間歇運動激活miR-21-PTEN-Akt通路抑制NLRP3炎癥小體表達保護心梗心功能

林琴琴 ，張偉超 ，王湘怡 ，耿元文 ，李若明 ，田振軍

研究表明，炎癥在心肌梗死（myocardial infarction，MI）的病理生理學中起著至關重要的作用（Ruparelia et al.，2017）。NOD樣受體蛋白 3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是心肌缺血后炎癥反應級聯(lián)放大的重要介質(zhì)（Takahashi，2014）。NLRP3炎癥小體是細胞內(nèi)多蛋白復合物，活化后激活凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated specklike，ASC），導致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1）大量表達，促進白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素 18（IL-18）的成熟與釋放（Schroder et al.，2010）。MI缺血心肌NLRP3表達上調(diào)，可促進caspase-1、IL-1β和IL-18表達增多，誘發(fā)心肌炎癥級聯(lián)反應（Sandanger et al.，2013）。抑制NLRP3炎癥小體表達，可減少炎癥并改善MI大鼠心臟功能障礙和重塑（Kawaguchi et al.，2011）。干預NLRP3炎癥小體異常表達或將成為防治MI的新靶點或策略。

研究證實，microRNA-21（miR-21）高表達于心血管系統(tǒng)中，參與各種心血管疾病尤其是MI的病理生理機制（Cheng et al.，2010）。miR-21上調(diào)表達可降低心梗大鼠心肌梗死面積，抑制細胞凋亡，保護心臟組織結構和功能（Gu et al.，2015）。miR-21是一種新型炎性反應調(diào)節(jié)因子（Sheedy，2015），調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活，參與缺血心臟保護（Toldo et al.，2014）。PTEN-Akt信號通路參與MI生物進程，抑制PTEN表達可減少心梗面積并改善MI后左室功能，調(diào)節(jié)Akt途徑可減輕MI后的心臟重塑（Yang et al.，2016；Zhu et al.，2019）。miR-21靶向負性調(diào)控PTEN表達，激活Akt通路，發(fā)揮抗炎作用（Rippe et al.，2012）。激活PTEN-Akt信號通路可減少肝移植大鼠肝臟NLRP3炎癥小體表達（Li et al.，2017）。推測，miR-21上調(diào)表達激活PTEN-Akt信號通路，抑制NLRP3炎癥小體表達和炎癥反應。

miRs是運動保護心功能的關鍵調(diào)節(jié)者。有氧運動可顯著上調(diào)心肌miR-29a和miR-101a表達，改善心梗大鼠心功能（Xiao et al.，2017）；上調(diào)心肌miR-21表達，增加大鼠生理性左室肥厚，提升心功能（Zhao et al.，2016）。有氧運動可抑制健康老年人外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體的激活（Mejias-Pena et al.，2017）。但運動能否激活MI心臟miR-21-PTEN-Akt信號通路，抑制NLRP3炎癥小體表達，發(fā)揮心臟保護作用，目前鮮見文獻報道。本研究擬探討間歇運動對MI大鼠心肌miR-21和NLRP3炎癥小體表達的影響及可能機制，為運動改善MI病理進程及機制和治療靶點篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要試劑：TRIzol（Inventragtion）、miRNA反轉錄試劑盒（TaKaRa）、引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］、兔抗多克隆抗體 NLRP3（Abcam）、IL-1β（Santa）、IL-18（proteintech）、PTEN（Abcam）、Akt和p-Akt（CST）、小鼠單克隆抗體ASC-1和caspase-1（Santa）、山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗（北京天德悅生物科技有限責任公司）等。

主要儀器：小動物呼吸機（ALC-V8）、PowerLab 8/30生理信號采集系統(tǒng)、Bio-Rad電泳儀和轉移槽、Bio-Rad多色凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad ChemiDocTMMP）、Thermo低溫高速離心機、尼康熒光顯微鏡、Bio-Rad PCR擴增儀等。

1.2 實驗動物分組與MI模型制備

動物分組：3月齡雄性SD大鼠購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，體質(zhì)量為180～220 g。適應性喂養(yǎng)1周后，左冠狀動脈前降支結扎法制備MI模型，術后存活20只，隨機分為心肌梗死組（MI）和心梗＋間歇運動組（ME），每組10只。另選取大鼠（手術過程同上）只穿線不結扎，術后存活20只，隨機分為假手術組（C）和假手術＋間歇運動組（CE），每組10只。大鼠分組后，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由進食飲水。C組和MI組不運動，CE和ME組進行為期4周的動物跑臺訓練。

