東部平原礦區(qū)復(fù)墾對(duì)土壤微生物固碳潛力的影響

馬 靜，董文雪，朱燕峰，于昊辰，肖 棟，陳 浮1,

(1.江蘇省煤基溫室氣體減排與資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 中阿微生物采礦與土壤生態(tài)修復(fù)聯(lián)合研究中心，江蘇 徐州 221116；3.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116；4.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 環(huán)境與測(cè)繪學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

東部平原礦區(qū)具有潛水位高、煤糧復(fù)合度高等特點(diǎn)，采煤活動(dòng)對(duì)地表擾動(dòng)強(qiáng)烈，導(dǎo)致上覆農(nóng)田塌陷、積水和鹽堿化，土體結(jié)構(gòu)破壞、水體污染和生物量銳減十分普遍。高潛水位導(dǎo)致沉陷地表易積水，從而改變水土平衡和碳氮循環(huán)，降低了農(nóng)田質(zhì)量和生產(chǎn)力。當(dāng)前復(fù)墾是沉陷區(qū)生態(tài)修復(fù)和恢復(fù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要手段，主要包含充填復(fù)墾或挖深墊淺等不同模式。但東部平原礦區(qū)復(fù)墾土壤肥力低、團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)特征差、功能弱，主要原因是受潛水位季節(jié)性變化的控制，客土耕作層極易返堿，從而影響微生物群落發(fā)育和功能重建。微生物作為土壤中最為活躍的組分，對(duì)重構(gòu)土壤的發(fā)育和功能重建具有不可替代的激發(fā)催化作用。從分子生態(tài)學(xué)視角探索復(fù)墾土壤固碳菌群的變化及響應(yīng)機(jī)制，識(shí)別復(fù)墾的環(huán)境效應(yīng)及權(quán)衡土-糧食-碳之間關(guān)系，對(duì)提升土壤固碳潛力，保障糧食安全和維護(hù)生態(tài)安全，并促進(jìn)碳中和目標(biāo)實(shí)現(xiàn)等具有重要的意義。

土壤微生物不但影響作物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)，還對(duì)維持土壤生產(chǎn)力、抵抗非生物脅迫和恢復(fù)重要功能上起作用。作為分解者，能分泌多種酶降解動(dòng)植物殘?bào)w及其他有機(jī)物，并加速碳的轉(zhuǎn)化與遷移。一方面，土壤微生物通過參與凋落物分解或直接固定空氣中CO，促進(jìn)碳積累；另一方面，微生物呼吸作用及參與的有機(jī)碳礦化過程又會(huì)消耗土壤有機(jī)碳，并向空氣釋放CO。微生物種類繁雜，介導(dǎo)了多樣化代謝功能。其中：碳固定過程對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)平衡極其重要。目前已發(fā)現(xiàn)微生物固碳途徑有6條：卡爾文循環(huán)、還原檸檬酸循環(huán)、還原乙酰輔酶A途徑、3-羥基丙酸雙循環(huán)、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)。土壤固碳能力受多重因素影響，擾動(dòng)狀況、理化性能、根系分泌物、植被種類和多樣性等影響著碳源的分配，從而影響參與此過程特定菌群的結(jié)構(gòu)和功能。高通量測(cè)序、DNA分子指紋圖譜、Geochip和qPCR芯片等分子生物學(xué)方法和同位素示蹤技術(shù)發(fā)展促成了微生物群落研究不斷深入，并逐漸成為碳循環(huán)研究的高效工具。目前固碳菌及固碳基因研究集中于水田，發(fā)現(xiàn)微生物固碳能力與酶活性有關(guān)，高酶活性代表土壤自養(yǎng)微生物固碳潛力更高。同時(shí)微生物參與了碳固定、甲烷代謝、碳降解等多個(gè)重要碳循環(huán)過程。東部平原礦區(qū)自然條件相對(duì)好，充分挖掘固碳微生物功能不僅有助于提升土壤肥力、保障糧食生產(chǎn)能力，還可以增加生態(tài)碳匯、減緩全球氣候變化的壓力。

