微藻對抗生素的毒性響應及去除作用

李雅琪，秦海天，黃 河

（長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州 434023）

據(jù)統(tǒng)計，中國是抗生素產(chǎn)量及用量最多的國家［1］，2013 年在環(huán)境中檢出的 36 種常用抗生素在中國的總消費約為16.2 萬t，約是世界第二大抗生素消費國美國的9 倍［2］?？股氐氖褂脼楝F(xiàn)代醫(yī)療和規(guī)模化禽畜養(yǎng)殖做出了巨大的貢獻，但是抗生素的長期大量使用甚至濫用帶來的危害不容小覷。低濃度抗生素持續(xù)暴露會使很多細菌包括人類病原體在內(nèi)的致病菌產(chǎn)生抗藥性［3，4］，增強某些微生物的免疫力，改變微生物群落的組成和活性［5］。大量細菌產(chǎn)生抗藥性將會對人類和現(xiàn)代醫(yī)學構成一定的威脅［6］，可能使人類走到“無藥可醫(yī)”的地步，因此抗生素污染問題已經(jīng)引起國際廣泛的關注［7］。

水中抗生素來源主要有醫(yī)院廢水、城市生活污水、工業(yè)廢水和農(nóng)業(yè)廢水［8-10］。禽畜糞便作為肥料直接或間接施用于農(nóng)田，是土壤抗生素的重要來源［8，11］。目前常用的污水處理技術并不能將抗生素有效去除［8，12，13］，導致城市污水處理廠、禽畜養(yǎng)殖場、醫(yī)院廢水出水仍有抗生素殘留，甚至殘留濃度較高。有一些新型的污水處理技術可用于去除污水中的抗生素［14，15］，但應用成本高、帶來的二次污染和有機物礦化等問題限制了其大規(guī)模使用。因此，需要一種成本低、污染小、環(huán)境友好型的方法來去除污水中的抗生素。

藻是混合營養(yǎng)型生物，可以利用太陽能、空氣中的CO2、污水中的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖，也可以根據(jù)環(huán)境中碳源和營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性在自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種營養(yǎng)模式間轉換，大大提高了微藻在極端環(huán)境中生存和繁殖的能力，相較于其他生物，藻類克服了在生長繁殖和降解污染物時受碳和營養(yǎng)物質(zhì)限制的問題。微藻普遍具有繁殖速度快、容易獲得的特點［16］，使基于藻類的水處理技術脫穎而出，受到水處理領域的廣泛關注［17-22］。藻的生長過程是一個固碳的過程，藻類本身是一種可再生的生物能源，通過光合作用，可將空氣中的二氧化碳和水體中的營養(yǎng)物質(zhì)轉化成油脂，其含量可達細胞干重的30%～70%，收獲后的藻類可用于生物質(zhì)能領域［17，21-27］。此外還在化妝品［28-30］、水產(chǎn)養(yǎng)殖［30］、食品飼料［29-33］、醫(yī)療保健［28，29，32］等領域也有潛在的應用價值。所以，與傳統(tǒng)的污水處理技術相比，基于藻類的水處理技術是環(huán)境友好型的，滿足可持續(xù)發(fā)展的要求。

微藻去除廢水中的營養(yǎng)元素是近年來研究的熱點。氮、磷是組成細胞的重要元素，蛋白質(zhì)、酶、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）和遺傳物質(zhì)等都含有大量的營養(yǎng)元素，這是藻類利用氮、磷營養(yǎng)元素的基礎。藻類去除氮、磷有直接和間接兩種方式，直接方式為合成細胞物質(zhì)，見下式［34］。