MI模型制備：5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，呼吸面罩進行呼吸機輔助呼吸，多道生理信號采集處理系統(tǒng)記錄大鼠肢導心電圖。常規(guī)開胸暴露心臟，于左心耳根部和肺動脈圓錐左緣交界下2 mm處用5/0手術線結扎左冠狀動脈前降支，肉眼可見結扎遠端心肌顏色逐漸變淺或變白，主要局限在左室（left ventricular，LV），靠近心尖部最明顯。以心電圖S-T段抬高或T波倒置，斷定為造模成功，常規(guī)關胸護理。

1.3 間歇運動方案

運動方案參考Wisloff訓練模型略加改動（Wisloff et al.，2002）。CE和ME組大鼠術后1周進行跑臺運動。第1周為適應性訓練（10～15 m/min，30 min/天，共5天）。正式訓練時，起始訓練速度為10 m/min，時間為10 min。之后進行間歇有氧運動，速度為25 m/min，運動7 min；后間歇3 min，速度為15 m/min，依次交替進行，運動總時間為60 min。每周訓練5天，連續(xù)訓練4周。

1.4 心功能檢測

訓練結束后次日，腹腔麻醉，采用多導生理記錄儀記錄心電圖，采用PowerLab 8/30信號采集系統(tǒng)檢測心臟血流動力學指標，評定心功能。右頸總動脈逆行插管至左心室，測試LVSP、LVEDP和±dp/dt max。測畢腹主動脈取血后，迅速開胸摘取心臟，取大鼠心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織，用于組織學實驗的樣本置于10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，制片，Masson染色；用于分子生物學實驗的樣本，迅速放于液氮速凍，-80℃冰箱保存待用。

1.5 Western Blot

取心梗邊緣區(qū)心肌組織50 mg，加入預冷蛋白抽提試劑500 μl，剪碎勻漿，4℃離心，取上清液，BCA蛋白定量。常規(guī)制膠、上樣、電泳、轉膜，5%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗 NLRP3（1：600）、IL-18（1：1 000）、Akt（1：1 000）、p-Akt（1：1000）、PTEN（1：2 000）、ASC-1（1：200）、caspase-1（1：200）、IL-1β（1：200），內(nèi)參為 GAPDH（1：10 000），4℃過夜。次日室溫復溫30 min后，室溫孵育二抗（1：8 000）1 h，TBST清洗，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像與分析。

1.6 RT-qPCR

取心梗邊緣區(qū)心肌組織，TRIzol提取總RNA，按microRNA反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，再以此cDNA為模板按PCR試劑盒進行PCR反應。miR-21引物由上海生工設計和合成，U6為內(nèi)參。反應條件如下：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 20 s，39個循環(huán)。每個樣品重復檢測3次。利用2-△△Ct法計算miR-21的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，以平均值±標準差（M±SD）表示。統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）。顯著性差異選擇P＜0.05和P＜0.01水平。

2 結果

2.1 間歇運動上調(diào)MI心臟miR-21表達

PCR結果顯示，與C組比較，CE組大鼠心肌miR-21表達顯著升高（P＜0.01），MI組大鼠心肌miR-21表達顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，ME組大鼠心肌miR-21表達顯著升高（P＜0.01）。表明，MI心臟miR-21應激性升高，間歇運動可進一步增加MI心臟miR-21表達（圖1）。

圖1 MI心臟miR-21表達結果Figure 1. The Expression of miR-21 in MI Heart

2.2 間歇運動激活MI心臟PTEN-Akt信號通路

Western Blot結果顯示，與C組比較，CE組大鼠PTEN蛋白表達顯著降低，p-Akt/Akt比值顯著升高（P＜0.01）；MI組大鼠PTEN蛋白表達顯著升高，p-Akt/Akt比值顯著降低（P＜0.01）；與MI組比較，ME組大鼠心肌PTEN蛋白表達顯著降低，p-Akt/Akt比值顯著升高（P＜0.01）。表明，MI后PTEN-Akt通路代償激活，間歇運動可有效激活PTEN-Akt信號通路（圖2）。