目前，礦區(qū)復(fù)墾土壤涉及碳相關(guān)的研究主要集中于土壤理化及碳組分變化。如USSIRI等考察復(fù)墾后土地利用方式對(duì)礦區(qū)土壤性質(zhì)和碳儲(chǔ)存影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，復(fù)墾土壤pH值和電導(dǎo)率較高，土壤團(tuán)聚體對(duì)有機(jī)碳累積起至關(guān)重要的作用。GANJEGUNTE等研究植被、土壤質(zhì)地和木質(zhì)素含量對(duì)礦區(qū)復(fù)墾土壤總有機(jī)碳積累的影響，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量顯著影響有機(jī)碳的累積。WICK等利用穩(wěn)定性同位素檢測(cè)復(fù)墾土壤團(tuán)聚體和有機(jī)質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨復(fù)墾時(shí)間延長(zhǎng)，土壤大團(tuán)聚體比例增加，微團(tuán)聚體比例下降。DAS等對(duì)比復(fù)墾后和未復(fù)墾土壤無機(jī)碳、微生物量碳和煤組分碳的含量，發(fā)現(xiàn)復(fù)墾后土壤無機(jī)碳和微生物量碳占比更高。DANGI等發(fā)現(xiàn)復(fù)墾后5～14 a為微生物群落恢復(fù)的最重要階段，但半干旱礦區(qū)土壤微生物需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能恢復(fù)到原水平。余健等研究發(fā)現(xiàn)高潛水位復(fù)墾土壤中全碳和有機(jī)碳含量均小于正常耕地。李奇超等研究發(fā)現(xiàn)高潛水位復(fù)墾土壤有機(jī)碳含量隨著復(fù)墾年限增加而不斷增加，且表層恢復(fù)率快于深層土壤。其外，有研究已經(jīng)認(rèn)識(shí)到微生物的重要催化作用，并將叢枝菌根應(yīng)用于礦山生態(tài)修復(fù)。然而，大多責(zé)任礦山不愿意投入而一般科研機(jī)構(gòu)又無力長(zhǎng)期投入資金，導(dǎo)致很難長(zhǎng)時(shí)序監(jiān)測(cè)復(fù)墾土壤質(zhì)量變化，有關(guān)礦區(qū)固碳微生物及固碳基因的研究極少，無法彌補(bǔ)復(fù)墾土壤演化及調(diào)控知識(shí)缺失的鴻溝。

當(dāng)前東部礦區(qū)面臨生態(tài)修復(fù)、糧食安全和固碳增匯等多重壓力，從分子生態(tài)學(xué)視角研究微生物介導(dǎo)的土壤碳固定過程及響應(yīng)機(jī)制，既可改善土壤肥力、保障糧食安全，又提升生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)、固碳增匯。為此，筆者選擇山東鄒城東灘礦3個(gè)復(fù)墾年限和1個(gè)對(duì)照為對(duì)象，利用高通量測(cè)序和Geochip分析，揭示東部礦區(qū)復(fù)墾土壤固碳菌群隨復(fù)墾時(shí)間的演化，探索占主導(dǎo)地位的固碳菌群及與其環(huán)境因子間相互作用和機(jī)制，為科學(xué)評(píng)估復(fù)墾土壤質(zhì)量演變和固碳增匯能力提供新見解。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)

研究區(qū)位于山東鄒城東灘礦復(fù)墾區(qū)(35.14°N～35.55°N，116.78°E～117.48°E；2000大地坐標(biāo)系)。該區(qū)屬于暖溫帶季風(fēng)氣候，年均降雨量為777.1 mm，年均氣溫為14.1 ℃。土壤類型為棕色潮土，含砂粒22.3%(>0.02 mm)、粉土65.9%(0.020～0.002 mm)和黏粒11.8%(<0.002 mm)。土壤密度為1.48 g/cm。2002年、2005年和2011年，采用煤矸石充填、表土回填，再機(jī)械壓實(shí)分3次治理塌陷區(qū)，一般充填200～400 cm，表土回填深度為80 cm。依據(jù)不同的復(fù)墾時(shí)長(zhǎng)，分別記為R17(復(fù)墾17 a)、R14(復(fù)墾14 a)和R8(復(fù)墾8 a)，復(fù)墾后由農(nóng)業(yè)開發(fā)公司承包統(tǒng)一種植，小麥和大豆輪作，一年兩熟，小麥單季施常規(guī)復(fù)合肥600 kg/hm作底肥，撥節(jié)時(shí)施氮肥150 kg/hm，機(jī)械化收割時(shí)留茬高20～25 cm。大豆單季施量常規(guī)復(fù)合肥450 kg/hm作底肥，機(jī)械化收割時(shí)自動(dòng)粉碎還田。筆者選擇的樣地除復(fù)墾年限不同外，地形、氣候、成土母質(zhì)、耕作和施肥等管理方式完全一致，形成一個(gè)完善的復(fù)墾時(shí)間序列。

