清檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性[10]。截至當(dāng)前，對(duì)禾草病毒屬中11個(gè)蛋白的功能研究甚少，但對(duì)馬鈴薯Y病毒科病毒的研究已較明確。P1是一種絲氨酸型蛋白酶，通過(guò)自身剪切從多聚蛋白前體中分離出來(lái)。研究顯示它的變異性極高，這可能與病毒對(duì)不同宿主的廣泛適應(yīng)性相關(guān)[11]。在禾草病毒屬成員中RNA 誘導(dǎo)的基因沉默能夠被 P1 有效抑制[12]。馬鈴薯Y病毒科的HC-Pro基因的原核表達(dá)載體已被構(gòu)建，HC-Pro參與病毒基因組的翻譯和蛋白加工，能識(shí)別HC-Pro/P3特異切割位點(diǎn)，HC-Pro能夠抑制RNA沉默，且與P1共表達(dá)時(shí)能明顯增強(qiáng)沉默抑制功能[13]。因此，構(gòu)建SCSMV P1基因的原核表達(dá)載體可以進(jìn)一步研究HC-Pro基因功能并可更加方便地檢測(cè)SCSMV病毒。本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了SCSMV的P1蛋白，將其作為抗原免疫兔子，制備了兔抗血清。經(jīng)分析驗(yàn)證，所制備的抗血清可用于SCSMV的檢測(cè)，并有較高的特異性和靈敏度，對(duì)于SCSMV的檢測(cè)與防治有著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

pCa-SCSMV農(nóng)桿菌菌株由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院植物病毒實(shí)驗(yàn)室培育;原核表達(dá)載體pET28a以及大腸桿菌菌株DH5α、Rosetta均由本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶 （NcoⅠ、SacⅠ）、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、dNTPs、5×M-MLV Buffer、RNA酶抑制劑、載體等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;PCR儀購(gòu)自ProFlex公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司;2×High-Fidelity Master Mix 購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司;2×Taq Master Mix、分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)pCa-SCSMV的P1基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物，利用上游引物P1SCSMV-F （5′-CATGCCATGGCTACTATCACTAAG-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）和下游引物P1SCSMV-R （5′-TCCGAGCTCGAATAAAA-TACTAAATCTTC-3′，下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增SCSMV P1基因（1 074 bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切，與同樣用NcoⅠ和SacⅠ雙酶切的原核表達(dá)載體pET28a在16℃金屬浴中過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli DH5α。通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證，選取5個(gè)陽(yáng)性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列利用DNAMAN、BioEdit和BLASTN等軟件進(jìn)行序列比對(duì)和分析，從中選擇測(cè)序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行后續(xù)的研究，并將其命名為pET28a-P1SCSMV。

1.3 重組蛋白的表達(dá)和SDS-PAGE分析

將pET28a-P1SCSMV轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。挑取單菌落于5 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min活化過(guò)夜，翌日將活化的菌液按1∶100接種于50 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)1.5 h （OD600為0.4～1），各取2 mL菌液，加入終濃度為1 mmol/L IPTG分別在28℃和37℃誘導(dǎo)表達(dá)4～6 h，以不加IPTG作為對(duì)照。取2 mL誘導(dǎo)產(chǎn)物離心收集菌體，加入200 μL蛋白懸浮緩沖液 （pH 6.8），振蕩混勻，吸取20 μL蛋白樣品并加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，在沸水中煮10 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心20 min，取8 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，分析融合蛋白的表達(dá)情況。

1.4 重組蛋白的可溶性分析

通過(guò)離心收集誘導(dǎo)表達(dá)4～6 h的菌體，利用雙蒸水重懸菌體，加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1 mmol/L，采用超聲波破碎菌體細(xì)胞后，分別收集離心20 min后的上清和沉淀，將沉淀重懸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)融合蛋白進(jìn)行可溶性分析，觀察目的蛋白在上清和沉淀中的相對(duì)含量。

1.5 可溶性蛋白的Ni柱純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L，按照上述方法誘導(dǎo)表達(dá)4～6 h，1 000 r/min，離心5 min，收集菌體，用25 mL pH 6.8的蛋白懸浮緩沖液懸浮細(xì)胞，將懸浮液轉(zhuǎn)移至燒杯并加入1%的蛋白酶抑制劑，超聲波破碎至菌液透亮，懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃，12 000 r/min，離心30 min以上;取上清液，加入1% PMSF過(guò)0.5 μm濾膜并通過(guò)Ni2+-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，隨后加入蛋白緩沖液沖洗柱子5次，沖洗結(jié)束后，用pH 6.8的蛋白緩沖液（分別含60、80、100、200、300、400 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液）各洗脫5次，分別收集洗脫液，置于冰上。

1.6 抗血清制備

純化的重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻，通過(guò)皮下多點(diǎn)注射抗原的方法免疫新西蘭大白兔，抗原總注射量為2.0 mg，每次注射0.5 mg，共免疫3次，每次免疫間隔時(shí)間為7～10 d，免疫結(jié)束后，在新西蘭大白兔耳緣靜脈抽取0.5～1 mL的兔血，37℃靜置1 h，4℃靜置過(guò)夜，分離抗血清。血清中加入0.02%的疊碳化鈉于-80℃保存。