圖2 MI心臟PTEN和p-Akt/Akt蛋白表達結果Figure 2. The Protein Expression of PTEN and p-Akt/Akt in MI Heart

2.3 間歇運動抑制MI心臟NLRP3炎癥小體表達

Western Blot結果顯示，與C組比較，CE組大鼠心肌NLRP3、ASC-1和caspase-1蛋白表達均顯著降低（P＜0.01），MI組大鼠心肌NLRP3、ASC-1和caspase-1蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，ME組大鼠心肌NLRP3、ASC-1和caspase-1表達均顯著降低（P＜0.01）。表明，MI后NLRP3炎性小體激活，間歇運動可有效抑制NLRP3炎癥小體激活（圖3）。

圖3 MI心臟NLRP3炎癥小體表達結果Figure 3. The Expression of NLRP3 Inflammsome in MI Heart

2.4 間歇運動抑制MI心臟IL-1β和IL-18表達

Western Blot結果顯示，與C組比較，CE組大鼠心肌IL-1β蛋白表達顯著降低（P＜0.01），MI組大鼠心肌IL-1β和IL-18蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與MI組比較，ME組大鼠心肌IL-1β和IL-18蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。表明，MI后炎癥反應增加，間歇運動可顯著抑制MI大鼠心臟炎癥反應（圖4）。

圖4 MI心臟IL-1β和IL-18表達結果Figure 4. The Protein Expression of IL-1β和IL-18 in MI Heart

2.5 間歇運動降低MI心臟的心肌纖維化水平，改善心功能

光鏡下觀察，細胞核呈藍紫色，心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色染色。Masson染色結果顯示，與C組比較，CE組心肌組織結構正常，CVF%無顯著差異；MI組可見典型性替代性纖維化，CVF%顯著增加（P＜0.01）；與MI組比較，ME組膠原纖維減少，CVF%值顯著降低（P＜0.01）。表明，MI后膠原纖維過度增生，間歇運動可有效抑制膠原纖維過度增生，改善纖維化程度（圖5）。

圖5 心肌Masson染色結果（×200）Figure 5. Masson Staining of Cardiac Muscle（×200）

與C組比較，CE組大鼠LVEDP顯著降低（P＜0.01），LVSP和±dp/dtmax顯著升高（P＜0.01），MI組大鼠LVEDP顯著升高（P＜0.01），LVSP和±dp/dtmax顯著降低（P＜0.01）；與MI組比較，ME組大鼠LVEDP顯著降低（P＜0.01），LVSP和±dp/dtmax顯著升高（P＜0.01）。表明，MI嚴重損害心功能，間歇運動有效改善心功能（圖6）。

圖6 血流動力學參數(shù)變化Figure 6. Changes of Hemodynamic Parameters in Rats

2.6 心肌miR-21表達與NLRP3、心功能變化的相關分析

相關性分析結果顯示，心肌NLRP3蛋白表達與LVSP、＋dp/dt max、-dp/dt max呈顯著負相關（r=-0.964，P＜0.01；r=-0.934，P＜0.01；r=-0.980，P＜0.01），與LVEDP呈顯著正相關（r=-0.984，P＜0.01）。表明，隨著心肌NLRP3表達的增加，MI大鼠心功能受損。MI及MI間歇運動后，心肌miR-21表達與NLRP3蛋白表達呈顯著負 相 關（r=-0.804，P＜0.01），與 LVSP、＋dp/dt max、-dp/dt max呈顯著正相關（r=0.799，P＜0.01；r=0.834，P＜0.01；r=0.800，P＜0.01），與 LVEDP呈顯著負相關（r=-0.829，P＜0.01）。表明，隨著心肌miR-21表達升高，NLRP3表達減少，MI大鼠心功能顯著改善。

3 討論

3.1 間歇運動抑制MI心臟NLRP3炎癥小體激活，抑制心肌炎癥和重塑，改善心功能

MI是一種伴隨炎癥反應的疾病，如炎癥細胞的浸潤和炎性細胞因子/趨化因子的釋放，導致心肌損傷和重塑，影響患者病情和死亡率。研究證實，NLRP3炎癥小體參與MI的發(fā)生、發(fā)展。NLRP3炎癥小體在永久性MI大鼠和小鼠模型的缺血心肌成纖維細胞中表達顯著增多（Sandanger et al.，2013），抑制ASC和caspase-1表達，可顯著減少缺血再灌注小鼠心肌炎癥細胞浸潤和細胞因子表達，減緩梗死發(fā)展和心肌纖維化的發(fā)生（Kawaguchi et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，MI大鼠心肌NLRP3、ASC和caspase-1

