黃瓜抗細(xì)菌性角斑病誘抗藥劑的篩選及抗性機(jī)制研究

張勝平 程穎 石朝陽 賈文章 孟祥龍 曹克強(qiáng)

摘要 為篩選誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病（angular leaf spot，ALS）的最佳誘抗藥劑，選取11種商品誘抗劑，研究其室內(nèi)誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的作用效果。結(jié)果顯示11種誘抗劑的預(yù)處理均能有效提高黃瓜植株的長勢，提高黃瓜對細(xì)菌性角斑病的抗性，表現(xiàn)為葉片病斑面積顯著下降。其中藥劑信號施康樂（SK）能有效減小葉片病斑面積，防效最好，而藥劑頂花增瓜嫩直長（DH）處理的植株葉片病斑面積最大。為了進(jìn)一步明確誘抗劑的作用機(jī)制，對誘抗劑SK和DH處理后的抗性相關(guān)基因SOD、SSU以及PR1-1a的相對表達(dá)量進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，SK和DH處理后3個基因的相對表達(dá)量均顯著提高，SK處理的相對表達(dá)量顯著高于DH處理。綜上所述，合理施用信號施康樂可以誘導(dǎo)黃瓜幼苗提高對細(xì)菌性角斑病的抗性，對于黃瓜細(xì)菌性角斑病的早期預(yù)防和減少農(nóng)藥使用具有重要意義。

關(guān)鍵詞 細(xì)菌性角斑病; 誘抗劑; 誘導(dǎo)抗性; 丁香假單胞菌流淚致病變種

中圖分類號： S436.421.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020688

Abstract In order to screen effective inducers to bacterial angular leaf spot （ALS） of cucumber， 11 commercial inducers were selected to investigate the inducing resistance to ALS in cucumber plants. Results showed that commercial inducers treatment improved the resistance of cucumber seedlings to ALS. The growth of plants treated with commercial inducers was improved and the lesion area of cucumber leaves inoculated with Pal was significantly decreased. Among the commercial inducers， signal-shikangle （SK） treatment has the best control effect with the smallest leaf lesion area， and inducer of plants （DH） treatment had relative low control effect. In order to further clarify the mechanism of inducers， the relative expression levels of SOD， SSU and PR1-1a genes which related to resistance were preliminarily analyzed after treatment with SK and DH. The results showed that the relative expression levels of above three genes were significantly increased after treated with SK and DH， and that treated with SK was significantly higher than that treated with DH. In conclusion， reasonable application of SK may induce cucumber seedlings to improve the resistance to ALS， which is of great significance for the early prevention of ALS and the reduction of pesticide application.

Key words angular leaf spot （ALS）; inducers; induced resistance; Pseudomonas amygdali pv. lachrymans （Pal）

丁香假單胞菌流淚致病變種Pseudomonas amygdali pv. lachrymans （Pal）侵染黃瓜葉片引起的細(xì)菌性角斑?。╝ngular leaf spot，ALS）在黃瓜苗期和成株期均可發(fā)生，該病害具有發(fā)病時間短，擴(kuò)展蔓延速度快，危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，是黃瓜生產(chǎn)中常見的病害[14]。Pal可在種子或病殘體中過冬躲避不利環(huán)境，并通過種子、水滴、昆蟲、農(nóng)具、氣溶膠等多種途徑傳播[511]。細(xì)菌性角斑病發(fā)生的溫度范圍在10～30℃之間，最適溫度為25～28℃，空氣濕度大利于病害的發(fā)生和蔓延，相對濕度高于70%更容易導(dǎo)致病害的大面積擴(kuò)散[12]。近年來，我國北方地區(qū)冬季黃瓜設(shè)施栽培面積日益增加，設(shè)施結(jié)構(gòu)密閉的環(huán)境、較高的溫度和濕度導(dǎo)致細(xì)菌性角斑病呈逐年上升的趨勢，已成為黃瓜安全生產(chǎn)的重大威脅[13]。

