細(xì)胞焦亡與自噬的相互關(guān)系及其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用

潘天琦 田 華，2 姚樹(shù)桐

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250117；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250355

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種與脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量［1］。在正常組織中經(jīng)常發(fā)生的細(xì)胞死亡，是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必需的，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有壞死、凋亡、壞死性凋亡、焦亡、自噬和鐵死亡等多種細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要組成部分，并參與AS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程［2］。進(jìn)一步研究細(xì)胞焦亡的特征、分子機(jī)制及其在AS 發(fā)病及防治機(jī)制中的作用，將有助于加深對(duì)細(xì)胞死亡方式和機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為AS 相關(guān)疾病的防治提供新思路，現(xiàn)就細(xì)胞焦亡在AS 發(fā)展中的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1 細(xì)胞焦亡

1.1 細(xì)胞焦亡的特征

Cookson等［3］提出pyroptosis一詞，即細(xì)胞焦亡，介于凋亡和壞死之間。細(xì)胞焦亡由caspase-1介導(dǎo)，其下游的炎癥小體發(fā)生組裝，由打孔蛋白Gasdermin家族的Gasdermin D（GSDMD）來(lái)執(zhí)行。細(xì)胞焦亡時(shí)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、染色質(zhì)濃縮和DNA階梯缺失，并且膜聯(lián)蛋白Ⅴ（annexinⅤ）和TUNEL染色陽(yáng)性。迄今為止，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是可以被生命過(guò)程調(diào)控的死亡，壞死則被經(jīng)典地描述為非調(diào)控細(xì)胞死亡［4-5］。

1.2 細(xì)胞焦亡的執(zhí)行者—Gasdermin D蛋白

Gasdermin家族是一種在特定條件下表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)蛋白，也是焦亡的介質(zhì)蛋白，主要包括GSDMA、GSDMB、GSDMC和GSDMD，其中GSDMD蛋白在細(xì)胞焦亡中的作用被廣泛研究，其包含大約480個(gè)氨基酸，分為N端的Gasdermin-N和C端的Gasdermin-C兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)一個(gè)靈活的連接子相連，Gasdermin-C結(jié)構(gòu)域?qū)asdermin-N 結(jié)構(gòu)域起到抑制作用，全長(zhǎng)GSDMD是無(wú)活性的，但這種靈活的連接子特別容易受到蛋白酶的攻擊，可以作為一個(gè)簡(jiǎn)單的警報(bào)系統(tǒng)。當(dāng)caspase-1/4接收到體內(nèi)外傳來(lái)的危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)發(fā)生活化，這些半胱天冬酶便可在GSDMD 的中心連接區(qū)進(jìn)行切割，Gasdermin-N與Gasdermin-C結(jié)構(gòu)域發(fā)生解離后可與真核細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇或原核細(xì)胞膜上的心磷脂結(jié)合，或與天然極性脂質(zhì)混合物的脂質(zhì)體特異性結(jié)合。Gasdermin-N通過(guò)電荷-電荷之間的相互作用發(fā)生寡聚化，形成直徑12～14 nm的孔道，脂質(zhì)體滲漏、生物膜溶解，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹并最終溶解，進(jìn)而發(fā)生“細(xì)胞焦亡”［6-7］。

1.3 細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路

1.3.1 經(jīng)典焦亡途徑 典型的炎癥小體是由輔助蛋白和自我寡聚化支架蛋白組成的，它們通常屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR）家族，目前為止已經(jīng)確定NLRP1、NLRP3、NLRC4和黑素瘤缺乏因子（absent in melanoma 2，AIM2）四個(gè)炎癥小體。細(xì)胞焦亡作為一種炎癥性死亡途徑，在細(xì)菌、病毒、真菌等病原體相關(guān)分子模式（inflammatory pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）和ATP、膽固醇等危險(xiǎn)信號(hào)分子模式（damage-incorporated molecular patterns，DAMPs）的刺激下，在細(xì)胞質(zhì)感應(yīng)到PAMPs或DAMPs后，炎性小體進(jìn)行組裝并通過(guò)近距離誘導(dǎo)的自身蛋白水解激活炎性caspases-1，活化的caspase-1將關(guān)鍵的促炎IL-1家族細(xì)胞因子加工成引起焦亡的活性形式，但需要GSDMD介導(dǎo)其釋放，IL-1家族還可以通過(guò)觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)放大炎癥，激活NFκB、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的分泌［8-10］。