從原水中分離出的藻類可以對未經(jīng)稀釋的廢水中的無機營養(yǎng)物質(zhì)達到很好的處理效果，如Wen等［35］從養(yǎng)豬廢水中分離出的名為MBFJNU-1 的小球藻，處理廢水12 d，TN 和TP 的去除率分別可以達90.51% 和 91.54%；Qu 等［36］用從豬場附近的河流中分離出的Parachlorella kessleriQWY28，在 30 ℃、光照強度為600 μmol/（m2·s）、CO2濃度為2.5%的條件下，對未經(jīng)稀釋、未經(jīng)滅菌的養(yǎng)豬廢水的TN 和TP 去除率分別為95%和接近100%，碳氫化合物的產(chǎn)量達646 mg/（L·d）；程海翔［37］用分離出的柵藻處理未滅菌的養(yǎng)豬廢水時，氨氮、總磷的去除率分別為99.2%、54.3%，而且藻細胞總脂含量為12.1%～14.6%，脂肪酸成分中以C16-C18 含量為主，占總脂肪酸含量的70.7%，適合作為生物柴油生產(chǎn)原料；Luo 等［38］在當?shù)爻靥练蛛x出Coelastrellasp.QY01，其對養(yǎng)豬廢水中的NH3-N、TP 和碳水化合物的去除率分別達100%、100%和78%，油脂產(chǎn)率最高為24.8%。除營養(yǎng)物質(zhì)外，廢水中存在的許多有毒有害污染物都可以用藻類或菌藻體系通過表面吸附、生物積累和沉淀等作用去除，如重金屬［21］、抗生素、多溴聯(lián)苯、激素、農(nóng)藥等［16，39］。

由于抗生素污染的出現(xiàn)和微藻污水處理技術的優(yōu)點，近幾年藻類去除環(huán)境中的抗生素已受到人們的關注。本研究對近年來抗生素對藻類的毒性作用、藻類去除抗生素的影響因素及其去除機理等方面的研究進展進行綜述，以期對藻類的綜合利用提供參考。

1 抗生素對藻類的毒性作用

原核生物起源于半自主性細胞器如葉綠體和線粒體［40］，所以藻類作為真核生物雖然不是抗生素的既定目標，但抗生素仍可以通過抑制葉綠體的新陳代謝，如蛋白質(zhì)的合成和光合作用，來抑制藻細胞的生長［40，41］?？股貙υ孱惖亩拘孕饕幸韵聨追N。

1）抑制微藻生長、繁殖。20～80 mg/L 的氧氟沙星會抑制Scenedesmus obliquus細胞的生長，最大降幅為 25.52%［42］。環(huán)丙沙星在 40～100 mg/L 時會對Chlamydomonas mexicana的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用［43］，在 25 mg/L 時會顯著抑制Pseudokirchneriella subcapitata的生長［44］。

2）改變藻細胞的結構。細胞結構的完整性是細胞完成生命活動的必要條件，細胞膜在維持細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定、參與外界環(huán)境的物質(zhì)交換和信息傳遞等方面發(fā)揮重要作用。暴露在5 mg/L 的四環(huán)素及其降解產(chǎn)物下的小球藻（Chlorella vulgaris）細胞膜的通透性會增大，透射電鏡結果顯示，細胞會出現(xiàn)不同程度的質(zhì)壁分離，細胞內(nèi)淀粉顆粒脫落，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的可能是細胞膜降解產(chǎn)物的絮狀物質(zhì)，還會導致藻細胞核電子密度下降、類囊體、葉綠體縮小變形等。類囊體損傷表明光合酶系統(tǒng)受到影響，能量轉換不能順利進行，光合作用受阻［45］。

3）影響微藻細胞光合色素的合成。許多抗生素是光合作用抑制劑，可以阻斷光合酶系統(tǒng)的電子傳遞鏈［40］。葉綠素與光能合成密切相關，包括光的采集、能量傳遞和光能的轉換，藻類生長受到抑制往往與有毒化合物影響葉綠素的合成有關［46］。當Chlorella vulgaris暴露于 50 mg/L 的諾氟沙星，第 7 天其葉綠素a 的合成受到明顯的抑制［47］；克拉霉素脅迫下，Chlorella vulgaris的細胞色素含量會顯著下降［48］；Moro 等［49］也證實了土霉素會導致光合色素數(shù)量減少、葉綠體超微結構紊亂。但有報道指出，當用低濃度抗生素處理時，微藻內(nèi)葉綠素含量反而會增加，只有在高濃度作用下才會減少，呈低濃度促進、高濃度抑制的現(xiàn)象。如當暴露于60 mg/L和100 mg/L的環(huán) 丙沙星 11 d 后，Chlamydomonas mexicana的葉綠素含量分別增加了38%和19%［43］；較低濃度的左氟沙星暴露使微囊藻（Microcystis flos-aquae）葉綠素含量顯著增加，高濃度作用則會使Microcystis flosaquae的葉綠素含量降低［50］；當暴露于 10 mg/L 的氧氟沙星時，Scenedesmus obliquus的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量會增加，但當氧氟沙星濃度為20～320 mg/L 時，細胞色素含量會顯著下降［42］。

