葛根芩連湯發(fā)酵液對T2DM大鼠氧化應激的影響*

李 津 宋 強△ 高鐵祥

葛根芩連湯治療糖尿病的作用已被中醫(yī)藥界所認同，該應用可謂古方新用、異病同治。從中醫(yī)理論來講，糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，多由長期嗜食肥甘厚味，辛辣香燥，使脾胃運化失職，致積熱內(nèi)蘊，化燥傷津，消谷耗液，而發(fā)為消渴。葛根芩連湯具有升陽運脾、清熱燥濕、潤燥生津的功效，符合消渴病脾失健運、胃腸濕熱、燥熱傷津的病機?，F(xiàn)代藥理研究也證實了葛根芩連湯治療糖尿病的有效性。

中藥發(fā)酵技術(shù)可謂現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的交叉結(jié)合，它利用微生物強大的分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力來生產(chǎn)新型中藥，在中醫(yī)藥研究開發(fā)和中藥材資源的保護與利用等方面給我們提供了新的思路。課題組前期采用中藥發(fā)酵技術(shù)對葛根芩連湯進行發(fā)酵處理，確定了最佳優(yōu)化的發(fā)酵條件。

氧化應激可引起胰島素分泌不足及胰島素抵抗，反之胰島素分泌不足及胰島素抵抗也可影響氧化應激，說明2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)可能通過氧化應激誘導其發(fā)生。本實驗通過觀察葛根芩連湯發(fā)酵液對T2DM大鼠氧化應激指標的影響，旨在闡明葛根芩連湯發(fā)酵液防治T2DM的增效作用及作用機制。

1 材料

1.1 藥物葛根芩連湯水煎液、葛根芩連湯煮散劑、葛根芩連湯發(fā)酵液均由山西中醫(yī)學院實驗中心制備。以上制劑的藥物組成及用藥比例均為葛根∶黃芩∶黃連∶甘草=8∶3∶3∶2。具體制備方法如下：葛根芩連湯水煎液的制備：將飲片加5倍藥物重量的水浸泡30 min后，煎煮30 min，紗布粗濾取藥液；藥渣加4倍藥物重量的水，煎煮30 min，紗布粗濾去渣，混合兩次藥液，水浴50 ℃，濃縮至全方生藥量為2 g/ml。葛根芩連湯煮散劑的制備：葛根、黃芩、黃連、甘草分別粉碎為60目的粉末，按照上述用量比例混合均勻，將藥物粉末加5倍藥物重量的水浸泡30 min后，煎煮30 min，持續(xù)攪拌，500 rpm/min，紗布粗濾取藥液；藥渣加4倍藥物重量的水，煎煮30 min，持續(xù)攪拌，500 rpm/min，紗布粗濾去渣，混合兩次藥液，水浴50 ℃，濃縮至全方生藥量為2 g/ml。葛根芩連湯發(fā)酵液的制備：將葛根芩連湯發(fā)酵液離心，取上清液，置于超凈工作臺，水浴50 ℃，濃縮至1/10時，發(fā)酵基質(zhì)(即藥渣)按照上述煮散劑的制備方法，濃縮后與發(fā)酵濃縮液合并至全方生藥量為2 g/ml。格列美脲片：由上海天賜福生物工程有限公司生產(chǎn)，規(guī)格2 mg×30片，批號：20141202。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，批號：1126C0314)來自Sigma S0130，Solarbio 分裝；檸檬酸鈉(批號：20150116)、檸檬酸(批號：20141108)均購自國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水(0.9%NaCl，批號：15032411)購自山東華魯制藥有限公司；水合氯醛(批號：20150306)購自天津市光復精細化工研究所；大鼠胰島素定量elisa試劑盒(批號：20150730)購自上海瓦蘭生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號：20150728)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號：20150415)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(批號：20150608)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-px)測定試劑盒(批號：20150512)、考馬斯亮藍法蛋白檢測試劑盒(批號：20150608)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動物Sprague Dawley(SD)大鼠，85只，SPF級，雄性，180～220 g/只，購自中國食品藥品檢定研究院，合格證號：SCXK(京)2014-0013。

