時(shí)間延遲積分熒光顯微成像平場校正技術(shù)

常松濤，夏豪杰*

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 儀器科學(xué)與光電工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.測量理論與精密儀器安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

1 引 言

平場校正也稱為響應(yīng)非均勻性校正技術(shù)，是光學(xué)成像領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題，一般而言，紅外成像系統(tǒng)和一些對(duì)成像質(zhì)量要求較高的可見光系統(tǒng)需要進(jìn)行平場校正［1-3］。高通量TDI熒光顯微成像系統(tǒng)是一種對(duì)像質(zhì)要求極為苛刻的可見光系統(tǒng)，其應(yīng)用包括基因測序儀、切片熒光成像系統(tǒng)等［4-6］。高通量的實(shí)現(xiàn)途徑是大視場和高幀頻，要求全視場內(nèi)響應(yīng)度均勻，以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本熒光能量的定量測量和分析。然而，圖像傳感器、光學(xué)系統(tǒng)等都會(huì)導(dǎo)致視場內(nèi)的響應(yīng)非均勻性，使得熒光能量分布產(chǎn)生異常，為了保證后續(xù)處理結(jié)果中數(shù)據(jù)的有效率和準(zhǔn)確率，必須進(jìn)行平場校正［4，7-8］。

現(xiàn)有的非均勻性校正算法主要針對(duì)紅外成像領(lǐng)域，可以分為兩類：一是基于場景的非均勻性校正技術(shù)，二是基于定標(biāo)的非均勻性校正技術(shù)。前者校正精度低，不適用于高精度光學(xué)測量系統(tǒng)［8-10］。后者利用均勻校正源（或光源）進(jìn)行系統(tǒng)成像校正，使得視場內(nèi)各像素點(diǎn)獲得幾乎相同的響應(yīng)度。典型的校正方法有單點(diǎn)校正、兩點(diǎn)校正和多點(diǎn)校正［3，11］。目前，顯微成像系統(tǒng)的校正方法仍基于傳統(tǒng)兩點(diǎn)校正原理，采用LED、熒光板、熒光紙和熒光膜等均勻光源對(duì)系統(tǒng)響應(yīng)進(jìn)行校正［12-13］。高通量時(shí)間延遲積分（Time Delay Integration，TDI）熒光顯微成像系統(tǒng)基于激光誘導(dǎo)熒光成像原理，并且對(duì)響應(yīng)均勻性的要求較高［14-15］。上述校正方法和校正源存在明顯的缺陷，不適用于高通量TDI熒光顯微成像系統(tǒng)。例如，基于LED光源的校正方案沒有激光誘導(dǎo)熒光的成像過程，因此未考慮激光照明系統(tǒng)的非均勻性，也未考慮雜散光的影響，用于高通量TDI熒光顯微成像系統(tǒng)有原理上的缺陷。熒光板、熒光紙和熒光膜等受激熒光光源也作為校正源，其原理是激光照射熒光板等激發(fā)出熒光，再由成像系統(tǒng)收集獲得圖像。其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)照明非均勻性進(jìn)行了校正；但對(duì)于高分辨率（亞微米級(jí)）熒光成像系統(tǒng)而言，普通的熒光板、熒光紙和熒光膜等校準(zhǔn)源顆粒度明顯、均勻性不足且熒光易衰減。另外，因缺乏圖案類目標(biāo)，難以將校正源調(diào)節(jié)到物鏡最佳焦面處，校正效果較差。綜上，高性能、高通量的顯微成像系統(tǒng)對(duì)響應(yīng)均勻性的要求較高，并且系統(tǒng)基于激光誘導(dǎo)熒光成像原理，因此目前缺乏適用的校正源和校正方法。