1.2 土壤樣品采集與前處理

2019-05-04,采用隨機(jī)采樣方法，從每塊復(fù)墾區(qū)各采集15個(gè)表層土壤樣本(即地面以下0～10 cm)。此外，從復(fù)墾區(qū)域附近選取3塊未受采礦活動(dòng)破壞的農(nóng)田采集15個(gè)表層土壤樣品用作對(duì)照(CK)，且其與復(fù)墾樣地耕作和施肥管理方式一致。土壤取回后，除去植物根系、礫石等雜質(zhì)，并將土樣充分混合均勻后分為2份:一份在室溫下風(fēng)干，均質(zhì)化后過2 mm篩，用來測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)和部分土壤酶活性；另一份未經(jīng)處理的新鮮土壤子樣本，保存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能基因分析及部分土壤酶活性測(cè)定。

1.3 樣品測(cè)試

土壤pH值(水土質(zhì)量比5∶1)用數(shù)字酸度計(jì)(PHC-3C，上海雷磁)測(cè)定；有機(jī)碳(SOC)采用重鉻酸鉀-比色法測(cè)定；微生物碳(MBC)的測(cè)試方法為氯仿熏蒸-浸提法；溶解性有機(jī)碳(DOC)采用TOC自動(dòng)分析法測(cè)定(總有機(jī)碳分析儀，日本島津)；易氧化有機(jī)碳(EOOC)采用333 mmol/L KMnO氧化法測(cè)定。多酚氧化酶(PPO)活性采用鄰苯三酚比色法測(cè)定，以培養(yǎng)2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的毫克數(shù)表示；β-葡萄糖苷酶(BG)活性采用硝基酚比色法測(cè)定，以培養(yǎng)1 h后1 g土壤中的對(duì)硝基酚的微克數(shù)表示；過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，以1 g土壤1 h內(nèi)消耗0.02 mol/L KMnO的體積表示。

1.4 高通量測(cè)序和Geochip分析

使用Fast DNA SPIN kit(MP Biomedicals，美國(guó))，并遵循試劑盒說明，從-20 ℃冷藏的60個(gè)新鮮土樣中提取DNA，使用NanoDrop one測(cè)定DNA濃度和純度。引物515F(5′-GTGCCAGCCGGTAA-3′)和907R(CCGTCAATTCMTTRAGTT)用來擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4-V5區(qū)域。PCR反應(yīng)使用BioRad S1000儀器(伯樂，美國(guó))進(jìn)行。50 μL的PCR混合物含有25 μL Taq復(fù)合物、每個(gè)引物1 μL(10 M)和3 μL DNA模板(20 ng/μL)。PCR擴(kuò)增程序如下：① 94 ℃ 5 min初始化；② 30個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s變性，52 ℃ 30 s退火， 72 ℃ 30 s延伸；③ 72 ℃ 10 min最終延伸。利用 GeneTools Analysis Software(Version4.03.05.0，SynGene)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度對(duì)比后，按照等質(zhì)量原則計(jì)算各樣品所需體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。使用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。按照NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫(kù)操作。使用Illumina Hiseq2500 平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行PE250測(cè)序(美格基因，廣州)。

測(cè)序數(shù)據(jù)采用Trimmomatic軟件(V0.33，http://www.usadellab.org/)分別對(duì)雙端的Raw Reads數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，再利用FLASH(V1.2.11，https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)軟件對(duì)每對(duì)PE reads進(jìn)行拼接，將成對(duì)的reads拼成1條序列。根據(jù)每條序列首尾兩端的barcode和引物信息等，利用Mothur軟件(V1.35.1，http://www.mothur.org)將序列分配至對(duì)應(yīng)樣品，最終取得有效的拼接片段。利用usearch軟件(V10，http://www.drive5.com/usearch/)對(duì)所有的拼接片段進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%一致性將序列聚類成為操作分類單元(OTU，Operational Taxonomic Units)。并用usearch剔除嵌合體和singleton序列，然后注釋代表性序列(Silva，https://www.arb-silva.de/)。