1.4 飼料高糖高脂飼料(配方：豬油10%，蔗糖5%，蛋黃粉5%，膽固醇1%，膽鹽0.1%，基礎飼料78.9%，批號：20150328)，購自北京諾康源有限公司)；常規(guī)飼料(大小鼠生長繁殖飼料，批號：15033151)，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

2 方法

2.1 造模方法動物購置后適應性喂飼1周，除隨機選取10只喂飼常規(guī)飼料外，其余75只喂飼高糖高脂飼料4周，在第5周的第1天早晨，空腹腹腔注射STZ溶液35 mg/kg/次，喂飼常規(guī)飼料的大鼠注射檸檬酸緩沖液。7 d后大鼠尾尖取血采用血糖儀檢測空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L者視為造模成功。

2.2 分組及處理喂飼常規(guī)飼料的10只大鼠繼續(xù)喂飼常規(guī)飼料，作為正常對照組，灌胃給予生理鹽水。將造模成功的T2DM大鼠隨機分為5組，分別為模型對照組、陽性藥對照組、葛根芩連湯水煎液組(以下簡稱GGQLT水煎液組)、葛根芩連湯煮散劑組(以下簡稱GGQLT煮散劑組)、葛根芩連湯發(fā)酵液組(以下簡稱GGQLT發(fā)酵液組)，仍喂飼高糖高脂飼料，分別灌胃給予生理鹽水、格列美脲(0.67 mg/kg)、葛根芩連湯水煎液(生藥量為20 g/kg)、葛根芩連湯煮散劑(生藥量為20 g/kg)、葛根芩連湯發(fā)酵液(生藥量為20 g/kg)，持續(xù)8周。末次給藥后，各組動物禁食12 h，腹腔注射5%水合氯醛，麻醉后腹主動脈采血，靜置30 min，2500 rpm/min離心10 min，分離血清并分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙?，剪取右大腿股四頭肌放凍存管中，迅速置于液氮中，待檢。

2.3 檢測指標

2.3.1 空腹血糖(FBG)分別于造模(注射STZ)前1天，及造模成功后當天(第0周)與第2、4、6、8周的第7天早晨(禁食12 h后)尾尖取血采用血糖儀測定FBG。

2.3.2 空腹胰島素(FINS)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)FINS采用雙抗體夾心ELISA法，計算ISI= Ln[1/(FBG×FINS)]，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

2.3.3 氧化應激指標血清超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)；血清丙二醛(MDA)含量采用TBA法；血清過氧化氫酶(CAT)采用可見光法；血清谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-px)采用比色法。

3 結(jié)果

3.1 葛根芩連湯發(fā)酵液對T2DM大鼠FBG的影響造模前，各組FBG均在5.0～6.5 mmol/L，且各組間差異無統(tǒng)計學意義。造模后的各組FBG與正常對照組相比均顯著升高(P<0.01)，且各組FBG均值>11.1 mmol/L，符合T2DM的診斷標準，說明該模型大鼠造模成功。隨著給藥時間推移，給藥組FBG均有降低趨勢，至第4周，陽性藥對照組、GGQLT水煎液組及GGQLT發(fā)酵液組大鼠FBG顯著低于模型對照組(P<0.05)；第6周，各給藥組FBG均顯著低于模型對照組(P<0.05)；第8周，各給藥組FBG均顯著低于模型對照組(P<0.01)，其中GGQLT發(fā)酵液組FBG均值低于其余給藥組，但差異無統(tǒng)計學意義。葛根芩連湯不同劑型降糖作用存在一定的時-效關系。見表1。