為解決上述問題，本文將高通量基因測序常用的微陣列生物芯片作為標(biāo)定樣板，提出基于該樣板的高通量TDI熒光顯微成像系統(tǒng)校正方法。將校正參數(shù)分為高頻和低頻兩部分，利用微陣列芯片的宏觀均勻性（整體上分布均勻）計(jì)算低頻非均勻性校正系數(shù)，對(duì)相機(jī)單獨(dú)進(jìn)行兩點(diǎn)校正獲得高頻非均勻性校正系數(shù)。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)逐步驗(yàn)證并修正建立的系統(tǒng)響應(yīng)均勻性退化數(shù)學(xué)模型，利用現(xiàn)有的高通量TDI熒光顯微成像系統(tǒng)采集圖像，驗(yàn)證本文提出的校正方法的效果，形成整套校正方案。本文提出的平場校正方法能夠直接采用微陣列實(shí)現(xiàn)TDI熒光顯微成像系統(tǒng)的準(zhǔn)實(shí)時(shí)兩點(diǎn)校正，減小相機(jī)固定圖形噪聲、照明系統(tǒng)非均勻性、成像系統(tǒng)非均勻性對(duì)熒光圖像的影響。

2 TDI熒光顯微成像系統(tǒng)非均勻性來源及兩點(diǎn)校正原理

2.1 TDI熒光顯微成像系統(tǒng)響應(yīng)非均勻性來源

典型的TDI熒光顯微成像系統(tǒng)包含APO顯微物鏡、激光器、濾光片、管鏡、TDI相機(jī)和載物臺(tái)。按照來源可將熒光顯微成像系統(tǒng)的響應(yīng)非均勻性分為三類：（1）相機(jī)自身響應(yīng)非均勻性（Photo Response Nonuniformity，PRNU）；（2）激光照明系統(tǒng)導(dǎo)致的照明非均勻性；（3）成像系統(tǒng)導(dǎo)致的非均勻性。相機(jī)自身的平場校正主要由相機(jī)和圖像傳感器廠家執(zhí)行，但對(duì)于高性能相機(jī)，需要根據(jù)應(yīng)用環(huán)境重新校正，一般采用兩點(diǎn)非均勻性校正方法。照明非均勻性會(huì)受到激光光源、照明光學(xué)系統(tǒng)和顯微物鏡的共同影響，表現(xiàn)為生物芯片上激光照射不均勻，進(jìn)而受激輻射的熒光強(qiáng)度不均勻，從而影響成像均勻性。成像系統(tǒng)包含顯微物鏡、管鏡、濾光片和分光鏡等，導(dǎo)致非均勻性的因素較為復(fù)雜，也需要進(jìn)行校正。相機(jī)自身的非均勻性包含高頻量和低頻量，而激光照明、成像導(dǎo)致的非均勻性絕大部分為低頻量。

2.2 TDI成像兩點(diǎn)校正原理

TDI相機(jī)輸出為線列，非均勻性一般表現(xiàn)為條紋狀，對(duì)一維圖像進(jìn)行非均勻性校正即可，計(jì)算量及復(fù)雜度小于面陣相機(jī)。TDI成像系統(tǒng)的輸出灰度與成像目標(biāo)或均勻場景輻射亮度的關(guān)系為：

其中：j為掃描方向（也稱為積分方向、電荷轉(zhuǎn)移方向）的像素序號(hào)，i為非掃描方向的像素序號(hào)，Y i，j為 成 像 系 統(tǒng) 輸 出 圖 像 中(i，j)點(diǎn) 的 灰 度，Gi，j，O i，j，σi，j分別為響應(yīng)度、偏置和隨機(jī)噪聲，X為目標(biāo)或場景的輻射亮度。對(duì)掃描方向上H個(gè)像素求均值，以減小隨機(jī)時(shí)間噪聲的影響，得到：

兩點(diǎn)校正的目的是使得各探測元（像素）的響應(yīng)度一致，滿足式（3）。對(duì)于高性能圖像傳感器而言，像素響應(yīng)灰度與接收到的能量呈線性關(guān)系，即滿足線性響應(yīng)。因此兩點(diǎn)校正是較為普遍、效果較好的非均勻性校正方案，需要用到兩個(gè)亮度不同的均勻輻射場景，通常取亮度接近零的暗場和亮度約使得探測器灰度達(dá)到其上限50%的明場，亮度分別設(shè)為X(l)和X(h)，暗場通過光學(xué)系統(tǒng)封閉、暗室等方式實(shí)現(xiàn)，明場通過積分球、LED等光源均勻照射實(shí)現(xiàn)。由TDI成像系統(tǒng)響應(yīng)公式（2），得到：