Geochip分析需要先提取土壤微生物總DNA/RNA，并按要求檢測(cè)總量及純度等，合格核酸樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記、雜交、檢測(cè)(美格基因，廣州)。使用ImaGene 6.0軟件(http://www.image-net.org/)轉(zhuǎn)換探針信號(hào)，按質(zhì)控要求提取raw_data，并對(duì)raw_data進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化取得normalized_data，再將normalized_data中每個(gè)基因?qū)?yīng)的所有信號(hào)強(qiáng)度匯總為基因信號(hào)強(qiáng)度norm_gene_intensity。固碳基因信號(hào)強(qiáng)度代表固碳基因相對(duì)豐度，一定程度上反映了物種的固碳潛力。最后，按raw_data分別統(tǒng)計(jì)功能大類(Gene_category)、功能亞類(Sub_category)和基因(Gene)3個(gè)類別探針檢出數(shù)及信號(hào)強(qiáng)度，繪制功能基因柱形圖。16S rRNA原始序列數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)為PRJNA674491。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0 軟件(IBM，美國(guó))對(duì)土壤理化、酶活性、豐度進(jìn)行單因素方差(ANOVA)和T-檢驗(yàn)，利用Origin 9.0軟件(Origin Lab，美國(guó))繪制土壤固碳菌群功能基因豐度圖，小提琴圖和 相關(guān)性熱圖在Hiplot平臺(tái)(https://hiplot.com.cn/)上傳數(shù)據(jù)后運(yùn)算獲得。利用Amos7.0軟件擬合結(jié)構(gòu)方程模型(SEM，Structural Equation Model)分析土壤理化、酶活性、固碳基因信號(hào)強(qiáng)度及相關(guān)固碳菌門豐度等變量之間關(guān)系。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析參照文獻(xiàn)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)墾年限下土壤部分理化性狀和酶活性變化特征

圖1中，土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨復(fù)墾年限呈上升趨勢(shì)，R17中SOC已高于CK，但與CK無顯著差異。復(fù)墾土壤溶解性有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于CK，并與CK呈極顯著性差異(<0.001)。土壤微生物量碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨復(fù)墾年限持續(xù)增長(zhǎng)且呈極顯著性差異(<0.001)，R8中MBC質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為CK一半，但R17已遠(yuǎn)高于CK(<0.001)。土壤易氧化性有機(jī)碳含量隨復(fù)墾年限升高，略高于CK，但不同處理組間無顯著差異。復(fù)墾土壤pH呈弱堿性，與CK呈極顯著性差異(<0.001)，pH隨復(fù)墾年限先升后降，但不同復(fù)墾年限差異不顯著。土壤β-葡萄糖苷酶活性隨復(fù)墾年限不斷提高，均高于CK。R17中BG活性最高，且與CK呈顯著性差異(<0.01)。復(fù)墾土壤過氧化氫酶活性均高于CK，且與CK呈顯著性差異(<0.001)。復(fù)墾年限對(duì)土壤多酚氧化酶活性影響顯著，R17 PPO活性極顯著高于CK(<0.001)。

2.2 不同復(fù)墾年限下土壤固碳功能基因和相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)特征

卡爾文循環(huán)涉及的FBP_aldolase，F(xiàn)BPase，GAPDH_Calvin，PRI，TIM，pgk，tktA，rubisco和PRK等固碳基因信號(hào)強(qiáng)度隨復(fù)墾年限增加略有上升(圖2(a))，R17除FBPase信號(hào)強(qiáng)度稍高于CK外，其他信號(hào)強(qiáng)度與CK相近，無顯著差異。厭氧乙酰輔酶 A途徑涉及的fthfs固碳基因信號(hào)強(qiáng)度R17已高于CK，但并無顯著性差異。細(xì)菌小體涉及的CsoS1_CcmK和ccmL固碳基因信號(hào)強(qiáng)度也隨復(fù)墾年限增加略有上升，R17年與CK持平，無顯著性差異。相關(guān)性熱圖分析顯示：R8和R14所有固碳基因信號(hào)強(qiáng)度顯著弱于CK和R17(圖2(b))。R17和CK的固碳基因信號(hào)強(qiáng)度十分接近，表明微生物固碳潛力隨著復(fù)墾時(shí)間增加而增加。