4）對微藻造成氧化損傷。植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除在正常條件下保持著動態(tài)平衡，但當環(huán)境污染物濃度發(fā)生變化時，會產(chǎn)生過量的ROS，包括超氧化物自由基（·O2-）、羥基自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2），對藻細胞造成氧化損傷［43］。藻類有一套完整的抗氧化酶系統(tǒng)，在環(huán)境發(fā)生變化時，保護藻細胞免受氧化損傷［51］。活性氧（ROS）的去除受酶促抗氧化劑和非酶促抗氧化劑調(diào)節(jié)。酶促抗氧化劑有過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）-過氧化物酶和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中涉及的酶，非酶促抗氧化劑有抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽［40］。SOD 的活性隨著環(huán)丙沙星濃度的增加而顯著增強，當暴露在濃度為60 mg/L 和100 mg/L的環(huán)丙沙星11 d 時，SOD 活性最強，分別為對照組的3 倍和 8.5 倍［43］。在紅霉素濃度為 0.3 mg/L 時，Pseudokirchneriella subcapitata的總抗壞血酸和總谷胱甘肽的含量降低了47.8%和64.8%，說明紅霉素會干擾 AsA 和 GSH 的生物合成［40］，當抗氧化劑的活性或抗氧化反應不足以抵消ROS 的積累時，會對微藻造成氧化損傷［52］。表1 列出了抑制半數(shù)藻類生理活性的抗生素濃度。

表1 抗生素對不同微藻的生態(tài)毒理學效應

抗生素對藻類和其他水生生物的毒性已被廣泛研究［8，10，50］。有研究結果表明，抗菌蛋白合成抑制劑如阿奇霉素、強力霉素、氟苯尼考和土霉素等對藻類有明顯的的毒性作用，而細胞壁合成抑制劑如頭孢噻肟、阿莫西林等對藻類的毒性作用較低［58］。

2 藻類去除抗生素的影響因素

2.1 藻種及抗生素種類的影響

抗生素的去除率很大程度上與藻種的選擇有關。不同的微藻對抗生素的敏感性不同（表1）、去除效率也不同（表2），因此在藻種的選擇上，應綜合選擇對目標抗生素不敏感、耐受性好且降解效果良好的優(yōu)勢藻種。Adrian 等［59］研究了 4 種微藻對 9 種抗生素的降解。結果表明，當目標抗生素為大環(huán)內(nèi)酯類時，Chlamydamonas reinhardtii和Chlorella sorokiniana會有更好的去除效果；而當目標抗生素為磺胺嘧啶時，Chlamydamonas reinhardtii是惟一能生物轉化該抗生素的微藻。大多數(shù)研究表明β-內(nèi)酰胺類抗生素對綠藻幾乎沒有毒性，其對微藻的EC50值大于 1 g/L［56，44］。微藻和浮萍對磺胺甲惡唑、四環(huán)素、土霉素的敏感性相差無幾，但暴露于氧氟沙星和環(huán)丙沙星時，浮萍比綠藻更敏感，氧氟沙星和環(huán)丙沙星對Lemna minor的EC50分別為 0.1 mg/L 和 0.7 mg/L［10，57］，而 對Pseudokirchneriella subcapitata的EC50分 別 為1.1 mg/L 和 1.4 mg/L［8，54］。