表1 各組大鼠FBG比較 (只，

3.2 葛根芩連湯發(fā)酵液對T2DM大鼠FINS、ISI、HOMA-IR的影響模型對照組與正常對照組相比，F(xiàn)INS水平顯著升高(P<0.01)，ISI顯著降低(P<0.01)，HOMA-IR顯著升高(P<0.01)，說明模型對照組出現(xiàn)了高胰島素血癥及胰島素抵抗。各給藥組與模型對照組相比，F(xiàn)INS顯著降低(P<0.01)，ISI顯著升高(P<0.01)，HOMA-IR顯著降低(P<0.01)。GGQLT發(fā)酵液組FINS水平顯著低于其余給藥組(P<0.01)；GGQLT發(fā)酵液組ISI均值高于其余給藥組，但差異無統(tǒng)計學意義；GGQLT發(fā)酵液組HOMA-IR顯著低于GGQLT水煎液組(P<0.05)，GGQLT發(fā)酵液組HOMA-IR均值低于陽性對照藥組、GGQLT煮散劑組，但差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 各組大鼠FINS、ISI、HOMA-IR比較 (只，

3.3 葛根芩連湯發(fā)酵液對T2DM大鼠氧化應激的影響模型對照組血清MDA含量顯著高于正常對照組(P<0.01)，SOD及CAT活性顯著低于正常對照組(P<0.05，P<0.01)，GSH-px低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。陽性藥對照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組SOD活性顯著高于模型對照組(P<0.01)。GGQLT發(fā)酵液組SOD活性顯著高于陽性藥對照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組(P<0.05，P<0.01)。陽性藥對照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組MDA含量顯著低于模型對照組(P<0.05，P<0.01)。GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組MDA含量低于陽性藥對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。GGQLT煮散劑組CAT活性顯著高于模型對照組(P<0.05)，陽性藥對照組、GGQLT水煎液組及GGQLT發(fā)酵液組CAT活性均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。陽性藥對照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組及GGQLT發(fā)酵液組GSH-px活性較模型對照組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 各組大鼠血清氧化應激指標比較 (只，

4 討論

氧化應激是指機體受到各種有害刺激后，體內(nèi)高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)產(chǎn)生過多，打破了機體氧化系統(tǒng)和抗氧化動態(tài)平衡，抗氧化能力下降，造成機體組織細胞及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子氧化損傷的一種嚴重的應激狀態(tài)，從而導致組織細胞損傷[1]。

氧化應激標志物是一系列能反映機體內(nèi)氧化應激水平的生物化學物質(zhì)。脂質(zhì)過氧化水平常被作為反映氧化應激水平的指標之一，能反映機體受氧化應激損傷的程度。脂質(zhì)過氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學劑，即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，而且通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用，使之攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，導致脂質(zhì)過氧化作用，同時產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，造成細胞損傷[2]。目前用于檢測的主要產(chǎn)物為丙二醛(malondialdehyde，MDA)。MDA 含量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度。

機體內(nèi)存在著兩類抗氧化系統(tǒng)，一類是酶抗氧化系統(tǒng)，現(xiàn)在廣泛研究的抗氧化酶類包括：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)等，可以阻止新的自由基生成，或者清除已經(jīng)生成但尚未發(fā)生反應的自由基；另一類是非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素C、維生素E等[3]。

研究表明，氧化應激與T2DM密切相關，是引起T2DM發(fā)生發(fā)展的重要因素[4]。高血糖是產(chǎn)生氧化應激的重要因素，可增加機體內(nèi)的 ROS 與RNS 含量，主要是通過葡萄糖自氧化、線粒體電子傳遞鏈和多元醇通路等途徑產(chǎn)生，當超氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生速率超過其移除速率時即會產(chǎn)生氧化應激[5，6]。氧化應激會導致胰島β細胞功能損傷及外周胰島素抵抗，誘發(fā)糖尿病的形成，嚴重者更會導致糖尿病神經(jīng)病、糖尿病視網(wǎng)膜病和糖尿病心血管病等多種并發(fā)癥的形成[7-9]。