1.7 抗血清特異性檢測(cè)

利用Western blot檢測(cè)抗血清的特異性和靈敏程度。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，用雙蒸水洗脫凝膠，隨后通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 （200 mA，100 min）;電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜放至1×TBST （20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5或8.0，150 mmol/L NaCl， 0.1% Tween-20）緩沖液中洗脫，隨即轉(zhuǎn)入10 mL封閉液（TBST+ 5% 脫脂奶粉）中，37℃封閉反應(yīng)1 h或者4℃封閉過(guò)夜;封閉完成后直接在封閉液中加入1∶2 000的特異性抗血清，37℃一抗反應(yīng)至少1 h，一抗反應(yīng)結(jié)束后將硝酸纖維素膜放至1×TBST緩沖液中洗脫3次，每次10 min;洗脫結(jié)束，將硝酸纖維素膜加入用TBST稀釋 （1∶5 000）的AP-IgG二抗，37℃反應(yīng)45 min;再用1×TBST洗脫3次，每次10 min;在避光條件下，將硝酸纖維素膜放至含有NBT（330 μg/mL）和BCIP （165 μg/mL）的堿性磷酸酯酶緩沖液中顯色至條帶清晰，取出硝酸纖維素膜并用雙蒸水漂洗3次，終止顯色反應(yīng)。將晾干的膜進(jìn)行掃描分析。

將所制得的抗血清進(jìn)行梯度稀釋 （1∶1 000，1∶5 000， 1∶10 000， 1∶20 000），與病葉汁液進(jìn)行免疫抗原反應(yīng)，Western blot檢測(cè)分析抗血清的特異性和靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)過(guò)菌落PCR、雙酶切 （圖1）以及測(cè)序驗(yàn)證，重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P1SCSMV構(gòu)建成功。

2.2 SCSMV P1的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

pET28a-P1SCSMV轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α經(jīng)過(guò)1 mmol/L的IPTG進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)到42 kDa的蛋白條帶，與所預(yù)期的大小一致（圖2），表明pET28a-P1SCSMV在大腸桿菌中正確表達(dá)。剩余菌體通過(guò)超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示融合蛋白主要是以可溶蛋白的形式存在。

2.3 抗血清特異性及樣品鑒定

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，采集的7個(gè)樣品中除1號(hào)和5號(hào)樣品外，其余5個(gè)樣品均為陽(yáng)性。表明2、3、4、6號(hào)和7號(hào)樣品被SCSMV所侵染。Western blot分析結(jié)果顯示，抗血清與SCSMV侵染的5個(gè)甘蔗葉片提取液有特異性免疫反應(yīng)，而與健康甘蔗葉片1號(hào)和5號(hào)提取液無(wú)反應(yīng)，這一結(jié)果與RT-PCR分析結(jié)果一致，證實(shí)了制備的SCSMV P1抗血清可用于該病毒的檢測(cè)且抗體有非常好的特異性，能夠應(yīng)用于植物樣品的檢測(cè)。

2.4 抗血清靈敏度鑒定

通過(guò)Western blot對(duì)SCSMV侵染后的病汁液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗血清稀釋到1∶20 000時(shí)仍然能夠特異地檢測(cè)到目的蛋白 （圖4），說(shuō)明制備的抗血清具有較高的靈敏度。

3 討論

血清學(xué)方法作為一種重要的植物病毒檢測(cè)技術(shù)手段是不可或缺的[13]。目前，利用提純的病毒來(lái)作為抗原直接免疫動(dòng)物獲得抗血清是抗血清制備中相對(duì)主流的一種方法[14]。植物病毒檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)假陽(yáng)性是因?yàn)榭寡逯谐３?huì)含有寄主蛋白的抗體[15]。因此，本研究通過(guò)原核表達(dá)SCSMV P1重組蛋白，利用純化的蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔獲得特異性高的P1抗血清。先前我們已經(jīng)構(gòu)建出SCSMV CP蛋白的抗血清[16]，此前研究報(bào)道表明SCSMV CP蛋白與同樣引起甘蔗花葉病的甘蔗花葉病毒Sugarcane mosaic virus （SCMV）和高粱花葉病毒 Sorghum mosaic virus （SrMV）的CP蛋白存在血清學(xué)交叉反應(yīng)[17]。因此，為了適應(yīng)SCSMV遺傳進(jìn)化過(guò)程以及避免CP蛋白血清學(xué)交叉反應(yīng)影響SCSMV檢出效率，建立SCSMV P1特異性抗血清檢測(cè)方法對(duì)甘蔗線條花葉病毒的檢測(cè)進(jìn)行補(bǔ)充和完備顯得格外重要。本試驗(yàn)所獲得的P1抗血清特異性強(qiáng)，能夠高效特異的檢測(cè)SCSMV的發(fā)生，適用于田間生產(chǎn)上的檢測(cè)，為病毒的防治與研究提供了較為方便的條件。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）