制霉菌素混懸劑的制備及質(zhì)量評價

黃 嵩，鄒梅娟，樸洪宇

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

制霉菌素（nystatin, NYS）分子式為 C47H75NO17，分子量為 926.29，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖 1。NYS是一種多烯型抗生素，具有共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，常用于治療皮膚與口腔感染的病原體念珠菌[1-2]。其作用機制為與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，導(dǎo)致膜通透性改變，以致重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏而達(dá)到殺滅真菌的目的[3-5]。與其他抗真菌藥相比，NYS 具有更廣泛的抗真菌譜，由于口服在胃腸道吸收差，肝毒性風(fēng)險低，藥物相互作用和不良反應(yīng)未見報導(dǎo)[6-8]。

Fig. 1 Molecular formula of nystatin 圖1 制霉菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

制霉菌素混懸劑 1994 年在英國上市，商品名為 NystatinTMoral suspension（ready-mixed），國內(nèi)尚未有同類制劑生產(chǎn)。且該混懸劑雖然生產(chǎn)工藝簡單，但各批次制劑含量容易產(chǎn)生差異，制劑制備中 pH 易發(fā)生改變，制劑的穩(wěn)定性易受到影響。本實驗采用先將 NYS 分散于適宜介質(zhì)中，再通過分散法制備 NYS 混懸劑，以提高制劑的穩(wěn)定性，降低批次間差異。對 NYS 混懸劑的處方進(jìn)行篩選，并研究各處方因素對 NYS 混懸劑穩(wěn)定性的影響。

1 儀器和材料

BS110S 電子天平（德國 Sartorius 有限公司），F(xiàn)A25 型高速剪切勻質(zhì)機（德國 Fluko 公司），L-2000 高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），L-2420 UV-VIS 檢測器（日本 Hitachi 公司），Rcz-6B 型藥物溶出度儀（上海黃海藥檢儀器廠），pHS-25 精密 pH 計（上海雷磁儀器廠），UV-1800 紫外分光光度計（日本 Shimadzu 公司）。

制霉菌素（含量 6300 Units/mg，批號 C130556；Capua Bioservics S.p.A），甘油（P & G Chemicals），蔗糖（南寧糖業(yè)股份有限公司伶俐糖廠），羧甲基纖維素鈉（Ashland Globle Holdings Inc.），磷酸氫二鈉（湖南九典制藥股份有限公司），對羥基苯甲酸甲酯（上野制藥株式會社），對羥基苯甲酸丙酯（上野制藥株式會社），香精（International Flavors & Fragrances Inc.）。

2 方法與結(jié)果

2.1 制霉菌素含量測定方法

臨用新制。取本品，振蕩 30 秒至均勻，靜置 30 秒。用內(nèi)容量移液管精密量取 1.0 mL，置200 mL 棕色量瓶中，用流動相分次洗滌移液管內(nèi)壁，洗滌液并入量瓶中，繼續(xù)加流動相至約 190 mL，超聲 5 min，用流動相稀釋至刻度，搖勻。用注射器吸取 5 mL，經(jīng) 0.22 μm 有機濾膜濾過，棄去初濾液 2.5 mL，取續(xù)濾液 1 mL，作為供試品溶液，精密量取 10 μL 注入液相色譜儀中，記錄色譜圖；另取 NYS 對照品 50.0 mg，精密稱定，置 50 mL 棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺至48 mL，超聲 2 分鐘，用二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻（對照品放置冷藏中 3 天穩(wěn)定）。精密量取 1.0 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，用流動 相稀釋至刻度，搖勻，即得 NYS 對照品溶液，同法測定[9]。按外標(biāo)法以峰面積計算。

其中，Ru為供試品制霉菌素 A1及其異構(gòu)體峰面積之和，Rs為對照品制霉菌素 A1及其異構(gòu)體峰面積之和，Wst為對照品稱樣量（mg），Vs為供試品稱樣體積（mL），Dst為對照品稀釋倍數(shù)，Ds為供試品稀釋倍數(shù)，Pst為對照品純度（units/mg），L 為供試品標(biāo)示量（units/mL）。