長期以來，對細(xì)菌性角斑病的防控主要以化學(xué)防治為主，且尚無有效防控細(xì)菌性角斑病的抗性品種。植物誘抗劑可以激活植物的免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)植物的新陳代謝，增強(qiáng)植物抗病和抗逆能力[14]。植物誘抗劑對植物病原物沒有直接的殺滅作用，而是由外源生物或分子誘導(dǎo)或激活植物產(chǎn)生抗性物質(zhì)使植物對病原物產(chǎn)生抗性或抑制病菌的生長，具有在提高農(nóng)作物抗性和有效防控植物病害的同時，從源頭上減少農(nóng)藥對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品污染的作用，更符合當(dāng)今食品安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求[14]，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中。當(dāng)前，商品化的誘抗藥劑種類繁多，其成分主要為激活蛋白質(zhì)類、寡糖類、植物生長調(diào)節(jié)劑類、拮抗微生物類以及微量元素葉面肥[1415]。利用誘抗劑誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生抗性來減輕病害的發(fā)生已有報道[1618]，而有效誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的商品藥劑種類及誘導(dǎo)后黃瓜中響應(yīng)Pal侵染的特異基因的相對表達(dá)水平研究罕有報道。

本研究選取11種商品藥劑，室內(nèi)開展不同藥劑誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的試驗，研究不同藥劑的誘抗效果，篩選有效誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的商品藥劑種類，驗證藥劑誘導(dǎo)后黃瓜中響應(yīng)Pal侵染的特異基因的相對表達(dá)水平，為實(shí)際生產(chǎn)中選用有效的商品誘抗藥劑防控細(xì)菌性角斑病和深入研究黃瓜抗Pal侵染機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃瓜品種：‘先優(yōu)達(dá)’，天津先優(yōu)達(dá)種子有限公司?；|(zhì)：草炭、蛭石、珍珠巖按1∶1∶1配比，于180℃烘箱滅菌6 h后備用。供試菌株：Pal 分離自黃瓜細(xì)菌性角斑病葉片，保存于-80℃。

供試商品藥劑（表 1）：信號施康樂（SK），四川海博氏生物科技有限公司;阿泰靈（AT），北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司;植物免疫誘抗劑（MY），沃寶生物科技有限公司;正業(yè)海島素氨基寡糖素（HD），海南正業(yè)中農(nóng)高科技有限公司;枯草芽胞桿菌（KC），北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司;艾護(hù)植物疫苗（AH），南京銳邁特科技股份有限公司;優(yōu)得列（YD），河北木美土里科技股份有限公司;超敏蛋白（CM），湖南農(nóng)大哥科技開發(fā)有限公司;碧護(hù)（BH），德國阿格福萊農(nóng)林環(huán)境生物科技有限公司;S-誘抗素（SY），陜西楊凌奧邦生物科學(xué)有限公司;頂花增瓜嫩直長（DH），山東四海匯農(nóng)生物科技有限公司。

1.2 黃瓜植株

黃瓜種子用無菌水沖洗干凈，55℃溫水中浸泡2.5 h。無菌水浸潤8層滅菌紗布包裹的種子置于30℃催芽，36 h后播種于營養(yǎng)缽（直徑10 cm），每缽1粒，置于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室（L∥D=16 h∥8 h，28℃，相對濕度80%）培養(yǎng)。

1.3 藥劑配制及施藥方法

無菌水溶解藥劑配制母液（表1），-4℃保存?zhèn)溆?。使用時按照推薦濃度，用無菌水稀釋到終濃度（表1）。藥劑噴淋誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的方法參照李玉紅等[19]，并稍加修改：噴淋時先用紙板蓋住營養(yǎng)缽中的基質(zhì)，第2片真葉伸展后噴淋第1次，噴淋范圍為紙板至第2片真葉;第3片葉子伸展后噴淋第2次，噴淋范圍為紙板至第3片真葉。噴淋藥劑時用錫紙包裹住所噴淋葉片的植株上部至生長點(diǎn)，避免藥劑滴入栽培基質(zhì)和接觸噴淋葉片的植株上部及生長點(diǎn)，每次每株噴施15 mL，每種藥劑噴施5株黃瓜幼苗，使用無菌水噴淋10株黃瓜幼苗作為對照（CK）。