目前，TDI熒光顯微成像系統(tǒng)的校正方法仍基于傳統(tǒng)兩點(diǎn)校正原理，采用LED、熒光板、熒光紙、熒光膜等均勻光源對(duì)系統(tǒng)響應(yīng)進(jìn)行校正。

3 基于微陣列生物芯片的校正方法

3.1 TDI熒光成像系統(tǒng)響應(yīng)均勻性退化模型

TDI熒光成像系統(tǒng)基于激光誘導(dǎo)熒光成像原理，激光經(jīng)照明光學(xué)系統(tǒng)整形后透過物鏡均勻投射到生物芯片上，生物芯片上的熒光分子受激發(fā)射熒光，熒光經(jīng)物鏡、管鏡收集后到達(dá)相機(jī)，得到圖像。根據(jù)上述過程建立生物芯片成像及光機(jī)系統(tǒng)響應(yīng)均勻性退化模型。設(shè)未校正的暗場圖像 為I(0)，(i，j)像素點(diǎn)灰 度為Y(0)i，j，為簡化校 正過程，暗場通過多層遮光實(shí)現(xiàn)，相機(jī)接收到的輻亮度幾乎為零。相機(jī)直接對(duì)明場采集圖像，得到：

其中：E i為i像素對(duì)應(yīng)的物方（芯片）區(qū)域接收到的激光強(qiáng)度，ηi為熒光分子的發(fā)光效率，Eˉ=為W個(gè)像素對(duì)應(yīng)物方區(qū)域激光強(qiáng)度的均值，為相應(yīng)位置熒光分子發(fā)光效率的均值。加入照明非均勻性后成像系統(tǒng)的響應(yīng)度為：

成像光學(xué)系統(tǒng)包括物鏡、濾光片、分光鏡和管鏡，導(dǎo)致非均勻性的因素包括畸變、漸暈、離焦和裝調(diào)角度誤差等，表現(xiàn)為中心視場的響應(yīng)度比邊緣視場略大，其非均勻性系數(shù)用k(3)i表示，那么響應(yīng)方程改寫為：

3.2 新校正方法的理論依據(jù)及校正源設(shè)計(jì)

TDI熒光顯微成像系統(tǒng)平場校正的難點(diǎn)是設(shè)計(jì)合適的校正源。原理上，響應(yīng)度非均勻性包括高頻量和低頻量，相機(jī)引起的非均勻性包含高頻和低頻，而成像光學(xué)系統(tǒng)、激光照明系統(tǒng)引起的非均勻性絕大部分是低頻量。本文將低頻和高頻量分步校正，采用傳統(tǒng)的兩點(diǎn)校正對(duì)相機(jī)自身的高頻和低頻非均勻性進(jìn)行校正，然后設(shè)計(jì)一種微陣列生物芯片（一種基因測序使用的非均勻熒光光源）來校正殘余的低頻非均勻性，校正結(jié)果疊加可以實(shí)現(xiàn)TDI熒光成像系統(tǒng)的響應(yīng)非均勻性校正。微陣列芯片如圖1所示，以光刻方式制備網(wǎng)格線，位置精度優(yōu)于±10 nm，網(wǎng)格處無熒光樣本，在熒光圖像中會(huì)形成暗線，作為TDI掃描方向調(diào)整的參考線。信號(hào)點(diǎn)能量在統(tǒng)計(jì)上是均勻的，采用多點(diǎn)累加的方式獲得各位置每個(gè)信號(hào)點(diǎn)的灰度。中心與邊緣的差異性由像差和漸暈等因素導(dǎo)致，可用于估算這些因素的影響，進(jìn)而校正響應(yīng)非均勻性。

圖1 微陣列生物芯片示意圖Fig.1 Schematic diagram of microarray biochip

利用信號(hào)點(diǎn)低頻的均勻性，對(duì)微陣列生物芯片圖像進(jìn)行低通濾波后獲取照明系統(tǒng)和成像系統(tǒng)導(dǎo)致的低頻非均勻性，即可實(shí)現(xiàn)TDI熒光成像系統(tǒng)的低頻非均勻性校正。