土壤SOC主要源于微生物固碳及其殘?bào)w，土壤固碳基因信號(hào)強(qiáng)度越大，表明菌群在單位質(zhì)量土壤中豐度越高，固碳潛力也越大。依據(jù)Geochip分析結(jié)果推測(cè)：固碳菌主要分布于4種富集菌門和2種稀有菌門中。富集菌門包括酸桿菌門()、放線菌門()、擬桿菌門(Bacteroidetes)、和變形菌門(Proteobacteria)。稀有菌門包括藍(lán)細(xì)菌()和厚壁菌門()。其中：CsoS1_CcmK和ccmL基因多分布于藍(lán)細(xì)菌()、厚壁菌門()和變形菌門()，F(xiàn)BP_aldolase,FBPase,GAPDH_Calvin,PRI,TIM,pgk,tktA,rubisco和PRK多集中于藍(lán)細(xì)菌()和變形菌門()，fthfs則主要分布于擬桿菌門()、厚壁菌門()和變形菌門()，少數(shù)分布于酸桿菌門()和放線菌門()。

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；**在0.01水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；***在0.001水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；ns代表無相關(guān)性圖1 不同復(fù)墾年限下土壤理化和酶活性的變化Fig.1 Change in soil properties and soil enzyme activities with different reclamation ages

圖3中，高通量測(cè)序結(jié)果表明：復(fù)墾土壤中酸桿菌門()豐度均高于CK，且呈極顯著性差異(<0.001)，但不同復(fù)墾年限無顯著差異。放線菌門()豐度隨復(fù)墾年限增加呈先上升再下降的趨勢(shì)，始終高于CK，但無顯著性差異。擬桿菌門()豐度變化趨勢(shì)與放線菌門相似，但始終低于CK，且呈顯著性差異(<0.01)。藍(lán)細(xì)菌()、厚壁菌門()和變形菌門()豐度隨復(fù)墾年限呈不同的變化趨勢(shì)，但豐度始終顯著低于CK(<0.01)。盡管固碳基因所屬菌門豐度差異大，但固碳基因信號(hào)強(qiáng)度并無顯著差異，表明物種和功能基因豐度并不存在直接正向關(guān)系。

注：不同字母表示顯著差異 (P<0.05)圖2 不同復(fù)墾年限下土壤固碳功能基因特征變化Fig.2 Variation of soil carbon-fixing functional genes with different reclamation ages

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；**在0.01水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；***在0.001水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；ns代表無相關(guān)性圖3 不同復(fù)墾年限下土壤固碳相關(guān)微生物豐度變化Fig.3 Variation of soil carbon-fixing related microbial ahundances with different reclamation ages

2.3 土壤固碳基因與理化、酶活性的相關(guān)關(guān)系

土壤固碳基因與理化、酶活性的相關(guān)性分析表明：R8(圖4(a))中變形菌門()與DOC呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，但與BG酶活性呈顯著正相關(guān)(<0.05)。R14(圖4(b))中放線菌門()和厚壁菌門()與BG酶活性顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，擬桿菌門()和藍(lán)細(xì)菌門()與PPO酶活性呈顯著性正相關(guān)(<0.01)。

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)；**在0.01水平(雙側(cè))上 顯著性相關(guān)；***在0.001水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)圖4 土壤固碳基因、菌門與理化、酶活性相關(guān)性熱圖。Fig.4 Correlations between carbon-fixing microbial gene and phyla and soil characteristics with different reclamation ages

R17(圖4(c))中放線菌門()與PPO酶活性顯著正相關(guān)，而擬桿菌門()與MBC酶活性顯著正相關(guān)(<0.05)。CK(圖4(d))中厚壁菌門()與PPO酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.001)，并與酸桿菌門()相似，與pH呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)；放線菌門()則與EOOC酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。上述結(jié)果表明：不同處理固碳基因與理化、酶活性的相關(guān)性區(qū)別較大。復(fù)墾土壤BG和PPO酶活性作用大，DOC，MBC和一些固碳基因也有相關(guān)性。但CK土壤PPO，EOOC酶活性和pH與一些固碳基因關(guān)系緊密。

2.4 不同環(huán)境因子對(duì)土壤固碳能力的貢獻(xiàn)

圖4刻畫了不同環(huán)境因子與土壤固碳基因和菌門之間關(guān)系，但無法估算對(duì)土壤固碳能力的貢獻(xiàn)，為此引入結(jié)構(gòu)方程模型進(jìn)行擬合分析，R8,R14和CK通過檢驗(yàn)，取得3個(gè)模型結(jié)構(gòu)且具有一定的差異性。圖5(a)顯示：R8中pH直接改變了PPO酶活性，從而引起變形菌門()豐度變化，并呈顯著負(fù)相關(guān)。固碳基因PRK和變形菌門()分別負(fù)向作用于土壤DOC含量，土壤BG酶活性直接極顯著正向作用于變形菌門()，放線菌門()直接極顯著正向作用于固碳基因tktA，而厚壁菌門()直接極顯著負(fù)向作用于固碳基因pgk。

