江蘇省水稻惡苗病菌種群鑒定及抗藥性檢測

陳宏州 周晨 莊義慶 姚克兵 楊紅福 徐超 侯毅平 朱鳳

摘要 由藤倉赤霉復合種Gibberella fujikuroi species complex引起的惡苗病（rice bakanae disease）是嚴重危害水稻的種傳病害。為探明江蘇省水稻惡苗病菌的種群結構及對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗藥性現(xiàn)狀，分別對2019年江蘇省13個縣（市）和2020年18個縣（市）采集的惡苗病植株樣本的123株和182株單孢菌株進行了形態(tài)學初步鑒定，并基于翻譯延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α， TEF1-α）序列對其進行了分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析;采用區(qū)分劑量法分別檢測了菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗藥性。結果表明，2019年和2020年收集的菌株均被鑒定為藤倉鐮孢Fusarium fujikuroi、 擬輪枝鐮孢F.verticillioides、層出鐮孢F.proliferatum和新知鐮孢F.andiyazi，分別占比為87.80%、4.07%、5.69%、2.44%和90.11%、1.65%、2.75%、5.49%;基于TEF1-α序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，鐮孢菌可清晰分為4個不同種群，菌株間具遺傳多樣性。2019年和2020年菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的總抗性頻率分別為67.48%、23.58%、9.76%和41.21%、43.96%、29.12%。依據菌株對3種殺菌劑的抗藥性表現(xiàn)，可分為7種表現(xiàn)型，其中2019年和2020年對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯有抗性的菌株分別占4.07%和1.65%;對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯敏感的菌株分別占28.46%和17.58%。江蘇省惡苗病菌優(yōu)勢種為藤倉鐮孢，病菌對多菌靈和咪鮮胺抗性頻率較高，對氰烯菌酯抗性已逐漸擴展。研究結果可為鐮孢菌分類鑒定及水稻惡苗病綜合防治提供理論依據。

關鍵詞 水稻惡苗病; 鐮孢菌; TEF1-α; 系統(tǒng)發(fā)育分析; 抗藥性

中圖分類號： S435.11

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021581

Abstract Rice bakanae disease （RBD） caused by Gibberella fujikuroi species complex （GFSC） is a serious seed-borne disease of rice （Oryza sativa L.）. In order to investigate the population structure and the resistance of the pathogen of RBD to carbendazim， prochloraz and phenamacril in Jiangsu province， 123 and 182 single-spore strains collected from RBD-infected rice plants in 13 and 18 counties （cities） in Jiangsu province in 2019 and 2020 were preliminarily identified by morphology， respectively， and then molecular identification and phylogenetic analysis based on translation elongation factor 1-α （TEF1-α） sequences were conducted， and their resistance to carbendazim， prochloraz and phenamacril was detected by using a distinguishing dosage method. The results showed that the strains collected in 2019 and 2020 were identified as Fusarium fujikuroi， F.verticillioides， F.proliferatum and F.andiyazi， accounting for 87.80%， 4.07%， 5.69%， 2.44% and 90.11%， 1.65%， 2.75%， 5.49%， respectively. Phylogenetic analysis based on TEF1-α sequences showed abundant inter-and intra-specific genetic variations among the strains， which were clearly grouped into four different populations. The total resistance frequency of different strains to carbendazim， prochloraz and phenamacril were 67.48%， 23.58%， 9.76% and 41.21%， 43.96%， 29.12% in 2019 and 2020， respectively. According to the resistance phenotypes of all strains to three fungicides， seven resistance types were identified. In 2019 and 2020， the strains resistant to carbendazim， prochloraz and phenamacril accounted for 4.07% and 1.65%， respectively， and the strains sensitive to carbendazim， prochloraz and phenamacril accounted for 28.46% and 17.58%， respectively. The dominant population of the pathogens of RBD in Jiangsu province was F.fujikuroi. The pathogens of RBD in Jiangsu province had relatively high resistance frequencies to carbendazim and prochloraz， and their resistance to phenamacril was gradually expanding. These results provided a theoretic and scientific basis for Fusarium taxonomy and integrated control of RBD.