表2 不同微藻對抗生素的去除率及其去除條件和去除機理

2.2 環(huán)境條件的影響

當廢水環(huán)境發(fā)生變化時，微藻對抗生素的去除效果也會發(fā)生改變。①營養(yǎng)元素改變。通過添加有機底物或無機物增加碳源可以增加抗生素的去除效率，或外加可以作為電子供體的碳源（NADH 再生的必要條件）與微藻協(xié)同代謝非生長所需的底物。如Xiong 等［43］在含環(huán)丙沙星的廢水中加入了 4 g/L 的醋酸鈉，顯著提高了Chlamydomonas Mexicana對環(huán)丙沙星的去除效率（是純藻去除的3 倍）；Zhang 等［62］添加NaHCO3可使頭孢呋辛鈉24 h 的去除率從10.21%提高到92.89%。②水體的含鹽量改變。如只有在海水中生長的Dunaliella tertiolecta對氟喹諾酮類抗生素的去除率比無藻組高，原因是鹽含量上升會提高抗生素的光解效率［59］；隨著廢水中鹽濃度的增加，Scenedesmus obliquus和Chlorella vulgaris對左氧氟沙星的去除率也在不斷增加［51，55］。③pH 的影響。當pH 在4～11 變化時，微藻對頭孢菌素抗生素7-ACA 的去除率先上升后下降，但是當 pH 在 7～8 時，去除率未見明顯變化，一般來說，當環(huán)境適宜微藻生長時有助于抗生素的去除［63］。④抗生素濃度的影響。在氧氟沙星濃度為10 mg/L 時，Scenedesmus obliquus可以將其去除，但當氧氟沙星濃度升高到20～320 mg/L 時，去除效果受到限制［42］。⑤藻生物量的影響。當藻生物量達到一定濃度后，降解率會隨著藻生物量的增多而降低，因為過多的藻會擋住光線，出現(xiàn)光屏蔽效應［64］。⑥光照的影響。光照強度會影響藻類的光合作用速率從而影響藻類的生命活動，藻類都有其最適宜的光照強度［65］。此外，光照周期、光源的選擇都會對抗生素的降解帶來影響。Tian 等［66，67］認為光照可以促進藻類產(chǎn)胞外有機物（EOMs）從而促進抗生素的降解。

3 藻類去除抗生素的過程和機理

3.1 生物吸附

藻細胞中存在纖維素、幾丁質(zhì)、藻酸鹽、多糖等多囊物質(zhì)，且藻可以分泌胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS），胞外聚合物主要由多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)組成［68］。這些化學成分為重金屬和有機污染物的吸附提供了場所［69，70］。藻類可以作為生物吸附劑［71］。吸附效率由抗生素的親水性能、結構特點和微藻的細胞大小、比表面積和表面性質(zhì)等來決定［63］。

微藻對抗生素的吸附速度很快，不到10 min 便可以吸附飽和，研究表明，吸附是Chlorellasp. Cha-01、Chlamydomonassp. Tai-03、Mychonastessp. YL-02 去除 7-ACA 的主要途徑［63］；可電離藥物的吸附比較復雜，帶正電荷的藥物可以通過靜電相互作用吸附在帶負電荷的微藻表面［72］。微藻對酸性藥物的吸附性一般較弱，尤其是當水的pH 有利于脫質(zhì)子時［73］，藻類光合作用引起pH 升高會降低對酸性藥物的吸附。另外，藻類生物膜中的金屬離子可以為兩性離子提供吸附位點，增加吸附性，如氟喹諾酮類和四環(huán)素類以兩性形式存在的抗生素［74，75］。

吸附的過程僅是將抗生素從廢水中轉移到藻類或者藻-菌表面，而不是分解它們，Chen 等［63］的研究指出，15 min 后，藻類就會解吸7-ACA，所以僅生物吸附處理抗生素仍然會對水環(huán)境構成威脅。有研究用海藻酸鈉等包埋材料對微藻做適當處理，以避免吸附質(zhì)的釋放，但包埋材料的成本和污染問題仍需考慮。

3.2 生物積累

正辛醇-水分配系數(shù)低的污染物（logKow＜5）可以被水生生物吸收和積累，而分配系數(shù)高的污染物會分配到細胞的脂質(zhì)膜中，隨食物鏈被生物放大［76］。抗生素的 logKow普遍小于 5［58，77-80］，因此微藻可以通過吸附、生物積累去除廢水中的抗生素。