1.4 黃瓜角斑病菌的接種

取出保存于-80℃的菌株，冰上融化，于LB固體培養(yǎng)基上劃線后置于培養(yǎng)箱，28℃黑暗培養(yǎng)16 h。挑取單菌落，接種于150 mL LB液體培養(yǎng)基中，在28℃，220 r/min培養(yǎng)16 h，OD600為1時備用。第2次藥劑噴淋后6 d，噴霧接種Pal 菌液。接種方法：紙板蓋住營養(yǎng)缽中的基質(zhì)，錫紙包裹第2片真葉及下部植株，Pal菌液均勻噴霧接種于第3片真葉至植株生長點(diǎn)，菌液均勻展布于葉片，避免菌液滴入基質(zhì)或接觸植株其他部位，所有藥劑處理的黃瓜幼苗，每株接種30 mL菌懸液;噴施無菌水的10株黃瓜幼苗中，5株噴施30 mL的Pal菌懸液，作為清水對照，5株噴施30 mL不含Pal的LB培養(yǎng)液作為空白對照。每個試驗重復(fù)3次。

1.5 植株長勢調(diào)查

接種Pal菌懸液前1 d調(diào)查植株長勢。選取5株植株，測定植株高度（營養(yǎng)缽基質(zhì)表面至頂端生長點(diǎn)）和植株莖粗（莖基部直徑），每株測3次，計算平均值，SPSS軟件（Version 12.0）進(jìn)行顯著性分析。

1.6 病癥調(diào)查及Pal檢測

接種Pal菌懸液后21 d，選取植株的第4片真葉進(jìn)行研究。1）觀察葉片癥狀;2）隨機(jī)選擇4片葉利用硫酸紙方格法測定葉片病斑面積并計算病斑面積比例，SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析;3）依據(jù)葉片病斑面積選擇以下植株開展研究：i） 葉片病斑面積比例最大的藥劑處理植株，ii） 葉片病斑面積比例最小的藥劑處理植株，iii） 無藥劑處理接種Pal的植株，iv） 無菌水處理未接種Pal的植株;每組隨機(jī)選擇3片葉子，75%乙醇沖洗葉片后無菌水沖洗葉片正反面3遍，吸水紙吸干葉片表面殘留水滴，錫紙包裹置于液氮，-80℃保存。

Pal侵染檢測：液氮研磨整片葉片，取研磨的葉片樣品10 mg，用改良CTAB方法提取樣品總DNA，對Pal的甘油醛三磷酸脫氫酶（gap1）基因片段（162 bp）進(jìn)行PCR檢測[20]。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PCR mix（天根生化科技有限公司，KT201-02，成分：Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、PCR反應(yīng)優(yōu)化劑及PCR反應(yīng)穩(wěn)定劑）12.5 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板1 μL， ddH2O 10.3 μL。Pal菌液總DNA提取參照TIANamp Bacteria DNA Kit DP302（天根生化科技有限公司）操作步驟，菌液PCR反應(yīng)體系同葉片總DNA中檢測gap1基因。PCR反應(yīng)程序均為：95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。

1.7 特異基因相對表達(dá)水平

各取1.6中 i）、ii） 和 iii） 液氮研磨的葉片樣品20 mg，用RNA提取試劑盒（新?；驒z測有限公司）提取樣品總RNA，無RNA酶水溶解RNA。NanoDrop 2000測定RNA濃度（A260/280范圍2.0～2.2），無RNA酶水調(diào)整RNA濃度至相同濃度（70 ng/μL），置于-80℃保存。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

特異基因選用SOD[21]、SSU和PR1-1a[22]，內(nèi)參基因選用18S rRNA[23]（表 2）。qRT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：PCR mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL。qRT-PCR三步法反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)。儀器自動獲得Ct值。2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量[24]，SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對黃瓜植株長勢的作用效果

藥劑處理的黃瓜植株長勢明顯強(qiáng)于無藥劑處理的對照組（圖1a），但不同藥劑提高植株長勢的效果不同。顯著性分析表明，S-誘抗素（SY）處理促進(jìn)植株伸長與植株增粗的效果最佳，頂花增瓜嫩直長（DH）處理提高植株長勢的效果弱于其他10種藥劑（圖1b， c）。

2.2 不同藥劑誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病效果

接種Pal的葉片均表現(xiàn)出干枯病斑、葉片邊緣的鋸齒狀結(jié)構(gòu)受損、黃化等癥狀。無藥劑處理接種Pal的葉片（CK+）表現(xiàn)出干枯病斑、背面卷曲、邊緣鋸齒狀結(jié)構(gòu)受損、葉片不能正常伸展等明顯癥狀。誘抗劑頂花增瓜嫩直長（DH）和信號施康樂（SK）處理植株后接種Pal的葉片也表現(xiàn)出干枯病斑和邊緣鋸齒狀結(jié)構(gòu)受損等癥狀，但病斑數(shù)量和受損程度顯著低于CK+;DH處理植株后接種Pal的葉片病斑數(shù)量明顯少于SK處理植株后接種Pal的葉片（圖2a）。