Key words rice bakanae disease; Fusarium; translation elongation factor 1-α; phylogenetic analysis; resistance

由藤倉赤霉復合種Gibberella fujikuroi species complex引起的水稻惡苗?。╮ice bakanae disease）是危害嚴重的水稻種傳病害[1]。該病害于1828年在日本首次被發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)在全球水稻種植區(qū)域均有發(fā)生[3]，可造成水稻減產3.0%～95.4%，甚至完全絕收[4]。此外，還因藤倉赤霉復合種菌株產生伏馬毒素等毒素污染而威脅人類和動物健康[5]。

水稻惡苗病病原菌種類鑒定對稻種帶菌率檢測、病害藥劑防治、抗藥性治理以及病害綜合防治決策制定等方面均有重要意義。相關研究表明，水稻惡苗病病原包括藤倉赤霉復合種的藤倉鐮孢 Fusarium fujikuroi、擬輪枝鐮孢 F.verticillioides和層出鐮孢 F.proliferatum[69]。近年來，首次在非洲高粱上鑒定出的新知鐮孢F.andiyazi[10]也可引起水稻惡苗病[1115]。我國對該菌引起的水稻惡苗病也有相關報道[1415]。藤倉赤霉復合種的種群鑒定已報道了多種方法，如：形態(tài)學鑒定、交配型檢測、真菌毒素檢測、營養(yǎng)體親和性分類、隨機擴增多態(tài)DNA（random amplification of polymorphic DNA， RAPD）和擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）分析等，但這些方法大多費時費力，甚至不能準確鑒定[16]。翻譯延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α， TEF1-α）基因的表達及調控具有高度保守性，常應用于研究物種間的親緣關系;作為分子標記，TEF1-α序列已被廣泛用于鐮孢菌的種群鑒定，并且在鐮孢菌種級水平進行系統(tǒng)發(fā)育分析時，TEF1-α序列可以準確地鑒別出鐮孢菌種[1718]。

由于缺乏有效的抗病品種，水稻惡苗病的防治仍以化學藥劑進行種子處理為主[19]。在我國，自20世紀70年代以來，多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑被廣泛應用于水稻惡苗病防治，但因病菌產生抗藥性其藥效大大降低[20]。20世紀80年代，咪唑類殺菌劑，尤其是咪鮮胺，對水稻惡苗病防效優(yōu)良且與多菌靈無交互抗性，在生產中應用廣泛，但隨著藥效下降，田間病原菌菌株的抗性頻率（MIC>3.125 μg/mL）竟高于80%[21]。氰基丙烯酸酯類殺菌劑——氰烯菌酯，由江蘇省農藥研究所1998年合成，具有極高的選擇性和鐮孢菌?；?，與多菌靈和咪鮮胺等無交互抗性，對水稻惡苗病防效優(yōu)良[22]。因肌球蛋白-5點突變而產生的病原抗性，導致浙江?。ń鹑A市、紹興市和嘉興市）水稻惡苗病菌對氰烯菌酯抗性頻率由2017年的18%上升至2018年的47%;氰烯菌酯使用未超過10年，但多個區(qū)域水稻惡苗病菌已產生明顯抗性并且抗性種群還在迅速擴展[23]。目前，農業(yè)農村部農藥檢定所登記用于水稻惡苗病防治的藥劑有將近170個（包括單劑和復配劑）（http：∥www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml），但按制劑有效成分約85%為咪鮮胺、咯菌腈、多菌靈或福美雙，制劑有效成分種類較少，水稻惡苗病有效防控及抗性治理的形勢仍十分嚴峻。

為探明江蘇省水稻惡苗病菌種群結構以及病菌種群對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯抗藥性發(fā)展現(xiàn)狀，筆者對2019年和2020年采自江蘇省水稻惡苗病植株樣本的123株和182株單孢菌株進行了形態(tài)學初步鑒定以及基于TEF1-α序列的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并采用區(qū)分劑量法分別檢測了其對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗藥性，以期為水稻惡苗病菌種群分類鑒定以及藥劑防治與抗藥性治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：2019年在江蘇省阜寧縣等13個縣（市），2020年在儀征市等18個縣（市）采集水稻惡苗病樣品，每田塊采1個病樣。將病樣晾干后，單孢分離獲取菌株，純培養(yǎng)后編號保存?zhèn)溆肹19]。