表達增多，下游炎癥因子IL-1β和IL-18表達增加，CVF%和LVEDP顯著升高，LVSP和±dp/dt max顯著降低。相關性分析結果顯示，心肌NLRP3蛋白表達與LVSP、＋dp/dt max、-dp/dt max呈顯著負相關，與LVEDP呈顯著正相關，說明MI激活NLRP3炎癥小體，誘發(fā)心梗心臟炎癥反應和重塑，降低心功能。提示，抑制NLRP3炎癥小體表達可作為預防和治療MI的新靶點。研究證實，抑制NLRP3炎癥小體表達可降低急性心梗大鼠心臟炎癥反應，減少梗死面積，降低心肌纖維化，保護心功能（Marchetti et al.，2014）。有氧運動也可抑制NLRP3炎癥小體的表達，顯著減少肥胖大鼠或卵巢切除大鼠大腦海馬中的NLRP3表達，改善海馬炎癥反應（Cai et al.，2016；Wang et al.，2016），降低高脂膳食小鼠脂肪組織NLRP3的表達，減少炎癥因子IL-18表達，降低系統(tǒng)炎癥（Mardare et al.，2016）。本研究顯示，間歇運動可顯著減少大鼠心肌NLRP3、ASC-1和caspase-1表達，減少炎癥因子IL-1β和IL-18表達。提示，間歇運動參與NLRP3炎癥小體表達的調(diào)控。更重要的是，間歇運動可顯著減少MI大鼠心肌NLRP3、ASC-1、caspase-1及下游炎癥因子IL-1β和IL-18表達，降低CVF%和LVEDP，升高LVSP和±dp/dt max。提示，間歇運動抑制心梗大鼠心肌NLRP3表達、炎癥小體激活、心肌炎癥反應和重塑，提升心功能。

3.2 間歇運動激活MI心臟miR-21-PTEN-Akt通路，抑制NLRP3炎癥小體表達

研究表明，miR-21參與MI的發(fā)生、發(fā)展。miR-21在缺氧12 h的H9C2心肌細胞或過氧化氫刺激的原代乳鼠心室肌細胞中表達顯著增多（Cheng et al.，2009；Xing et al.，2019）。有實驗證實，miR-21在MI小鼠心臟梗死和邊緣區(qū)第1天表達顯著增加，第3天達到峰值，第5天和第7天仍保持高水平（Yang et al.，2018），隨時間延長（3、7和14天）顯著增多（Yuan et al.，2017），第4周持續(xù)升高表達（Gu et al.，2015）。本研究與上述結論一致，4周MI大鼠梗死邊緣區(qū)miR-21表達顯著上調(diào)。提示，miR-21上調(diào)表達參與MI進程。miR-21是一種新型炎性反應調(diào)節(jié)因子（Sheedy，2015），其上調(diào)表達可顯著抑制脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞或牙周炎小鼠牙齦中炎性因子的表達（Zhou et al.，2018；Zhu et al.，2018）。miR-21缺乏的心肌細胞和組織中，ASC表達和caspase-1活性增強，細胞凋亡和壞死增加，心臟梗死面積擴大（Toldo et al.，2014）。說明，miR-21調(diào)控NLRP3炎癥小體激活，參與MI心臟疾病進程。研究證實，miR-21過表達介導缺血再灌注損傷模型中的心臟保護作用（Olson et al.，2015），減緩大鼠心肌和組織的細胞凋亡（Tong et al.，2015），上調(diào)心臟微血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成，拮抗MI模型誘導的內(nèi)皮損傷（Yang et al.，2016）。提示，miR-21上調(diào)表達在MI心臟中發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，MI后梗死邊緣區(qū) miR-21表達增多，NLRP3、ASC-1、caspase-1及其下游炎癥因子IL-1β和IL-18表達增多，推測MI后miR-21應激性升高，調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體激活，參與MI后心肌炎癥反應的調(diào)控。研究證實，有氧運動顯著增加大鼠和小鼠心肌miR-21表達，抑制細胞凋亡，提升心功能（Palabiyik et al.，2019）。本研究顯示，間歇運動顯著增加大鼠心肌miR-21表達。提示，間歇運動調(diào)節(jié)心肌miR-21的表達。本研究進一步證實，間歇運動顯著上調(diào)心梗大鼠心肌miR-21表達，抑制NLRP3、ASC-1、caspase-1、IL-1β和IL-18表達。相關性分析結果顯示，MI及MI間歇運動后，心肌miR-21表達與NLRP3蛋白表達呈顯著負相關，與LVSP、＋dp/dt max和-dp/dt max呈顯著正相關，與LVEDP呈顯著負相關。表明，間歇運動上調(diào)MI心臟miR-21表達，抑制NLRP3炎癥小體激活，抑制炎癥反應，保護心功能。