1.3.2 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑 在發(fā)生感染的細(xì)胞胞漿中可以檢測(cè)到細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）分子，LPS 激活小鼠體內(nèi)caspase-11［11］，研究發(fā)現(xiàn)caspsase-11/4/5 以高特異性和親和力直接結(jié)合LPS，caspase-11 上的CARD 結(jié)構(gòu)域可能是識(shí)別LPS的位點(diǎn)，多個(gè)CARD 肽段與LPS 結(jié)合形成了活化形式的caspase-1，經(jīng)寡聚后被活化誘導(dǎo)焦亡，而CARD結(jié)構(gòu)域缺陷時(shí)對(duì)LPS沒(méi)有反應(yīng)［12］。人體內(nèi)并不擁有caspase-11，但是人caspase-4/5 與caspase-11 具有很高的同源性，因此caspase-4和caspase-5也具有相同的功能，這種功能代表了新的免疫識(shí)別模式。Caspase-11/4/5-LPS復(fù)合物被歸類為非典型性炎癥小體［13］?；罨腸aspase-11/4/5可以直接裂解GSDMD，在細(xì)胞膜上形成釋放炎癥介質(zhì)的管道，大量炎癥因子被釋放，促進(jìn)細(xì)胞焦亡［6］。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路

Caspase-1 基因敲除小鼠對(duì)注射致死劑量的LPS 具有高度抵抗力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺少caspase-11 的小鼠也具有此特性［14］，這一研究發(fā)現(xiàn)已顯示出細(xì)胞焦亡的重要作用，但為了開(kāi)發(fā)防治AS的新策略，需要對(duì)二者的潛在關(guān)系進(jìn)行更深入的了解。

2 細(xì)胞焦亡與AS的關(guān)系

AS 是一種慢性炎癥性疾病，血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）、平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）及巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞參與AS 的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)焦亡也可以發(fā)生在這些細(xì)胞中，而焦亡作為細(xì)胞死亡的重要形式之一，是針對(duì)細(xì)胞感染產(chǎn)生的一種炎癥反應(yīng)。對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的AS 斑塊進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)均上調(diào)，且這些蛋白在穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)明顯低于不穩(wěn)定斑塊［15］，說(shuō)明細(xì)胞焦亡與AS斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)。

眾所周知，VECs 功能障礙和死亡是AS 發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）等都是NLRP3 的直接激活劑，而且都可以導(dǎo)致VECs 發(fā)生損傷［16］。新近研究表明，琥珀酸作為三羧酸循壞的中間代謝產(chǎn)物，可以增加VECs 中ROS 含量，導(dǎo)致焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯上升［17］，在AS 進(jìn)展中起著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道甲基蓮心堿作為自由基清除劑，可增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性，抑制ROS 的產(chǎn)生，從而抑制NLRP3 的激活和炎癥因子釋放，減輕內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，并可減輕AS 病變［18］。另一篇報(bào)道中，ox-LDL 可以通過(guò)上調(diào)miR-125a-5p 和下調(diào)甲基胞嘧啶雙加氧酶（tet methylcytosine dioxygenase 2，TET2）誘 導(dǎo)VECs 焦亡，因此，靶向miR-125a-5p/TET2 通路可能調(diào)節(jié)DNA 甲基化，改善線粒體功能，抑制焦亡，是AS 潛在的表觀遺傳生物學(xué)標(biāo)志物和治療方向［19］。同時(shí)，胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）也是通過(guò)減輕ox-LDL誘導(dǎo)的VECs焦亡來(lái)發(fā)揮其抗炎抗氧化作用的［20］。鎘（Cd）和丙烯醛是常見(jiàn)的環(huán)境污染物，與AS相關(guān)性心血管病相關(guān)，研究報(bào)道其可能是通過(guò)NLRP3途徑激活caspase-1，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，而抑制NLRP3則可減輕內(nèi)皮細(xì)胞焦亡［21］。以上大量研究證實(shí)，對(duì)VECs焦亡通路進(jìn)行干預(yù)，可減輕焦亡，可能成為AS防治的重要措施。

