從江田魚腸道微生物多樣性分析

李小義，申曉東，張效平，楊 星，關(guān) 梅，王 雪

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所/貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴陽 550025）

腸道微生物的組成對維持宿主生理和代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，同時與宿主神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能有直接關(guān)聯(lián)［1-4］。人類胃腸道中有1×103～1×104種微生物，是人體細胞數(shù)量的10 倍，因此，腸道微生物常被稱為遺忘的器官［5］。腸道微生物有外源和原生群體的區(qū)別，二者均與胃腸道消化相關(guān)，但外源微生物具有游離、暫時性的特征，原生微生物則是定植在消化道表面的核心群落，并對外來微生物在腸道表面定植有抵抗作用［6-8］。腸道微生物由真菌、酵母菌、病毒、細菌及古細菌等多種成員構(gòu)成，其中，細菌是組成腸道微生物的主要區(qū)系。鑒于腸道細菌對宿主健康的重要影響，近年來，腸道細菌的多樣性、功能及作用機制成為生物學(xué)研究的熱點。

魚類與其周圍環(huán)境及微生物具有獨特的緊密關(guān)系，可能是互惠的，也可能是有害的。因生活史、生態(tài)和環(huán)境因素的不同，魚類腸道細菌的組成在物種和個體之間有很大的差異。占主導(dǎo)地位的非洲慈鯛雄魚腸道微生物中益生菌豐度高，而從屬雄魚腸道微生物中病原菌豐度高，同時占主導(dǎo)地位的雄魚Alpha 多樣性也高于從屬雄魚，表明腸道細菌多樣性受群體地位影響［9］。鯉科（Cyprinidae）魚的4 個亞科魚類腸道微生物多樣性分析表明，同亞科的魚腸道菌群相似性較高，而不同亞科的魚腸道菌群差異較大［10］。喂食不同濃度殼聚糖，虹鱒魚（Oncorhynchusmykiss）腸道菌群多樣性、優(yōu)勢菌種類及虹鱒魚對嗜水氣單胞菌抗感染能力均有差異，表明虹鱒魚腸道菌受飼料成分的影響［11］。與健康卵形鯧鲹（pompano）腸道菌比較，患病魚腸道菌種類減少，疑似病原菌黑?；【鄬ωS度由健康魚腸道中的17.19% 上升到 54.53%［12］。

稻田養(yǎng)魚在中國有著悠久的歷史，《魏武四時公制》中記載：“郫縣子魚黃鱗赤尾，出稻田，可以為醬”，表明早在1 700 年前的三國時代，中國就已經(jīng)有稻田養(yǎng)魚這一養(yǎng)殖模式。2011 年，貴州從江稻魚鴨系統(tǒng)入選全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)保護試點地。2013年，從江稻魚鴨系統(tǒng)入選第一批中國重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)。相較于池塘和其他水域環(huán)境，稻田養(yǎng)殖環(huán)境不穩(wěn)定，易受水稻栽培過程水體深度、溫度、水稻遮蔽、田內(nèi)食物種類和數(shù)量等的影響［13-15］。因此，稻田養(yǎng)殖鯉魚（Cyprinus carpio）與池塘養(yǎng)殖鯉魚腸道細菌種類、豐度均存在差異。本研究分別采集稻田養(yǎng)殖不同時間的從江田魚樣品，解剖取其腸道，對其腸道細菌的多樣性進行測序分析，旨在了解稻田養(yǎng)殖鯉魚腸道細菌多樣性，為益生菌飼料開發(fā)研究、病原菌防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年 6 月、8 月和 11 月，分別從貴州省從江縣稻魚鴨養(yǎng)殖田采集田魚，每次15 尾。

1.2 田魚腸道取樣

迅速帶回實驗室，在超凈臺中對田魚進行解剖取樣。用75%乙醇對田魚體表消毒后用解剖剪沿肛門朝前對魚進行解剖。清理出腸道，用75%乙醇擦拭消化道外壁，取樣時清洗腸道內(nèi)容物，只取腸道，用無菌 PBS 緩沖液沖洗 3 次，每 5 尾 1 個組，每個取樣時間點3個重復(fù)。6月采集的田魚為剛放入稻田1 d 的魚，樣品名稱編號為RS1；8 月采集的田魚在稻田中飼養(yǎng)了2 個月，樣品名稱編號為RS2；11 月采集的田魚在稻田中飼養(yǎng)了5個月，樣品名稱編號為RS3。

1.3 腸道微生物DNA 提取

采用CTAB 方法對樣本的基因組DNA 進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，并將合格樣品干冰保存寄送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序分析。

1.4 16S rDNA 文庫構(gòu)建及多樣性分析

選 擇 細 菌 16S V4 區(qū)（515F：5′-GTGCCAGCM GCCGCG GTAA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），使用帶 Barcode 的特異引物為模板，進行PCR 擴增，樣品純化后構(gòu)建文庫，使用HiSeq2500 PE250 上機測序。根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列后使用FLASH（V1.2.7）對每個樣本的reads 進行拼接，得到的拼接序列為原始 Tags 數(shù)據(jù)（Raw tags）；參照 Qiime（V1.9.1）的 Tags質(zhì)量控制流程，進行Tags 截取、Tags 長度過濾等處理，得到的Tags 序列通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）對所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為 OTUs（Operational taxonomic units），同時選取OTUs 的代表性序列。對OTUs 序列進行物種注釋，用Mothur 方法與SILVA132 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE（Version 3.8.31）軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs 代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對各樣本的數(shù)據(jù)進行均一化處理，以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進行均一化處理，后續(xù)的Alpha 多樣性分析和Beta 多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌16S rRNA 基因測序結(jié)果分析