圖5(b)顯示,R14土壤MBC含量直接正向作用于PPO酶活性，同時(shí)負(fù)向作用于固碳基因FBP_aldolase。土壤BG酶活性直接負(fù)向作用于固碳基因pgk和FBP_aldolase，CAT酶活顯著正向作用于固碳基因FBPase，而放線菌門()則直接反向作用于固碳基因PRK；R17中放線菌門()與PPO酶活性呈正相關(guān)關(guān)系，F(xiàn)BP_aldolase與變形菌門()呈正相關(guān)關(guān)系，并與SOC，pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但并未構(gòu)成結(jié)構(gòu)關(guān)系。

圖5(c)則顯示一個(gè)完整的3層遞進(jìn)關(guān)系，pH直接負(fù)向作用于PRI，并正向影響CAT酶活性再間接負(fù)向作用于PRI。此外，pH還直接正向作用于tktA。土壤EOOC直接負(fù)向作用于放線菌門()，并進(jìn)一步間接正向作用于FBPase和PRK，EOOC還直接負(fù)向作用于固碳基因pgk和正向作用于土壤PPO酶活性?？梢哉J(rèn)為，復(fù)墾改變礦區(qū)土壤pH，操控，調(diào)控土壤理化和酶活性，從而影響微生物區(qū)系發(fā)育，并最終介導(dǎo)土壤碳循環(huán)和固碳能力。

為了進(jìn)一步研究環(huán)境因子，固碳基因和固碳菌門之間的互作關(guān)系，選取4種富集和2種稀有菌門的相對(duì)豐度前10的OTU與土壤環(huán)境因子進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作。就網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系而言，3個(gè)復(fù)墾網(wǎng)絡(luò)與對(duì)照網(wǎng)絡(luò)相比，富集菌門(紅色)未出現(xiàn)顯著變化，且具有較多連接度較高的OTUs(圖6)。稀有菌門呈現(xiàn)顯著性變化(<0.05)，尤其R14樣地，稀有菌門OTUs連接度較低，且較少。黃色代表的固碳基因在復(fù)墾樣地的互作網(wǎng)絡(luò)中連接度高于對(duì)照網(wǎng)絡(luò)。環(huán)境因子(熒光藍(lán)色)在R17網(wǎng)絡(luò)中的連接度較高，且R17網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更接近于對(duì)照樣地網(wǎng)絡(luò)，這些結(jié)果可能說明長(zhǎng)時(shí)間復(fù)墾活動(dòng)增強(qiáng)了固碳稀有菌門、固碳基因和環(huán)境因子之間的互作關(guān)系。就環(huán)境適應(yīng)性而言，固碳菌群中，多數(shù)富集菌種與部分稀有菌種可視為土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)菌種，或可助力東部平原礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)。

注：紅色代表負(fù)相關(guān)，藍(lán)色代表正相關(guān)。*在0.05水平(雙側(cè)) 上顯著性相關(guān)；**在0.01水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)； ***在0.001水平(雙側(cè))上顯著性相關(guān)。箭頭上的數(shù) 值代表標(biāo)準(zhǔn)通徑系數(shù)，箭頭粗細(xì)代表相關(guān)性高低。 紅色箭頭表示顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，藍(lán)色箭頭 表示顯著正相關(guān)(P<0.05)，虛線箭頭表示無顯 著影響。R2表示通徑解釋度；χ2為 卡方檢驗(yàn)中的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量；df表示自由度；P表示 相關(guān)水平；IGF表示擬合優(yōu)度指數(shù)；RMSEA表示近似誤差均方根。圖5 土壤理化酶活與土壤固碳菌門和基因的相關(guān)結(jié)構(gòu)Fig.5 Structural equation model between carbon-fixing microbial gene and phyla and soil characteristics with different reclamation ages

圖6 富集和稀有菌門相對(duì)豐度前60 土壤環(huán)境因子分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Molecular ecological networks of the TOP 60 OTUs of abundant and rare bacterial phyla，and soil physicochemical properties