3.3 基于微陣列芯片的校正方法

在建立的系統(tǒng)響應(yīng)及均勻性退化數(shù)學(xué)模型的基礎(chǔ)上開展校正工作，實(shí)現(xiàn)此類特殊成像系統(tǒng)的平場校正。校正工作實(shí)際上是響應(yīng)均勻性退化模型的逆向推演。校正步驟如下：（1）采集暗場圖像I(0)，獲得相機(jī)自身FPN；（2）使用積分球光源或者LED光源照射相機(jī)，獲得均勻場景或者非均勻平滑場景，采集圖像I(1)；（3）TDI掃描成像采集微陣列生物芯片圖像I(2)；（4）經(jīng)過低通濾波、歸一化等處理后，平滑擬合獲得低頻校正系數(shù)，與相機(jī)自身校正獲得的高頻校正系數(shù)合并后獲得綜合性的增益、偏置校正系數(shù)。校正工作流程如圖2所示。

圖2 平場校正流程Fig.2 Flow chart of nonuniformity correction

微陣列生物芯片圖像減暗背景，得到：

相機(jī)自身校正時(shí)，去除高頻響應(yīng)度非均勻性。由于此處未引入照明非均勻性和成像光學(xué)系統(tǒng)的影響，僅能去除非均勻性中的高頻量和少量低頻量。高頻校正系數(shù)為：

高頻校正后的微陣列圖像為：

采用微陣列生物芯片成像，如圖3所示。為限制照明非均勻性中的高頻信息，可以使得激光照明（臨界照明方式）有一定離焦。圖3在掃描方向取均值，局部放大后如圖4所示，對(duì)每一到兩個(gè)周期進(jìn)行低通濾波后，得到灰度分布的骨骼線，即為低頻非均勻性分布。

圖3 微陣列生物芯片圖像Fig.3 Image of microarray biochip

圖4 TDI圖像在掃描方向上的均值Fig.4 Mean value of TDI image in scanning direction

濾波后得到的低頻校正系數(shù)為：

設(shè)I(2)i為待校正的微陣列生物芯片圖像，則校正方程為：

4 實(shí) 驗(yàn)

為驗(yàn)證本文提出的平場校正方法，基于某TDI熒光顯微成像系統(tǒng)（基因測序成像系統(tǒng)）開展實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的工作原理如圖5所示，包括生物芯片（均布間隔為500 nm的攜帶熒光分子的樣本點(diǎn)）、顯微物鏡（NA為1.0，視場約為2 mm）、雙色分光鏡（反射激光，透射熒光）、自聚焦濾光片、激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片（濾除激光，透過熒光）、管鏡（接收熒光）和相機(jī)。采用DALSA公司的TDI相機(jī)HL-HM-16K 30H-00R，工作行頻為200 k Hz，積分級(jí)數(shù)為128，最大分辨率為16 384 pixel。

圖5 T DI熒光顯微成像系統(tǒng)原理Fig.5 Schematic diagram of TDI fluorescence imaging system

采集暗場圖像和明場圖像，對(duì)相機(jī)自身的響應(yīng)非均勻性進(jìn)行校正，去除非均勻性中的高頻量。校正裝置如圖6所示，采用藍(lán)菲積分球作為明場光源，型號(hào)為USLR-L 20F-NBNL，開口面均勻性優(yōu)于±1%，積分球直徑約為500 mm，開口尺寸約為200 nm。積分球經(jīng)過照度、色溫、光譜輻亮度、均勻性的校準(zhǔn)、檢測和計(jì)量。

圖6 相機(jī)響應(yīng)平場校正裝置Fig.6 Flat filed correction devices of cameras

得到的暗場圖像I(0)和明場圖像I(1)如圖7所示，可見暗場存在明顯的高頻、低頻DSNU（或FPN），明場體現(xiàn)出顯著的高頻響應(yīng)非均勻性（PRNU）。

圖7 相機(jī)暗場及明場的非均勻性Fig.7 Nonuniformity of camera in dark and bright fields

對(duì)微陣列芯片成像，得到圖像I(2)，代入式（11）和（13）得到，在掃描方向取灰度均值，得到分布如圖8所示。較窄的突變暗線為網(wǎng)格線，網(wǎng)格線越窄說明TDI方向調(diào)整越準(zhǔn)確，邊緣和中心的低頻非均勻性主要由照明系統(tǒng)和成像系統(tǒng)導(dǎo)致。