VSMCs 是AS 病變中主要的細(xì)胞成分，被認(rèn)為在心血管疾病的發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用［22］，近年來(lái)研究表明VSMCs焦亡與AS斑塊易損性密切相關(guān)。Ox-LDL 通過(guò)激活caspase-1 炎癥小體途徑導(dǎo)致VSMCs焦亡，造成膠原和基質(zhì)丟失、纖維帽變薄，極易導(dǎo)致斑塊破裂，壞死性粥樣物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)血液，從而導(dǎo)致動(dòng)脈血栓形成和急性血管事件的發(fā)生［23］。經(jīng)過(guò)caspase-1抑制劑VX-765干預(yù)后發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E基因敲除小鼠的VSMCs 焦亡程度顯著減輕，并可通過(guò)降低主動(dòng)脈中脂質(zhì)負(fù)荷而顯著抑制小鼠AS的發(fā)展［24］。血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一種常見(jiàn)的肽類調(diào)節(jié)因子，有利于VSMCs 等細(xì)胞生長(zhǎng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PDGF 處理后VSMC 中NLRP3、caspase-1 表達(dá)均上調(diào)，提示PDGF能誘導(dǎo)VSMCs中NLRP3炎癥小體活化，引起VSMCs焦亡［25］。

巨噬細(xì)胞焦亡在AS 病變中起到關(guān)鍵性作用。Shi等［26］觀察到在頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的AS斑塊中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)均上調(diào)，且其表達(dá)主要見(jiàn)于不穩(wěn)定斑塊的晚期AS病變，以及巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，增加了斑塊脆弱性。本課題組既往研究結(jié)果顯示，晚期糖基化白蛋白（advanced glycated albumin，AGE-alb）是AS的一個(gè)重要致病因素，可濃度依賴性地增加巨噬細(xì)胞焦亡，而給予MCC950（NLRP3 特異性抑制劑）處理后焦亡程度明顯減輕［27］。膽固醇作為AS形成的主要原因，能夠觸發(fā)NLRP3、caspase-1 信號(hào)途徑的激活，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，可能是AS中炎癥形成的關(guān)鍵因素。以上研究說(shuō)明，細(xì)胞焦亡與AS 的誘因息息相關(guān)，這些誘因可以激活炎癥小體，導(dǎo)致慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致AS。炎癥小體是把雙刃劍，在急性疾病中炎癥小體被激活后有助于清除死亡細(xì)胞并啟動(dòng)組織修復(fù)，而在慢性疾病中炎癥小體的持續(xù)激活是有害的。因此為了探索炎癥小體作為治療靶點(diǎn)的潛力，需要對(duì)介導(dǎo)炎癥小體激活的有益和有害作用的信號(hào)分子進(jìn)行更多的探索。