供試藥劑：95%多菌靈原藥、98%咪鮮胺原藥，江蘇輝豐生物農業(yè)股份有限公司;95%氰烯菌酯原藥，江蘇省農藥研究所股份有限公司。將95%多菌靈原藥用適量0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，其他原藥分別用適量丙酮溶解后用無菌水定容至一定體積，并加入5%的吐溫80作為乳化劑，各藥劑均配制成50 000 μg/mL的母液冷藏備用。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L;PDA液體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

供試試劑盒：Omega真菌DNA提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司;R011 PCR擴增試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的形態(tài)學鑒定

將供試單孢菌株分別移植到PDA平皿上，26℃暗培養(yǎng)并觀察菌落大小及菌落正反面顏色變化，大、小型分生孢子和厚垣孢子形狀及著生方式、產孢細胞形態(tài)特點以及分生孢子座產生情況，并根據鐮孢菌的形態(tài)特征進行菌株形態(tài)學鑒定[15，24]。

1.2.2 供試菌株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

將形態(tài)學鑒定后的單孢菌株分別轉移到PDA平皿上，26℃暗培養(yǎng)7 d，收集菌絲并于鼓風干燥箱75℃烘干約12 h，取10～50 mg干燥菌絲磨成粉末后裝入1.5 mL 離心管中，按照Omega真菌DNA提取試劑盒說明提取各菌株DNA。采用TEF1-α引物：ef1 （5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′）和ef2 （5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）進行PCR[25]。PCR 反應體系（50 μL）： 5 μL 10×Taq DNA 聚合酶 PCR buffer，1 μL dNTPs （10 mmol/L），3 μL MgCl2 （25 mmol/L），1 μL 引物 （10 μmol/L）， 0.5 μL Taq 聚合酶（5 U/μL），1 μL真菌基因組DNA和 37.5 μL ddH2O。PCR反應程序：94℃預變性2 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物經1.7%瓊脂糖凝膠電泳分離并拍照分析條帶后，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行擴增產物的純化及雙向測序。

登錄NCBI網站（http：∥www.ncbi.nih.gov/index.html）對供試菌株TEF1-α序列進行BLAST比對分析，完成菌株比對鑒定。利用MEGA 5.0軟件分別對2019年和2020年供試菌株TEF1-α序列及GenBank下載的藤倉鐮孢F.fujikuroi IMI 58289（HF679028.1）、F.fujikuroi PRC4a（JF699612.1）、F.fujikuroi 37-EF1（KC584844.1）、F.fujikuroi M7055（KC964126.1）、層出鐮孢F.proliferatum ITEM2400（LT841259.1）、F.proliferatum WF16（KP054294.1）、F.proliferatum P8114X（KU872102.1）、F.proliferatum CF598（KF267266.1）、擬輪枝鐮孢F.verticillioides K311（KF562131.1）、F.verticillioides FV4（KP732009.1）、新知鐮孢F.andiyazi LS1（MT947799.1）和F.andiyazi RF258（KT257545.1）等12株標準參照菌株TEF1-α序列，以木賊鐮孢F.equiseti NRRL 13405（GQ915507.1）和變紅鐮孢F.incarnatum NRRL 31160（GQ505607.1）為外群，采用鄰接法（neighbor-joining， NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.2.3 供試菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗藥性檢測

采用區(qū)分劑量法檢測菌株對各藥劑的抗性。多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的鑒別劑量分別設置為10.0、3.0 μg/mL和5.0 μg/mL。配制含藥培養(yǎng)基，以不加藥劑為對照[26]。將待測菌株分別轉移到PDA平皿上，26℃暗培養(yǎng)4 d后取直徑為5 mm的菌餅移至各含藥和對照平皿中，26℃暗培養(yǎng)3 d，每個處理重復3次。不能或幾乎不能在鑒別劑量平皿上生長的為敏感菌株，能生長的為抗性菌株。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的形態(tài)學鑒定結果