3 討 論

土壤固碳能力依賴于固碳菌群、作物生物量和還田率。隨著復(fù)墾年限越長(zhǎng)，作物量根系和凋落物進(jìn)入土壤越多，有機(jī)肥或化肥輸入也越多，外源碳源逐年增加。與此同時(shí)，微生物殘?bào)w、作物凋落物、根系及分泌物等分解轉(zhuǎn)化后形成腐殖質(zhì)，促進(jìn)土壤團(tuán)聚體形成和土壤生物地球化學(xué)過程，亦可能促進(jìn)固碳功能，引發(fā)更高的碳固持效應(yīng)，進(jìn)而有利于碳積累。本文中，經(jīng)過長(zhǎng)期合理耕作，復(fù)墾土壤樣地R17中SOC含量已高于CK，MBC含量顯著地高于CK，表明復(fù)墾土壤碳不斷累積，已形成高的碳固持能力。土壤SOC和MBC含量隨復(fù)墾年限呈上升趨勢(shì)(圖1)，與CHAUDHURI等研究結(jié)果一致，說明長(zhǎng)時(shí)間復(fù)墾對(duì)SOC和MBC積累具有積極作用。復(fù)墾土壤DOC含量顯著高于CK，隨復(fù)墾年限呈先降后升趨勢(shì)。表層土壤DOC受淋洗向下遷移，復(fù)墾打亂土壤層次，造成復(fù)墾土壤DOC含量顯著高于CK。此外，pH值亦影響DOC含量。在弱堿性條件下，DOC中酸性部分易與鈣鎂離子發(fā)生中和反應(yīng)，導(dǎo)致DOC含量變化。王金滿等研究表明，復(fù)墾活動(dòng)可以改善土壤質(zhì)量，且隨復(fù)墾時(shí)間增加，土壤質(zhì)量不斷接近原生環(huán)境。JACINTHE和LAL研究表明，常規(guī)耕作方式下復(fù)墾土壤碳庫(kù)恢復(fù)需要50 a，甚至更久時(shí)間。這與本文研究結(jié)果迥然不同，主要?dú)w結(jié)于前者的自然條件差、氣候干燥，常規(guī)耕作為大田機(jī)械化+化肥+種植玉米。本研究區(qū)自然本底好、雨水較多，且農(nóng)業(yè)投入大，田間管理好，所以不足20 a土壤SOC恢復(fù)正常平衡。

土壤中碳與養(yǎng)分元素含量與可利用性影響土壤微生物豐度與活性，而土壤微生物又通過調(diào)整自身群落結(jié)構(gòu)和胞外酶分泌，反饋調(diào)控土壤元素循環(huán)過程。微生物自身可通過分泌胞外酶將土壤中復(fù)雜化合物降解為水溶性小分子，供自身和作物生長(zhǎng)代謝。圖1中長(zhǎng)時(shí)間復(fù)墾改變土壤中可溶性有機(jī)碳含量，導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)改變(圖3)，進(jìn)而改變部分土壤酶活性(圖1)。BG可將難利用的復(fù)雜多糖降解為單糖，成為植物和微生物營(yíng)養(yǎng)最重要來源。圖1中顯示BG酶活性隨復(fù)墾年限持續(xù)增加，說明復(fù)墾和持續(xù)耕作不斷改善土壤微生物環(huán)境，提升微生物生物量，而此時(shí)土壤中的可利用碳源已無法滿足微生物生長(zhǎng)需求，其自身只能分泌更多胞外酶，催化降解底物為養(yǎng)分和能量，從而促進(jìn)土壤碳氮循環(huán)。PPO是腐殖質(zhì)化的重要媒介，參與芳香族化合物的轉(zhuǎn)化作用。它與DOC含量相呼應(yīng)，同步增長(zhǎng)，為微生物和植物提供更多的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(圖1)。復(fù)墾土壤CAT顯著高于CK(圖1)，說明地表塌陷造成農(nóng)田環(huán)境惡化，復(fù)墾可增加CAT酶活性，加速分解HO等有害物質(zhì)，從而促進(jìn)土壤中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化，為農(nóng)作物生長(zhǎng)和微生物生存提供良好的環(huán)境。