顯著性分析表明，11種藥劑處理植株后接種Pal的葉片病斑面積比例顯著低于無藥劑處理接種Pal的葉片（CK+）;信號施康樂（SK）處理植株后接種Pal的葉片病斑面積比例顯著低于其他藥劑處理的植株;頂花增瓜嫩直長（DH）處理植株后接種Pal的葉片病斑面積比例是11種藥劑處理植株中最高的（圖2b），表明11種誘抗劑均能誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病，信號施康樂誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病效果最佳。

PCR瓊脂糖凝膠電泳顯示，接種Pal的葉片和Pal菌液均出現(xiàn)陽性條帶（162 bp），而未接種Pal的葉片無陽性條帶，表明Pal侵染葉片并出現(xiàn)癥狀（圖2c）。

2.3 特異基因相對表達(dá)水平的qRT-PCR驗證

選取信號施康樂（SK）和頂花增瓜嫩直長（DH）處理植株后接種Pal的葉片和無藥劑處理接種Pal的葉片（CK+）進(jìn)行特異基因相對表達(dá)量分析。藥劑處理植株后接種Pal的葉片中特異基因SOD、SSU和PR1-1a相對表達(dá)水平均顯著高于無藥劑處理接種Pal的葉片;SK處理植株后接種Pal的葉片中3個基因相對表達(dá)水平均顯著高于DH處理的植株（圖3）。表明3個特異基因的相對表達(dá)水平提高與藥劑誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病相關(guān)。

3 討論

11種不同成分的商品誘抗劑室內(nèi)誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的研究結(jié)果表明，藥劑處理的黃瓜植株長勢均顯著好于無藥劑處理的黃瓜植株，表明11種商品藥劑均具有提高黃瓜植株長勢的效果。藥劑處理植株后接種Pal菌懸液的葉片均出現(xiàn)癥狀，其中信號施康樂處理植株的葉片發(fā)病最輕，抗細(xì)菌性角斑病效果最佳，頂花增瓜嫩直長處理植株抗細(xì)菌性角斑病效果相對最弱。頂花增瓜嫩直長的主要成分為微量元素并未標(biāo)注含有誘抗成分，但仍能誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病，表明其處理后植株長勢的增強(qiáng)能提高黃瓜抗細(xì)菌性角斑病效果。盡管S-誘抗素提高黃瓜植株長勢的效果最佳，但誘導(dǎo)黃瓜植株抗細(xì)菌性角斑病效果不及信號施康樂，表明藥劑中添加的誘抗成分誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的效果優(yōu)于植株長勢增強(qiáng)帶來的抗細(xì)菌性角斑病效果。

信號施康樂為2種產(chǎn)品組合（SK-α和SK-β）。SK-α的主要成分為微量元素和游離氨基酸，具有促進(jìn)植物光合作用、營養(yǎng)吸收和營養(yǎng)平衡，迅速開啟植物生長系統(tǒng)的功能。SK-β的主要成分為Harpin蛋白家族同源物HarpinEcc蛋白和HarpinEac蛋白。Harpin蛋白是梨火疫病病原菌中產(chǎn)生的一類超敏蛋白，它能引發(fā)植物識別病原菌的侵染而做出反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，Harpin Ea（Harpin蛋白家族成員）是最早分離的由hrpN基因編碼能誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)、促進(jìn)植株生長發(fā)育的一種超敏蛋白[25]。SK-β中含有的HarpinEcc蛋白和HarpinEac蛋白是從白菜軟腐病菌變種CSDS008菌株中獲取的hrpN編碼的超敏蛋白同源物，具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病信號，激活植物抗性基因表達(dá)的功能。此外，協(xié)同產(chǎn)生的酶可提高植物營養(yǎng)吸收能力和生長發(fā)育能力。頂花增瓜嫩直長的主要成分為微量元素，微量元素易被植物吸收，具有快速補(bǔ)充植物體內(nèi)缺少的元素，修復(fù)葉綠體結(jié)構(gòu)，加快葉綠素的形成，提高光合作用等功能。