依據水稻惡苗病植株樣本上有橘黃色至淺橙色的分生孢子堆，分離菌株在PDA培養(yǎng)基上初為白色然后變成紅色或紫紅色的菌落、氣生菌絲初為白色然后變成淺灰色或淺粉色、小型分生孢子大多在單瓶?；蚨嗥抗５姆稚咦庸Ｉ湘湢钆帕械如犳呔螒B(tài)特征初步將其鑒定為鐮孢菌（圖1），2019年從江蘇省阜寧縣等13個縣（市），2020年從儀征市等18個縣（市）采集的水稻惡苗病植株樣品中各獲得123株和182株供試單孢鐮孢菌。

2.2 供試菌株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析結果

從2019年的123株

和2020年的182株供試鐮孢菌DNA中均擴增出約700 bp TEF1-α片段，不同種間擴增出的片段長度沒有明顯差異（圖2）。將PCR產物純化及雙向測序所得序列提交至GenBank并進行BLAST比對分析得出，2019年和2020年供試菌株均分別為藤倉鐮孢F.fujikuroi、 擬輪枝鐮孢F.verticillioides、層出鐮孢F.proliferatum和新知鐮孢F.andiyazi。2019年的123株菌株中，藤倉鐮孢占比87.80%（108/123），為優(yōu)勢種群，擬輪枝鐮孢占比4.07%（5/123），層出鐮孢占比5.69%（7/123），新知鐮孢占比2.44%（3/123）;2020年的182株菌株中，藤倉鐮孢占比90.11%（164/184），也為優(yōu)勢種群，擬輪枝鐮孢占比1.65%（3/182），層出鐮孢占比2.75%（5/182），新知鐮孢占比5.49%（10/182）（表1～2）。

基于2019年（123株）和2020年（182株）供試鐮孢菌以及GenBank中12株標準參照菌株的TEF1-α序列并以木賊鐮孢F.equiseti NRRL 13405（GQ915507.1）和變紅鐮孢F.incarnatum NRRL 31160（GQ505607.1）為外群，分別進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示供試鐮孢菌株具有廣泛的遺傳多樣性，并且這些菌株被清晰地分為4個不同的類群，即藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和新知鐮孢（圖3～4）。這表明，TEF1-α序列在水稻惡苗病病原鐮孢菌種群鑒定中具有較好的效果。

2.3 水稻惡苗病病原菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗藥性

抗藥性檢測結果得出，2019年采自阜寧縣等13個縣（市）的123株惡苗病菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的總抗性頻率分別為67.48%、23.58%和9.76%，2020年采自儀征市等18個縣（市）的182株菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的總抗性頻率分別為41.21%、43.96%和29.12%，惡苗病菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗性頻率在不同地區(qū)間差異較大（表1～3）。結果表明，江蘇省水稻惡苗病菌對多菌靈和咪鮮胺的抗性頻率整體仍較高，局部地區(qū)抗氰烯菌酯菌株高發(fā)。

2.4 水稻惡苗病病原菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯抗藥性的表現(xiàn)型

依據菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗、感程度，可將2019年的123株菌株和2020年的182株菌株分為7種表現(xiàn)型（表4）。2019年和2020年對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯均有抗性的菌株分別占4.07%和1.65%，對多菌靈和咪鮮胺抗藥而對氰烯菌酯敏感的菌株分別占18.70%和25.82%，對多菌靈抗藥而對咪鮮胺和氰烯菌酯敏感的菌株分別占41.46%和10.99%，對多菌靈和氰烯菌酯抗藥而對咪鮮胺敏感的菌株分別占3.25%和2.75%，對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯均敏感的菌株分別占28.46%和17.58%，對多菌靈和氰烯菌酯敏感而對咪鮮胺抗藥的菌株分別占1.63%和17.03%，對多菌靈和咪鮮胺敏感而對氰烯菌酯抗藥的菌株分別占2.44%和24.18%。