基于Illumina HiSeq 測序平臺測序，構(gòu)建PCR-free 文庫，然后進行雙末端（Paired-End）測序。通過對Reads 進行拼接，平均每個樣品測得88 800 條Tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到80 958 條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量為73 339，質(zhì)控有效率達82.59%。以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs，共得到3 699 個 OTUs。其中 RS1、RS2 和 RS3 組分別獲得1 336、483、3 193 個 OTUs。對 OTUs 序列與 Silva132數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，注釋結(jié)果中，共有1 607（43.44%）個OTUs 注釋到屬水平。其他多樣性指數(shù)如表1 所示。3 個樣品組的覆蓋率均大于99.9%，表明本次檢測結(jié)果具有較好的覆蓋性。

表1 基于16S rRNA 基因序列的細菌多樣性指數(shù)

圖1 為蜜蜂群圖，圖1a 為所有樣本不同組別間物種總數(shù)的散點分布，即豐富度；圖1b 為Shannon 指數(shù)的比較，反映不同樣本間物種多樣性和均一性的差別。通過Wilcoxon 秩和檢驗，發(fā)現(xiàn)測得的物種數(shù)在 RS2-RS3、RS1-RS2、RS1-RS3 兩兩組間具有顯著差異（P＜0.05），顯著性P分別為 0.000 3、0.010 4、0.010 4。Shannon 指數(shù)在 RS2-RS3、RS1-RS2 兩兩組間具有顯著差異（P＜0.05），顯著性P分別為0.019 0、0.025 4。Shannon 指數(shù)在RS1-RS3 2 組間不具有顯著差異（P＞0.05），P為0.827 6。結(jié)果表明，鯉魚在稻田里養(yǎng)殖的不同時間點，腸道微生物群落組成存在差異，RS1 組和RS3 組樣本微生物菌群多樣性高于RS2 組。

圖1 樣本組間多樣性差異

2.2 細菌多樣性分析

田鯉魚腸道微生物組成門水平分析結(jié)果如圖2所示。由圖2 可知，3 組樣品腸道微生物優(yōu)勢菌門差異較大。RS1 組樣品中厚壁菌門（Firmicutes）、藍細菌（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢菌，所占豐度分別為33.43%、28.15%、22.94%和9.79%。RS2 組樣品中的優(yōu)勢菌門為變形菌門，所占豐度為94.05%，其次為厚壁菌門（2.58%）、梭桿菌門（Fusobacteria，2.05%）和放線菌門（Actinobacteria，0.68%）。RS3 組樣品中優(yōu)勢菌門為藍細菌（40.69%）、變形菌門（31.65%）、梭桿菌門（10.30%）和厚壁菌門（8.89%）。

圖2 樣本門水平上的物種相對豐度

屬水平分析（圖3），RS1 組和RS3 組樣品微生物種類較RS2 組豐富。RS2 組樣品相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬有2 種，其中，氣單胞菌屬（Aeromonas）相對豐度最高，為68.86%；其次是鯨桿菌屬（Cetobacterium，1.46%）。RS1 組微生物多樣性較高，相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬有9 種，依次為未分類的藍藻細菌（unidentifiedCyanobacteria，28.11%）、Romboutsia（13.33%）、未分類的梭菌屬（unidentifiedClostridiales，8.37%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，4.62%）、Paeniclostridium（2.34%）、葉桿菌屬（Phyllobacterium，2.15%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，1.60%）、螺桿菌屬（Helicobacter，1.11%）、Turicibacter（1.07%）。RS3 組相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌有5 種，未分類的藍藻細菌相對豐度最高，為40.63%；其次是氣單胞菌屬（12.41%）、鯨桿菌屬（10.20%）、未分類的梭菌屬（2.07%）和鏈球菌屬（Streptococcus，1.44%）。

圖3 樣本屬水平上的物種相對豐度

3 討論

魚類腸道細菌研究可追溯至20 世紀(jì)上半葉。1927 年，Reed 等［16］對 34 尾黑線鱈魚［Melanogrammusaeglefinus（Linnaeus，1758）］的腸道菌進行了培養(yǎng)分離，獲得的菌株主要包括變形桿菌、假單胞菌、無色桿菌、黃桿菌、芽孢桿菌等菌屬。最初，研究者認為魚類腸道細菌主要來自周圍環(huán)境或者食物中，且細菌數(shù)量較少［17，18］。但這僅是基于可培養(yǎng)研究得出的結(jié)論，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們對魚類腸道細菌的認識逐漸增加。門水平分析，轉(zhuǎn)基因鯉魚腸道中厚壁菌門細菌較多，對照鯉魚腸道中擬桿菌門細菌較多［19］?；诳膳囵B(yǎng)菌和RT-PCR-DGGE分析，喂食含有β-葡聚糖的飼料組鯉魚腸道中腐敗希瓦氏菌和弧菌含量少于對照組，表明有益的飼料成分有助于防止病原微生物的入侵［20］。門水平分析，冷水性鯉魚腸道微生物以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主［21］。

本研究采集了稻田養(yǎng)殖不同時間點的田鯉魚，對其腸道細菌多樣性進行了高通量測序研究，為了解不同養(yǎng)殖環(huán)境鯉魚腸道微生物組成提供了數(shù)據(jù)支持。門水平分析可知，稻田養(yǎng)殖不同時間點鯉魚腸道的主要優(yōu)勢菌種類和相對豐度均有差異，可能與不同養(yǎng)殖階段，稻田可食用餌料種類不同有關(guān)。RS3 組魚樣采集階段，水稻已收割，田魚主要以浮游藻類為餌料，所以田鯉魚腸道中，藍細菌相對豐度最高。屬水平分析可知，RS1 組田魚腸道優(yōu)勢菌屬較RS2 和RS3 組豐富，可能是受池塘和稻田養(yǎng)殖環(huán)境差異影響。