高效液相色譜（HPLC）條件 色譜柱：Diamonsil C18ODS2（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）；流動相：甲醇-N, N-二甲基甲酰胺-0.1 M 醋酸銨溶液（550 : 150 : 270, v / v / v）；檢測波長：305 nm；柱溫：25 ℃，流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。該色譜條件下，NYS 在 290.9～872.7 units/mL范圍內(nèi)峰面積和濃度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為 A = 7 008.8C + 8 625.2（r2= 0.999 8）。NYS 回收率在 98～102% 之間，精密度 RSD < 2.0%，該方法專屬性、精密度、穩(wěn)定性良好（RSD < 2.0%）。

2.2 制霉菌素溶出度測定方法

取本品 0.5 mL（約相當(dāng)于 NYS 50,000 Units），照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2020年版四部通則 0931 第二法），以 0.1% SDS 溶液 900 mL 為溶出介質(zhì)，溫度 37 ± 0.5 ℃，轉(zhuǎn)速為每分鐘 50 轉(zhuǎn)，依法操作。經(jīng) 5 min 時，取溶液適量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取NYS 對照品適量，加溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋制成每 l mL 中約含 61.8 units 的溶液，作為對照品溶液。取上述兩種溶液，照紫外分光光度法在 305 nm 測定其吸光度。溶出度應(yīng)大于 50%，溶出度誤差限度小于 15%，應(yīng)符合規(guī)定。

其中，As為對照品吸光度值，At為供試品吸光度值，Ws為對照品稱樣量（mg），Vt為供試品稱樣體積（mL），Pst為對照品純度（units/mg），L 為供試品標(biāo)示量（units/mL）。

溶出介質(zhì)中，NYS 在 6.2～77.2 units/ml 范圍內(nèi)吸光度和濃度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A = 0.011 78C - 0.006 72（r2= 0.998 4）。NYS 回收率在 98～102% 之間，專屬性良好，精密度良好（RSD < 2%）、穩(wěn)定性良好。

2.3 沉降體積比

參照《中國藥典》2020 年版四部通則 0123，用具塞量筒量取供試品 50 mL，密塞，用力振搖 1 min，記下混懸物初始高度 H0，靜置 3 h，記下混懸物最終高度 H，按下式計算：

沉降體積比 = H / H0。沉降體積比不應(yīng)低于 0.9。

2.4 原研制劑的初步分析

根據(jù)原研制劑說明書及對原研制劑的初步分析，制劑由制霉菌素、蔗糖、甘油、乙醇、羧甲基纖維素鈉、磷酸鹽、防腐劑、香精和純化水組成。對原研制劑（批號：F203，標(biāo)示量 100 000 units/mL）進(jìn)行抽樣分析。原研制劑為淡黃色或黃色混懸劑；制劑中制霉菌素為針狀結(jié)晶，粒徑在 50 微米左右；pH 在 6.95～7.05 之間；含量在 95%～115% 之間；5 min 時溶出度在 85%～95% 之間；沉降體積比為 1.0。

2.5 制霉菌素混懸劑的制備

蔗糖 30 g 與處方量羧甲基纖維素鈉混勻，加適量水制成蔗糖溶液，備用。將 2.5 g 甘油加適量水配制成溶液，將 1.6 g NYS 分散在甘油水溶液中，慢慢加入上述蔗糖溶液中，邊加邊攪拌。加入 0.12 g 磷酸氫二鈉，0.075 g 對羥基苯甲酸甲酯、0.015 g 對羥基苯甲酸丙酯和適量香精，補加水至 100 mL，高速剪切 10 000 r/min，約 10 min，至分散均勻，調(diào)節(jié) pH 至 7，真空脫氣后，過 100 目篩，即得。

2.6 處方篩選

2.6.1 制霉菌素分散介質(zhì)的篩選

NYS 具有較強的疏水性，直接將 NYS 分散到蔗糖溶液中極易聚結(jié)[10]，影響制劑的均勻性與物理穩(wěn)定性。因此需要將 NYS 分散在合適的介質(zhì)中，先攪拌制成分散均勻的液體，再將含藥混懸液轉(zhuǎn)移至糖漿中。甘油作為常見的助懸劑同時具有較好的潤濕性，本身與水也可以任意比例互溶。乙醇具有良好的潤濕效果，NYS 在乙醇溶解度低，因此乙醇水溶液也可用作分散介質(zhì)。將相同量的 NYS 分別混入等體積下表所述三種分散介質(zhì)中，通過觀察分散后的狀態(tài)與靜置之后的沉降體積比考察以上三種分散介質(zhì)，結(jié)果見表 1。