氧化應激也是導致胰島β細胞功能衰退的主要原因之一，其機制可能為：①ROS 可直接損傷β細胞，主要是以破壞細胞線粒體結(jié)構(gòu)為特點，進一步促進β細胞凋亡[10]；②抑制胰十二指腸同源盒因子1(PDX-1)的活性，如C-Jun氨基末端激酶(C-jun N-terminal kinase，JNK)的過度激活可降低PDX-1的活性，改變其磷酸化狀態(tài)，引起PDX-1與DNA的結(jié)合力下降，造成胰島素基因轉(zhuǎn)錄障礙和β細胞功能減退，導致胰島素合成和分泌減少等[11，12]；③ ROS可激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)等胰島素信號通路，間接損傷β細胞功能，如引起β細胞炎癥反應[13]；④影響細胞能量代謝：如降低3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的活性，抑制了糖酵解過程和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)穿梭系統(tǒng)，致使ATP合成不足，使葡萄糖刺激的胰島素第一時相分泌減少[14]。

大量基礎研究已經(jīng)表明氧化應激是糖尿病發(fā)病中的關鍵因素之一，改善氧化應激狀態(tài)為防治糖尿病及其慢性并發(fā)癥提供了新的視角?！翱寡趸笔乾F(xiàn)代醫(yī)學的概念，因此在開展中藥復方抗氧化活性基礎研究及臨床研究時無法借鑒古人的經(jīng)驗，且復方研究又受到如炮制、提取、溶劑、貯存等諸多因素的影響，若僅僅根據(jù)中藥藥理研究的結(jié)果選擇藥物，又不符合中醫(yī)辨證論治的思想。因此盡量選擇藥味精煉的中藥復方，通過基礎及臨床研究，觀察中藥復方抗氧化活性，將有益于改善氧化應激，從而更好地防治糖尿病及其慢性并發(fā)癥。

方藥防治糖尿病在過去幾十年的藥理研究中，總是局限于觀察降糖療效為主，隨著氧化應激與糖尿病相關性的研究進展，本研究著重于觀察葛根芩連湯對于2型糖尿病大鼠的抗氧化活性。

本實驗模型對照組與正常對照組比較，SOD、GSH-px、CAT活性均升高，MDA含量降低，說明T2DM與氧化應激之間存在直接或間接關系。T2DM發(fā)病后，持續(xù)的高血糖可進一步加重氧化應激，而氧自由基的大量堆積，又反過來加重T2DM的病情，相互影響。糖尿病產(chǎn)生過多的自由基，消耗了內(nèi)源性SOD、GSH-px、CAT，SOD、GSH-px、CAT發(fā)生糖基化后活性下降，抗氧化能力降低，氧自由基通過與細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，破壞了細胞結(jié)構(gòu)和功能，同時形成MDA。

給予模型大鼠葛根芩連湯發(fā)酵液8周后，可以顯著升高T2DM大鼠血清SOD 活性，降低 MDA 含量，對CAT及GSH-px活性有升高趨勢。GGQLT發(fā)酵液組SOD活性顯著高于陽性藥對照組、GGQLT水煎液組、GGQLT煮散劑組，GGQLT發(fā)酵液組MDA含量均值低于陽性藥對照組。研究結(jié)果證實，葛根芩連湯發(fā)酵液可通過提高模型大鼠抗氧化物酶的活性和降低脂質(zhì)過氧化物的含量，從而增強自由基清除能力和降低ROS的產(chǎn)生，起到抗氧化應激、防止氧化損傷的效果，最終達到抗糖尿病、保護胰島β細胞功能，改善胰島素抵抗的作用。分析其原因，可能是由于葛根芩連湯方中四味藥均有抗氧化作用，經(jīng)過復方配伍后發(fā)生協(xié)同作用而產(chǎn)生。發(fā)酵也是其增效的重要因素，通過發(fā)酵，復方中的大分子物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，更有利于機體的吸收。