高效液相色譜法測(cè)定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量

張 娟，朱海榮，董 茜，劉 爽，鄒惠玲，張開亮，蘇本玉

(1.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 山東濟(jì)南 250100；2.上?；ぱ芯吭河邢薰?上海 200062)

吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸是常用的植物生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥，同時(shí)也是植物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源生長素，屬吲哚類化合物。吲哚-3-乙酸對(duì)植物抽枝或芽、苗等的頂部芽端形成有促進(jìn)作用。吲哚丁酸是植物主根生長促進(jìn)劑，常用于木本和草本植物的浸根移栽、硬枝扦插，能加速根的生長[1]，提高植物生根的百分率，也可用于植物種子的浸種和拌種，可提高發(fā)芽率和成活率。我國相關(guān)法規(guī)規(guī)定，含有農(nóng)藥成分的肥料產(chǎn)品必須以農(nóng)藥產(chǎn)品的登記方式進(jìn)行登記，但由于農(nóng)藥產(chǎn)品登記周期長、費(fèi)用高，一些不法廠商為了謀取不正當(dāng)利益，在肥料中違禁添加吲哚-3-乙酸或吲哚丁酸，以突顯所謂“肥效”。此種做法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、生態(tài)環(huán)境以及人體健康造成潛在威脅。因此，建立準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好的測(cè)定肥料產(chǎn)品中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸含量的方法非常必要。

目前測(cè)定植物生長調(diào)節(jié)劑的方法主要有生物鑒定法、免疫檢測(cè)法、光譜法[2-4]、色譜法[包括氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(簡稱液質(zhì)聯(lián)用法)[7]等]，其中測(cè)定吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的主要方法為液相色譜法[8-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[10-14]等。與液質(zhì)聯(lián)用法相比，液相色譜法相對(duì)經(jīng)濟(jì)、快捷，本文建立了同時(shí)測(cè)定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的高效液相色譜法，可為肥料產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，帶二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜工作站，美國Agilent公司；Sigma 3-18K型高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；電子天平，瑞士Sartorius公司；SIR型漩渦混合器，德國IKA公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98.0%，美國Stanford Chemicals公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.000 1 g)的吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，配制成吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

甲醇為色譜純，美國Fisher公司；乙酸為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 儀器條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)或分離性能相當(dāng)?shù)纳V柱；檢測(cè)器：二極管陣列(PDA)檢測(cè)器；檢測(cè)波長：280 nm；流動(dòng)相：甲醇溶液(A)和體積分?jǐn)?shù)為2.0%的乙酸水溶液(B)，高效液相色譜梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10.0 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3 試驗(yàn)方法

稱取1.0 g肥料樣品(精確至0.000 1 g)，置于50 mL比色管中，加入20 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，在高速離心機(jī)中以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，全部上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別移取一系列吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)于7個(gè)容量瓶中，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照質(zhì)量濃度由低到高的順序測(cè)定，以吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的質(zhì)量濃度在1.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y=17.461 82x-8.312 23和y=14.619 64x-5.572 51，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7和0.999 8。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)器

PDA檢測(cè)器靈敏度高、檢出限低，對(duì)流速和溫度波動(dòng)不敏感，在波長190～490 nm內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)可獲得相應(yīng)的色譜圖。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸在200～400 nm范圍內(nèi)皆有一定的紫外吸收，因此試驗(yàn)選用PDA檢測(cè)器。

2.1.2 檢測(cè)波長

對(duì)50 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液從190～490 nm進(jìn)行全波段掃描，經(jīng)PDA檢測(cè)器掃描顯示，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸在波長210～290 nm內(nèi)有一定的吸收，但低波長下雜質(zhì)峰的干擾較大；在280 nm處，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸雜質(zhì)干擾較小，且皆具有較強(qiáng)的吸收峰。因此，試驗(yàn)選擇吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的檢測(cè)波長為280 nm。

2.2 流動(dòng)相

試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的甲酸水溶液以及甲醇-2.0%的乙酸水溶液等4種體系作為流動(dòng)相。結(jié)果顯示：在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%的甲酸水溶液等3種體系作為流動(dòng)相得到的譜圖中，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的吸收峰有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象；而在甲醇-2.0%的乙酸水溶液體系中的洗脫效果最好，吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的分離度良好且峰形尖銳，滿足試驗(yàn)要求。吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的典型色譜圖見圖1。

2.3 前處理方法

振蕩、渦旋和超聲是目前液固提取、液液提取較常用的手段，不同肥料樣品對(duì)提取液的親和性不同。為了提高樣品中吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的提取效果，試驗(yàn)在加入提取劑后，分別考察了振蕩、渦旋、超聲、振蕩后超聲及渦旋后超聲等5種提取方式，結(jié)果見表2。

圖1 吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的典型色譜圖

表2 不同提取方式對(duì)提取效果的影響

由表2可知：振蕩、渦旋、超聲等3種方式難以達(dá)到良好的提取效果；試驗(yàn)采用漩渦混合器均質(zhì)1 min，再超聲30 min使樣品充分浸潤分散，測(cè)試樣品的回收率為95.15%～99.25%，提取效果良好。

3 方法的驗(yàn)證

3.1 方法的靈敏度

基于實(shí)際空白樣品中添加吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分析結(jié)果，按信噪比為3對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算方法的檢出限，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的檢出限為5 mg/kg；按信噪比為10對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算方法的定量限，吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的定量限為10 mg/kg。

3.2 方法的精密度

對(duì)空白加標(biāo)樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，樣品加標(biāo)后試樣溶液的質(zhì)量濃度分別為20.00、50.00 mg/L，平行測(cè)定6次，計(jì)算精密度，結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%，說明本方法具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，可 滿足檢測(cè)要求。

表3 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.3 回收試驗(yàn)

選取6個(gè)實(shí)際肥料樣品，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，取測(cè)定結(jié)果的平均值作為本底值。在樣品中加入20.00 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，試驗(yàn)結(jié)果扣除本底值，剔除離群值后，分別計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均值和加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，肥料樣品中吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸的加標(biāo)回收率為91.46%～104.5%，表明方法的準(zhǔn)確度較高。

4 結(jié)語

本文建立的高效液相色譜法適用于同時(shí)測(cè)定肥料中吲哚-3-乙酸和吲哚丁酸的含量，線性范圍為1.0～100.0 mg/L，測(cè)定范圍寬，基質(zhì)干擾小，色譜分離效果好，檢出限為5 mg/kg，具有良好的精密度，回收率高，定量準(zhǔn)確。