Table 1 Screening of dispersion media表1 分散介質(zhì)的篩選

結(jié)果表明，當(dāng)以水為分散介質(zhì)時，NYS 幾乎全部漂浮在水面上，經(jīng)過較長時間攪拌后，逐漸分散在水中，但仍會聚集成大的團(tuán)塊，轉(zhuǎn)移過程中容易附著在容器壁上。當(dāng)以乙醇水溶液作為分散介質(zhì)時，雖然 NYS 的分散效果與流動性較好，但是混懸液的物理穩(wěn)定性較差，NYS 沉降速度快，也不利于轉(zhuǎn)移。只有甘油水溶液作為分散介質(zhì)時，NYS 分散良好的同時有較好的物理穩(wěn)定性，其流動性也適于物料轉(zhuǎn)移，因此選擇甘油水溶液作為 NYS 的分散介質(zhì)進(jìn)行之后的處方篩選。

2.6.2 羧甲基纖維素鈉用量的篩選

CMC-Na 易于分散在水中形成透明的膠體溶液，溶液具有一定粘度，能夠長時間保持穩(wěn)定，因此常用作助懸劑[11]。同時為了保證分散效果和分散速度，需要將粘度控制在合適的范圍，因此對 CMC-Na 的用量進(jìn)行了篩選。分別考察了 0.1%、0.15% 和 0.2% 的 CMC-Na 用量，結(jié)果見表 2。

Table 2 Screening of the amount of CMC-Na表2 CMC-Na用量的篩選

結(jié)果表明，隨 CMC-Na 用量的提高，混懸劑的粘度也會升高。當(dāng) CMC-Na 用量為 0.1% 時，制劑粘度偏低，雖然在水中可以以很快的速度分散，但制劑隨放置時間會產(chǎn)生分層的現(xiàn)象，物理穩(wěn)定性不好。當(dāng) CMC-Na 用量為 0.2% 時，混懸劑粘度較大，分散困難，在水中分散速度也較為緩慢，有可能進(jìn)一步影響藥物的溶出速度。因此選擇添加 0.15% CMC-Na，物理穩(wěn)定性良好，分散速度較快，但不足以完全掩蓋 NYS 的苦味，考慮添加矯味劑進(jìn)行彌補。

2.6.3 防腐劑對混懸劑 pH 的影響

蔗糖溶液作為基質(zhì)時具有較好的粘度，物料也較為廉價，在混懸劑中應(yīng)用廣泛。而 NYS 有土腥味，蔗糖溶液能起到較好的掩味效果，一定程度上提高 NYS 的口服順應(yīng)性，因此選用蔗糖溶液作為制劑的基質(zhì)。實際應(yīng)用過程中，發(fā)現(xiàn)蔗糖溶液的 pH 值隨時間會發(fā)生較大變化，由最開始的中性快速轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝原h(huán)境，對 NYS 的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。根據(jù)文獻(xiàn)與實際應(yīng)用需要，選擇添加防腐劑抑制 pH 值變化。對羥基苯甲酸甲酯與對羥基苯甲酸丙酯都是常用的醫(yī)藥防腐劑，由于具有酚羥基結(jié)構(gòu)，抗細(xì)菌能力比苯甲酸、山梨酸要強，兩者聯(lián)用具有較好的加成性與協(xié)同性。將處方放置在 40 ℃ 條件下，分別在 5 天和 10 天時測定 pH 值，結(jié)果見表 3。

Table 3 Effects of preservatives on pH stability of the syrup表3 防腐劑對基質(zhì)pH穩(wěn)定性的影響

結(jié)果表明加入對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯可以有效提高混懸劑基質(zhì)的 pH 穩(wěn)定性。這是因為蔗糖在水中會分解為葡萄糖和果糖，高溫和強酸條件都會加劇轉(zhuǎn)化反應(yīng)。分解得到的葡萄糖在微生物作用下生成葡萄糖酸及其它具有弱酸性的物質(zhì)[12]，影響制劑的 pH 穩(wěn)定性。對羥基苯甲酸甲酯與對羥基苯甲酸丙酯可以有效殺菌，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)換為葡萄糖酸。當(dāng)溶液 pH 值為 7 時，對羥基苯甲酸甲酯與對羥基苯甲酸丙酯殺菌活性也能維持較高的活性[13]，適合本制劑使用。