吸附是細胞外的生物過程，而生物積累是細胞內(nèi)的一個過程［81］。生物積累是甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲惡唑和強力霉素去除的主要生物途徑［80，82］。此過程可以看成生物降解的一個前步驟，生物積累和生物降解結合能有效降解抗生素。如左氧氟沙星先被Chlorella vulgaris積累后由生物降解去除［51］；磺胺甲嘧啶先在Chlorella pyrenoidosa內(nèi)積累再被降解去除［61］。但不是所有抗生素的去除都會經(jīng)過這一步驟，磺胺類藥物和洛美沙星就不會在試驗的4 種藻內(nèi)積累［77］。生物積累是抗生素穿過細胞膜，然后可能被細胞吸收實現(xiàn)的，并不是所有的微藻積累了抗生素后還會繼續(xù)降解抗生素。其可能會繼續(xù)留在微藻細胞內(nèi)，并通過食物鏈進一步積累和生物放大，最終對人類帶來影響。

3.3 生物降解

微藻可以通過降解將復雜的母體化合物分解成簡單的小分子。生物降解是微藻去除污水中有機污染物最有效的途徑，其主要反應是酶促反應［16］。所以，相對于吸附、富集和其他非生物因素，生物降解是去除溶解性抗生素的主要機制［77］。

藻類含有代謝多種外源物質(zhì)的酶，其代謝過程可分為3 個階段［83］。第一階段為Ⅰ相代謝，Ⅰ相代謝通過氧化、還原或水解反應，添加極性基團（如羧基、羥基等），使脂溶性外源化合物轉化為親水性的復合物。細胞色素P450 是I 相代謝的主要酶系，是分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上的一類亞鐵血紅素，參與催化解毒的初級代謝過程［84］。第二階段為Ⅱ相代謝，是在Ⅰ相代謝的基礎上再引入強酸基團，使有毒化合物某些官能團失活，促使化合物水溶性增加，使其更易排出體外。Ⅱ相反應是一種解毒反應。如乙?；D移酶可以催化芳香胺類物質(zhì)（苯胺、磺胺等）與來自乙酰輔酶A 的乙?；Y合，形成乙?；衔?；谷胱甘肽-S-轉移酶能催化還原性谷胱甘肽（GSH）與一些鹵化有機物、環(huán)氧化物等結合，降低此類化合物的毒性，對機體起保護作用。Ⅱ相酶偶聯(lián)可以打開環(huán)氧化物的環(huán)，以保護氧化損傷［16］。在可以進行光合作用的生物體中，第三階段為外源物質(zhì)在液泡或細胞壁部分的分離［85，86］。藻類對外源物質(zhì)的解毒能力與哺乳動物的肝臟相似，因此藻類被認為是環(huán)境污染物解毒的綠色肝臟［83］。

Xiong 等［55］研究表明Scenedesmus obliquus對左氧氟沙星的生物轉化主要包括脫羧、側鏈斷裂、去甲基化和開環(huán)；磺胺嘧啶的降解途徑有水解、甲基化、氯取代，磺胺甲惡唑的降解過程包括硝化、脫氯、甲基化；大環(huán)類脂類生物降解途徑為水解、脫水、去甲基化、氯化等［59］；甲砜霉素降解途徑有氯取代、氧化反應、脫水、側鏈斷裂、羥基化［87］。圖 1 中列出了微藻降解抗生素時所涉及到的反應，主要包括水解［59］、去甲基化［59］、脫羧反應［55］、脫羥基［55］、開環(huán)［55］、羥基化［53］、脫氨基［53］、亞硝化［53］、氯化［87］、氯取代［87］。

圖1 微藻用于抗生素生物降解涉及到的反應

應該注意，有的微藻污水處理系統(tǒng)中并不是生物降解占主導作用，有些對光敏感的抗生素，如喹諾酮類（氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星），光解作用更明顯，加入藻之后降解效率反而下降，原因可能是藻類產(chǎn)生了光屏蔽效應，阻止了光線的照入［59］。因此在選擇研究對象時，應周全考慮所有因素的影響。

4 展望

藻類去除污水中的抗生素還處于探索階段，未來還需要做很多工作。①藻類去除抗生素的機理，特別是其中間及最終產(chǎn)物的確定及其毒性還有待進一步探究；②藻類去除污水中抗生素的潛力還需要通過應用在實際廢水中進行評估；③微藻的收獲方式及后續(xù)處理或應用，以及其是否還會釋放出毒性還需要繼續(xù)研究。