圖8 微陣列生物芯片圖像中的灰度分布Fig.8 Digital level distribution of microarray biochip image

去除網(wǎng)格線、低通濾波，采用樣條曲線平滑擬合后得到TDI熒光成像系統(tǒng)的低頻響應(yīng)非均勻性，如圖9所示。對(duì)y軸歸一化后代入式（14）即可得到k ci，進(jìn)而可以計(jì)算校正系數(shù)αi和βi。校正系數(shù)可直接寫入相機(jī)配置文件中，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)平場校正處理。對(duì)HL-HM-16K 30H-00R相機(jī)進(jìn)行非均勻性校正測試，不校正時(shí)其圖像行輸出頻率為200 k Hz，即每行輸出時(shí)間間隔為5μs，結(jié)果顯示加入本文校正方法后仍能保證200 k Hz的行輸出頻率，可見每行圖像處理速度已足夠快（行運(yùn)算時(shí)間小于5μs），即能夠保證實(shí)時(shí)輸出校正后的圖像。

圖9 擬合后的低頻響應(yīng)非均勻性Fig.9 Low-frequency nonuniformity after fitting

圖8 中的微陣列芯片中樣本點(diǎn)之間的亮度差異性導(dǎo)致高頻量，樣本點(diǎn)在整體上是均勻的，因此通常可用圖9中的非均勻性評(píng)估TDI熒光成像系統(tǒng)的響應(yīng)均勻程度。校正后的圖像灰度分布如圖10所示，校正效果良好。

圖10 校正后的生物芯片圖像灰度分布Fig.10 Digital level distribution of corrected biochip image

校正前后的圖像如圖11所示，為便于目視對(duì)比，將校正前后圖像采用同樣的拉伸處理后顯示，可見校正后響應(yīng)均勻性顯著提升。

圖11 校正前后的生物芯片圖像Fig.11 Biochip images before and after correction

為驗(yàn)證算法的穩(wěn)定性，獲取不同生物芯片、不同強(qiáng)度的圖像，采用兩種定量評(píng)價(jià)指標(biāo)表征本文校正后的明場響應(yīng)非均勻性、非均勻性（Nonuniformity，NU）和均方根誤差（Root-Mean-Square Error，RMSE）［16-17］：

NU和RMSE都是將圖像網(wǎng)格線去除、掃描方向灰度均值處理后得到非掃描方向的響應(yīng)非均勻性。其中，NU表示響應(yīng)非均勻性的“峰谷值”評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，RMSE表示響應(yīng)非均勻性的“均方根值”評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，均為常規(guī)的評(píng)價(jià)方法。NU和RMSE越小，響應(yīng)均勻性越好。采集11幅圖像，校正前后的非均勻性如圖12～圖13所示。

圖12 多幅圖片校正前后的NUFig.12 NU of biochip images before and after correction

圖13 多幅圖片校正前后的RMSEFig.13 RMSE of biochip images before and after correction

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本文提出的校正方法使得熒光成像系統(tǒng)的響應(yīng)非均勻性NU從25.21%降低到2.87%，RMSE從3.12%降低到0.48%，校正效果顯著。該方法易于實(shí)施，廣泛適用于各類高性能TDI熒光成像系統(tǒng)。

5 結(jié) 論

本文根據(jù)高性能TDI熒光成像系統(tǒng)的響應(yīng)均勻性要求，提出一種基于微陣列生物芯片的平場校正方法。建立系統(tǒng)響應(yīng)非均勻性產(chǎn)生模型，在此理論基礎(chǔ)上提出將非均勻性分為高頻和低頻分別校正，設(shè)計(jì)了專用的微陣列芯片作為低頻非均勻性校正源，將照明系統(tǒng)、成像光學(xué)系統(tǒng)和相機(jī)自身的響應(yīng)非均勻性都進(jìn)行了校正。實(shí)驗(yàn)表明，本文方法能夠有效地完成TDI熒光成像非均勻性校正，響應(yīng)非均勻性NU從25.21%降低到2.87%，RMSE從3.12%降低到0.48%，提高了圖像質(zhì)量。此外，由于微陣列芯片是基因測序領(lǐng)域常用的芯片，校正源易于獲取，校正方法的實(shí)現(xiàn)較為經(jīng)濟(jì)、便捷。下一步工作的重點(diǎn)是尋求更為穩(wěn)定、均勻的校正源。