2.6.4 矯味劑的篩選

由于 NYS 的味道難以通過基質(zhì)完全掩蓋，需要添加矯味劑使制劑的氣味和味道易于接受，從而提高患者的順應(yīng)性。由于常用香精多為弱酸性，也可能與基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)影響制劑的穩(wěn)定性，選擇了三種味道較好的香精制備成制劑，放置在高溫環(huán)境下進(jìn)行考察，結(jié)果見表 4。

Table 4 Effects of the flavor on pH stability 表4 矯味劑對制劑 pH 穩(wěn)定性的影響

結(jié)果表明，Cherry I 型香精和琵琶香精都會逐漸酸化，降低制劑的 pH 值，但 pH 的變化短時間不會對含量產(chǎn)生影響。Cherry II 型香精 pH 較為穩(wěn)定。其中作用機制尚不明確，根據(jù)類似文獻(xiàn)[14]推測原因為，兩種香精中都含有大量酸、酯類化合物，容易使制劑 pH 降低。Cherry II 型香精相比之下，酸、酯類物質(zhì)含量可能較少，能夠在矯味的同時維持較好的 pH 穩(wěn)定性，利于保持制劑的穩(wěn)定性，因此，選用 Cherry II 型香精作為矯味劑。

2.7 制霉菌素混懸劑的表征

取 NYS 混懸劑 0.5 mL，加入純化水 1 mL，以10 000 r/min 的速度離心 15 min，棄去上清液，將底層沉淀在 -60 ℃ 下減壓凍干，即得 NYS 素凍干粉。以市售制劑作為參比，同法處理，用于之后的表征實驗。

2.7.1 SEM 觀察

通過掃描電鏡（scanning electron microscope, SEM）觀察原料藥與制劑的形態(tài)與表面特性。方法為：將樣品用導(dǎo)電的膠固定在鋁制短柱上，表面噴金，采用 20 kV 的加速電壓掃描器表面并拍照，結(jié)果見圖 2。

Fig. 2 Scanning electron microphotographs of NYS (A), self-made preparation (B) and commercial preparation (C) 圖2 制霉菌素原料藥（A）、自制制劑（B）和市售制劑（C）的SEM電鏡圖

結(jié)果顯示，NYS 原料藥呈短柱狀，粒徑在 5 μm 左右，粒徑分布較為均勻；制劑中的 NYS呈針狀，粒徑在 50 μm 左右，粒徑分布比較均勻，與市售制劑一致。推測 NYS 晶體在放置過程中會逐漸生長，通過 DSC 與 XRD 判斷 NYS 的晶型是否發(fā)生改變。

2.7.2 DSC

通過差示掃描量熱法分析法考察原料藥與制劑的晶型，稱取樣品 3.0～5.0 mg，氮氣保護(hù)下，以 10 ℃/min 的速度從 35 ℃ 升至 280 ℃，圖譜見圖 3。

通過差熱掃描量熱法的結(jié)果可知，自制制劑凍干粉在 150 ℃ 和 170 ℃ 附近有兩個吸熱峰，與原料藥相比位置并未發(fā)生明顯的變化，說明制劑中藥物的晶型與原料藥一致，在制劑過程中沒有發(fā)生改變。自制制劑的 DSC 曲線與市售制劑基本一致，說明兩者晶型相同。

2.7.3 XRD

通過 X-射線衍射分析原料藥與制劑的晶型，取適量原料藥與制劑進(jìn)行 X-射線粉末衍射分析，輻射源為 Cu-Kα，管壓 40 kV，管流 30 mA，掃描角度 3～50°，步長 0.02，掃描速度 2°/min，衍射圖譜同見圖 4。

結(jié)果表明，NYS 在 2θ 為 5°～30° 內(nèi)有明顯的晶體衍射峰。自制制劑凍干粉與原料藥的衍射峰位置沒有明顯差異，以上結(jié)果進(jìn)一步說明了 NYS 在制劑過程中晶型沒有發(fā)生改變。同時，自制制劑的 XRD 圖譜與市售制劑基本一致，表明兩者晶型相似。

Fig. 3 Differential scanning calorimetry cerves of NYS (A), self-made preparation (B), and commercial preparation (C) 圖3 制霉菌素原料藥（A）、自制制劑（B）和市售制劑（C）的DSC曲線