正常條件下，植物自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但當(dāng)碰到脅迫時這種平衡被打破[2627]。植物病原物侵染寄主植物后導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species， Ros）積累。大量活性氧的積累會損害植物細(xì)胞，間接引發(fā)抗氧化酶產(chǎn)生變化。研究表明，植物遭到病原物入侵后體內(nèi)抗病相關(guān)的酶迅速轉(zhuǎn)化，在抗病過程中發(fā)揮的作用與其變化密切相關(guān)[2832]。清除Ros的反應(yīng)中第一個起作用的抗氧化酶是SOD，它是所有生物體在有氧情況下抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的第一道防線[33]。甜瓜接種蔓枯病菌之前抗病和感病材料的SOD活性基本相同，而接種后抗病品種中SOD活性快速增強(qiáng)，而感病品種中SOD活性較弱，隨著時間的延長，抗病品種中SOD活性始終大于感病品種，因此SOD活性變化與植物抗病性存在聯(lián)系[34]。本試驗中信號施康樂處理植株的葉片中SOD相對表達(dá)水平顯著高于頂花增瓜嫩直長處理植株，而頂花增瓜嫩直長處理植株的葉片中SOD相對表達(dá)水平又顯著高于無藥劑處理的植株，表明SOD相對表達(dá)量增加表現(xiàn)出抗Pal侵染的反應(yīng)。

植物病原細(xì)菌侵染寄主植物后影響植物光合作用[3536]。SSU是編碼rubisco小亞基的基因，而rubisco小亞基與大亞基結(jié)合形成的rubisco（8L/8S）是參與光合作用暗反應(yīng)的關(guān)鍵催化酶[37]。本試驗中信號施康樂處理植株的葉片中SSU相對表達(dá)水平顯著高于頂花增瓜嫩直長處理的植株，而頂花增瓜嫩直長處理植株的葉片中SSU相對表達(dá)水平又顯著高于無藥劑處理的植株，表明接種Pal后藥劑處理的植株能提高光合作用速率以響應(yīng)Pal侵染。

PR1蛋白通常被認(rèn)為與植物抗病性密切相關(guān)，PR1蛋白的產(chǎn)生是系統(tǒng)獲得抗性的標(biāo)志[38]。qRT-PCR結(jié)果表明，誘抗劑處理黃瓜植株的葉片接種Pal后PR1-1a相對表達(dá)水平依次為信號施康樂>頂花增瓜嫩直長>清水對照處理，推斷PR1蛋白是引發(fā)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的重要物質(zhì)，信號施康樂處理黃瓜植株誘導(dǎo)產(chǎn)生的PR1抗Pal侵染的效果更強(qiáng)。

綜上，11種藥劑均具有效促進(jìn)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病的作用，信號施康樂誘導(dǎo)黃瓜抗細(xì)菌性角斑病效果最佳，表現(xiàn)為響應(yīng)Pal侵染的SOD、SSU和PR1-1a的相對表達(dá)量顯著提高，在生產(chǎn)中可選為預(yù)防黃瓜細(xì)菌性角斑病的誘抗藥劑。試驗中采用黃瓜植株底部葉片噴淋誘抗劑而上部葉片接種Pal菌懸液的方法，其目的在于研究誘抗劑提高黃瓜植株系統(tǒng)抗性的作用效果，以此避免商品誘抗劑中含有的殺菌劑接觸Pal帶來的影響。盡管田間生產(chǎn)中難以實(shí)現(xiàn)此操作，但使用誘抗藥劑能有效提高植株的系統(tǒng)抗性，此外多數(shù)商品誘抗劑中含有抑制植物病原菌的成分，如：枯草芽胞桿菌，因此，生產(chǎn)中使用誘抗藥劑噴淋植株不僅可有效提高植株的抗性還能達(dá)到抑制或殺滅植物病原菌的目的，其預(yù)防效果更佳。試驗還發(fā)現(xiàn)植株長勢強(qiáng)也有助于抗細(xì)菌性角斑病，而單一依靠提高植株長勢誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性水平顯著低于誘抗成分帶來的誘抗效果，可解釋實(shí)際生產(chǎn)中同一栽培條件下長勢強(qiáng)的植株較長勢弱的植株發(fā)病輕，但并不能完全杜絕發(fā)病這一現(xiàn)象。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）