3 細(xì)胞焦亡與自噬的關(guān)系及其在AS進(jìn)展中的作用

自噬（autophagy）是一個(gè)古老的、進(jìn)化上保守的分解代謝過(guò)程，與細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)物的降解和循環(huán)密切相關(guān)，它可以將細(xì)胞質(zhì)貨物運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，并通過(guò)溶酶體水解酶進(jìn)行后續(xù)降解。自噬缺陷可以導(dǎo)致包括AS在內(nèi)的多種疾病，因此了解自噬調(diào)節(jié)機(jī)制及其與AS的關(guān)系對(duì)于開(kāi)發(fā)新的AS治療方法至關(guān)重要。近年來(lái)研究表明，自噬與細(xì)胞焦亡存在相互作用，并參與AS發(fā)生和發(fā)展。Van等［28］認(rèn)為自噬功能障礙可以激發(fā)單核細(xì)胞進(jìn)行線粒體介導(dǎo)的NLRP3炎癥體激活，從而導(dǎo)致IL-1β的過(guò)度分泌。在焦亡通路中，PRR是感知PAMPs 和DAMPs 外源性和內(nèi)源性“危險(xiǎn)”信號(hào)的傳感器，可以通過(guò)微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）或beclin-1 信號(hào)通路調(diào)控自噬，而自噬能夠?qū)RR 和NLRP3介導(dǎo)的炎癥形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即抑制其組裝活化，以維持體內(nèi)平衡，防止發(fā)生過(guò)度炎癥反應(yīng)［29］。小檗堿（berberine，BBR）可以通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞的自噬水平抑制NLRP3的激活，而降低beclin-1水平或添加自噬抑制劑后則可拮抗BBR對(duì)NLRP3生成/表達(dá)的抑制作用［30］。來(lái)自對(duì)褪黑素（melatonin，MT）的研究表明，MT具有抗炎特性，用其治療高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)AS中NLRP3活化和IL-1β分泌均減少，而這種保護(hù)效果可被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤所逆轉(zhuǎn)，這表明MT通過(guò)其抗炎特性抑制AS的進(jìn)展，另外觀察到MT可以通過(guò)消除巨噬細(xì)胞中ROS的同時(shí)降低NLRP3炎癥小體的表達(dá)，最終MT治療后發(fā)現(xiàn)AS斑塊明顯減小且穩(wěn)定性增加［31］。用活性氧抑制劑治療巨噬細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥體的表達(dá)顯著降低，為了驗(yàn)證自噬在這一過(guò)程中的作用，巨噬細(xì)胞用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）或誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理，用3-MA處理后NLRP3表達(dá)明顯上升，而雷帕霉素處理后NLRP3炎癥體的表達(dá)被顯著抑制。這種方式證實(shí)了ROS、自噬和NLRP3炎癥小體激活之間的關(guān)系［32］。當(dāng)NLRP3被過(guò)度激活時(shí)，亦會(huì)抑制自噬。在LPS 誘導(dǎo)的抑郁大鼠中，NLRP3被過(guò)度激活后引發(fā)神經(jīng)炎癥，而beclin-1水平和LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值顯著降低，提示自噬受到顯著抑制［33］。也有文獻(xiàn)報(bào)道自噬可正向調(diào)節(jié)酵母菌中NLRP3炎癥小體的激活［34］。當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí)，自噬可以通過(guò)Atg5依賴性途徑增強(qiáng)caspase-1和炎癥小體活化，炎癥因子釋放增加，加重組織的炎癥性損傷，根據(jù)目前研究來(lái)看這種現(xiàn)象可能是酵母菌獨(dú)有的，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞焦亡與自噬之間的確切關(guān)系及其在AS不同階段的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-18 在人體AS 斑塊中高表達(dá)［35］，因此IL-1β在AS發(fā)展中的關(guān)鍵作用突出了這種細(xì)胞因子作為干預(yù)的潛在目標(biāo)，Canakinumab抗炎治療后血栓形成結(jié)果研究試驗(yàn)提供了強(qiáng)有力的支持，患者采用IL-1β阻斷治療后，顯示出預(yù)防心肌梗死復(fù)發(fā)的效果［36］。動(dòng)物研究表明，IL-1β 阻斷治療后，ApoE-/-小鼠中已經(jīng)形成的AS斑塊顯著減少［37］。但I(xiàn)L-1β被阻斷后可能會(huì)干擾感染免疫反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的感染，Li等［38］已經(jīng)解決此問(wèn)題，試驗(yàn)中采用人造血小板微顆粒（platelet microparticles，PMs）為載體，將抗IL-1β抗體輸送到心臟，并在心臟損傷的治療中達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。

4 自噬可能成為治療AS的重要靶點(diǎn)

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥過(guò)程和脂質(zhì)代謝共同促進(jìn)了動(dòng)脈壁AS斑塊的形成，通過(guò)阻斷相關(guān)分子（例如NLRP3、caspase-1、IL-1β/18）的誘導(dǎo)因素（如ox-LDL）可以抑制焦亡對(duì)AS進(jìn)展的影響［39］。焦亡是一種廣泛發(fā)生的炎癥反應(yīng)，隨著研究的深入這種死亡模式逐漸被闡明，但仍有一些問(wèn)題有待解決，如除自噬外還有何因素調(diào)節(jié)焦亡，Gasdermin家族其他成員在焦亡中發(fā)揮什么作用，在AS的發(fā)生發(fā)展中扮演什么樣的角色。

鑒于細(xì)胞焦亡與AS 之間關(guān)系密切，那么干擾特定的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路，一定程度上可抑制AS的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)，大量研究集中在自噬和炎癥小體之間的關(guān)系上，適度的激活自噬可以抑制炎癥小體的活化，且自噬抑制炎癥小體的理論已經(jīng)在許多炎癥性疾病的治療中得到試驗(yàn)證明，但是二者之間的關(guān)系尚未完全闡明［40］。因此我們可以對(duì)這一方向進(jìn)行深入探索，不僅有助于研究者和臨床醫(yī)生了解自噬和炎癥的相關(guān)病理生理過(guò)程，還可以為AS靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突