2.8 穩(wěn)定性

由以上實驗可知，穩(wěn)定的 pH 值是制劑能夠保持穩(wěn)定的關(guān)鍵，結(jié)合 NYS 的自身特點，考察在實際儲存條件下的穩(wěn)定性情況。將三批模擬商品包裝的樣品與市售制劑置于相對濕度 60 ± 5%、溫度為 25 ± 2 ℃ 的條件下存放，分別于第 3、6、9、12 月取樣，以外觀、含量、溶出度、pH值和沉降體積比為指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果見表 5。

結(jié)果表明，NYS 混懸劑在商品包裝的條件下，存放 12 個月后，外觀不變，溶出度與沉降體積比無明顯變化，pH 值與藥物含量略有減小，但在合格范圍內(nèi)。與市售制劑相比，制劑穩(wěn)定性有所提高，說明自制 NYS 混懸劑穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 劑型與處方選擇

NYS 常制成片劑用以治療消化道念珠菌病，也可制備成泡騰片，治療白色念珠菌和其他念珠菌所引起的陰道感染。為了方便口腔用藥和兒童用藥，可以選擇制成混懸劑?；鞈覄┛谥嗅尫趴?，直達(dá)患處，患者順應(yīng)性強。

然而，NYS 有濃重的土腥味，制成混懸劑時需要在保證制劑穩(wěn)定性的前提下進(jìn)行調(diào)味。NYS本身穩(wěn)定性較差，混懸劑的物理穩(wěn)定性也需要重點考察，是處方考察中的難點。

處方篩選中選擇混懸劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性制劑性狀、粘度、pH 穩(wěn)定性側(cè)重考察，為處方篩選提供了依據(jù)。當(dāng)處方粘度較大時，制劑的物理穩(wěn)定性良好，掩味效果也較好，但是分散較慢可能會影響藥物的釋放。NYS 在酸性條件和堿性條件下都不穩(wěn)定，制劑應(yīng)始終保持在中性環(huán)境，磷酸氫二鈉起到了緩沖鹽的作用，但當(dāng)添加過量緩沖鹽時，又會導(dǎo)致主藥聚集，降低制劑的物理穩(wěn)定性。香精的選用也會影響到制劑的 pH 穩(wěn)定性。

Fig. 4 X-ray diffraction spectra of NYS (A), self-made preparation (B) and commercial preparation (C) 圖4 制霉菌素原料藥（A）、自制制劑（B）和市售制劑（C）的XRD圖譜

Table 5 Test results of long-term stability of nystatin suspension表5 制霉菌素混懸劑長期穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3.2 制霉菌素晶體的成長

NYS 原料藥的粒徑較小，但在混懸劑體系中，原料藥有增長的趨勢并形成針狀結(jié)晶，在室溫1 個月內(nèi)即可達(dá)到 50 μm 左右，與市售制劑相同，之后不再變化。晶體成長過程中，pH 值，沉降體積比，含量等均無明顯變化，制劑穩(wěn)定性良好。成長之后的 NYS 晶體與原料藥具有相同的晶型和性質(zhì)。這些針狀結(jié)晶在混懸劑中能夠形成穩(wěn)定的架橋結(jié)構(gòu)，避免聚結(jié)影響制劑的物理穩(wěn)定性。NYS 晶體成長的機制有待下一步研究。

3.3 含量檢測方法

NYS 作為抗生素常用含量測定法為效價測定法，通過管碟法測量抑菌圈直徑衡量抑菌效果。該方法不能提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，且費時。因此參考 Phyllis Wilson 等人的方法，建立了高效液相色譜法來測定制劑含量的含量。驗證表明，上述方法都滿足檢測要求，并且有省時省力、簡單易行的優(yōu)點。

3.4 穩(wěn)定性試驗考察

穩(wěn)定性考察中，重點選擇了性狀、pH 值和含量作為考察重點，其中影響因素試驗為處方調(diào)整提供了支持，同時對產(chǎn)品的貯存和有效期的制定提供了依據(jù)。

長期穩(wěn)定性試驗為產(chǎn)品的有效期提供了參考依據(jù)和數(shù)據(jù)。長期留樣數(shù)據(jù)表明制劑在 12 個月內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4 結(jié)論

成功制備了制霉菌素混懸劑，該制劑工藝簡單，藥物回收率高且批次間差異小。該制劑掩味效果好，能夠提高患者，尤其是嬰幼兒的順應(yīng)性。長期留樣實驗結(jié)果說明，該制劑具有良好的穩(wěn)定性，有繼續(xù)研究開發(fā)的必要和價值。