3 討論

我國是全球水稻產銷第一大國，其中江蘇省水稻年種植面積達220萬hm2以上，但對多個區(qū)域水稻惡苗病菌種群尤其是病菌種群結構知之甚少。國內對水稻惡苗病菌種群的研究報道中，大多沿用國內外業(yè)界均已建議廢棄的種名“串珠鐮孢F.moniliforme”[2730]。在鐮孢菌的鑒定中，通?；趥鹘y(tǒng)形態(tài)學特征的鑒定僅作為鐮孢菌的預判或菌種鑒定的輔助措施[15]，而TEF1-α基因序列是鐮孢菌分子鑒定中高效且應用廣泛的鑒別基因序列[31]。本研究對采自江蘇省不同縣（市）水稻惡苗病植株樣本的單孢菌株進行基于形態(tài)特征的初步鑒定后，基于TEF1-α序列進行分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析，結果表明TEF1-α序列在水稻惡苗病菌種群分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析中具有較好效果，同時藤倉鐮孢是江蘇省水稻惡苗病菌種群中的優(yōu)勢種群，這一研究結果與世界多個研究報道相似[8，12，16，19，32]。

2007年，陳夕軍等[33]報道，江蘇省水稻惡苗病菌對多菌靈總抗性頻率達95.8%，而對咪鮮胺總抗性頻率為1.5%，抗性菌株頻率低且不夠穩(wěn)定，加之競爭力較弱，病菌對咪鮮胺的田間抗性可能增長緩慢。2013年，楊紅福等[34]報道，江蘇由于長期單一使用咪鮮胺浸種防治水稻惡苗病，導致水稻惡苗病菌對咪鮮胺總抗性頻率達82.14%，抗性菌株成為田間優(yōu)勢種群，并導致田間咪鮮胺對水稻惡苗病喪失防效。據報道，2016年采自江蘇省16個縣（市）的202株藤倉赤霉菌對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的總抗性頻率分別為77.72%、67.33%和0%[26];2018年采自浙江省嘉興市某些田塊的水稻惡苗病菌對氰烯菌酯抗性頻率達100%[23]。本研究中，2019年采自江蘇省13個縣（市）的123株和2020年采自18個縣（市）的182株水稻惡苗病菌對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的總抗性頻率分別為67.48%、23.58%、9.76%和41.21%、43.96%、29.12%;依據菌株對多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯的抗、感性程度，可將菌株分為7種表現(xiàn)型，未檢測到對多菌靈敏感而對咪鮮胺和氰烯菌酯抗藥的菌株。不同年份間，水稻惡苗病菌對多菌靈和咪鮮胺抗性頻率有一定波動，這可能是檢測樣本差異導致的，但田間菌株對多菌靈和咪鮮胺的抗性頻率整體仍較高。水稻惡苗病菌對氰烯菌酯抗性從未檢測到抗性菌株，發(fā)展至總抗性頻率達29.12%，2020年采自江蘇溧水某些田塊菌株對氰烯菌酯抗性頻率甚至達100%。可見，江蘇省水稻惡苗病菌對氰烯菌酯抗性也已逐漸擴展，并且局部地區(qū)對氰烯菌酯抗性高發(fā)。鑒于水稻惡苗病菌抗藥性發(fā)展現(xiàn)狀，在江蘇省水稻生產中，不宜繼續(xù)使用多菌靈、咪鮮胺和氰烯菌酯作為主效成分的單劑或復配劑防治水稻惡苗病。

本研究中，由于采集的水稻惡苗病樣本偏少，江蘇省水稻惡苗病菌種群結構鑒定結果未能完全反映現(xiàn)狀，層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和新知鐮孢在大田實際危害及病菌種群占比情況還有待進一步研究。在水稻惡苗病防治中，需綜合應用選育無病種子、催芽及秧苗期加強栽培管理及調優(yōu)種子處理藥劑與方法相結合的多項防控措施，堅持“預防為主，綜合防治”的策略，以保障水稻高產穩(wěn)產及糧食安全。

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（責任編輯：楊明麗）