PTEN是某些心血管疾病發(fā)展的關鍵分子，在內(nèi)皮細胞、心肌細胞和成纖維細胞中廣泛表達，通過靶向負性調(diào)控PI3Ks和Akt表達，調(diào)節(jié)肥大、收縮、細胞存活/凋亡和代謝（Oudit et al.，2004）。PTEN是miR-21的靶基因，miR-21負性調(diào)節(jié)PTEN表達，參與miR-21介導的心血管作用（Roy et al.，2009）。研究證實，miR-21上調(diào)表達靶向PTEN激活Akt信號通路，抑制心肌細胞和心肌干細胞凋亡，促進心肌干細胞增殖，保護心肌免受缺血再灌注或缺氧再灌注損傷（Shi et al.，2017；Yang et al.，2014）。表明，miR-21直接靶向調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號途徑，發(fā)揮心肌保護作用。研究證實，缺氧上調(diào)心肌細胞miR-21表達，增加PTEN表達，降低磷酸化Akt表達；天麻素進一步上調(diào)miR-21表達，降低PTEN 表達，上調(diào)磷酸化Akt表達（Xing et al.，2019）。提示，上調(diào)miR-21表達激活PTEN-Akt途徑，可減弱心肌細胞缺氧損傷。運動作為非藥物干預手段，保護心功能。有氧運動顯著上調(diào)大鼠心肌miR-21表達，抑制PTEN表達，激活Akt信號通路，提升心功能（Ma et al.，2013）。本研究與上述結論一致，顯示間歇運動顯著上調(diào)大鼠心肌miR-21表達，抑制PTEN表達，激活Akt信號通路，提升心功能。提示，間歇運動激活miR-21-PTEN-Akt通路。研究發(fā)現(xiàn)，Akt通路激活減少肝缺血再灌注大鼠肝臟NLRP3炎癥小體表達（Li et al.，2018），激活PTEN/Akt信號通路可減少肝移植大鼠肝臟NLRP3炎癥小體的表達，減緩缺血再灌注導致的肝細胞損傷（Li et al.，2017）。另有研究證實，有氧運動可激活Akt信號通路，抑制NLRP3/IL-1β信號通路，促進糖尿病大鼠海馬突觸可塑性相關蛋白的表達（Zhao et al.，2016）。本研究顯示，心梗大鼠心肌miR-21、PTEN表達增加，磷酸化Akt表達降低，NLRP3炎癥小體及IL-1β和IL-18表達增加。間歇運動大鼠心肌miR-21表達進一步增多，PTEN表達降低，磷酸化Akt表達增加，NLRP3炎癥小體及IL-1β和IL-18表達減少。由此推測，間歇運動抑制MI大鼠心臟NLRP3炎癥小體激活、炎癥反應及改善心臟功能可能與miR-21-PTEN-Akt通路激活有關，但尚不明確。采用miR-21敲除動物及過表達模型，確定miR-21在運動抑制心肌炎癥反應及改善心臟病理性重塑和心功能中的作用及機制，對心梗心臟運動康復治療靶點篩選具有重要意義。

4 結論

間歇運動顯著上調(diào)心梗大鼠心肌miR-21表達，激活miR-21-PTEN-Akt信號通路，抑制NLRP3炎癥小體表達、心肌炎癥反應和重塑。間歇有氧運動改善心梗大鼠心功能與提高心梗大鼠心臟miR-21表達、激活miR-21-PTENAkt通路密切關系。