微生物在幾乎所有生態(tài)過程中扮演著不可或缺的角色，尤其是養(yǎng)分循環(huán)。這些過程主要依賴不同類群的多樣化功能，其中固碳能力歸結(jié)于一類以CO為碳源的自養(yǎng)微生物。它們還可利用SOC作為碳源，分解后產(chǎn)生的CO亦可再次利用。農(nóng)作物凋落物降解后可為固碳菌提供碳源，可轉(zhuǎn)化為土壤碳庫(kù)。長(zhǎng)時(shí)間復(fù)墾后，圖2,3中固碳基因和相關(guān)固碳微生物菌門增加，復(fù)墾土壤固碳潛力增加，這在一定程度上表明復(fù)墾田塊上的長(zhǎng)時(shí)間農(nóng)業(yè)耕作，亦影響土壤中微生物CO同化功能基因，提升表層微生物的碳同化能力。土壤微生物光合固碳作用往往只發(fā)生表層土壤(0～1 cm)中，表層獲得同化碳后，可以向地下傳輸，為下層微生物提供必要的碳源和電子供體，從而激發(fā)誘導(dǎo)更多微生物參與碳同化過程。有學(xué)者研究得知，不同耕作方式和土地利用可以顯著影響稻田土壤中自養(yǎng)微生物的CO同化能力和碳同化關(guān)鍵酶RubisCO酶活性，而RubisCO酶是由固碳基因rubisco表達(dá)。土壤固碳功能基因豐度可能是表征土壤微生物固碳能力的敏感性指標(biāo)。

圖4顯示復(fù)墾土壤中固碳相關(guān)菌門僅有酸桿菌門()和放線菌門()豐度大于CK，但復(fù)墾土壤固碳基因信號(hào)強(qiáng)度卻大致相當(dāng)，尤其是R17與CK無顯著性差異，且高于R8年和R11。這表明復(fù)墾時(shí)間對(duì)固碳菌群的組成和功能基因的影響并不相同，主要?dú)w結(jié)于隨復(fù)墾年限增加，凋落物和根系及分泌物不斷積累，改變了土壤基本性狀，從而影響微生物區(qū)系發(fā)育，再操控了固碳功能基因豐度。先前有研究發(fā)現(xiàn)GeoChip分析檢測(cè)到功能基因信號(hào)強(qiáng)度與環(huán)境養(yǎng)分含量顯著性相關(guān)，這與本研究結(jié)果完全一致。pH一直被認(rèn)為是控制細(xì)菌組成的關(guān)鍵因子，本研究多數(shù)固碳菌類群和固碳基因與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，也證實(shí)礦區(qū)復(fù)雜環(huán)境下微生物演化仍遵循一般規(guī)律。此外，下層充填煤矸石中含有的重金屬離子被季節(jié)性潛水位變化帶到上層土壤，隨復(fù)墾年限增加，pH下降，重金屬活性發(fā)生改變亦影響微生物結(jié)構(gòu)與組成。酸桿菌門在礦山土壤酸化生態(tài)過程起重要作用，并廣泛分布于各種惡劣的自然環(huán)境中。復(fù)墾樣本中酸桿菌門豐度變化與pH值存在相關(guān)性，而酸桿菌門相對(duì)豐度并沒隨pH值增加而下降，說明土壤中酸酐菌門變化可能調(diào)節(jié)了pH變化。與堿性土有較大親和力的放線菌門豐度增長(zhǎng)，同樣影響復(fù)墾樣地pH值變化。而pH是調(diào)節(jié)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐富度的最重要參數(shù)，土壤酸堿度改變會(huì)影響微生物群落生長(zhǎng)。

環(huán)境因子通常借助調(diào)控微生物結(jié)構(gòu)與功能來間接影響土壤碳庫(kù)變化，豐富的碳源可滿足微生物生長(zhǎng)。因此，SOC往往與固碳相關(guān)的菌群豐度呈正相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果相一致(圖4)。復(fù)墾土壤中固碳相關(guān)菌門豐度與BG,MBC和PPO酶活性呈顯著正相關(guān)(<0.05)，多數(shù)固碳基因與MBC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。但CK中PPO,BG,pH和EOOC與固碳菌群豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這反映了固碳菌對(duì)土壤環(huán)境變化的敏感性。一些研究認(rèn)為，參與固碳的菌群組成和豐度與土壤類型、環(huán)境因子等顯著性相關(guān)。本研究中富集菌門放線菌門()和變形菌門()，稀有菌門厚壁菌門()等與DOC,MBC,PPO和BG呈顯著相關(guān)(<0.05)(圖5,6)。6種固碳基因亦與DOC,MBC,EOOC直接相關(guān)，且部分顯著性相關(guān)，說明復(fù)墾土壤中碳源是影響固碳菌群組成和基因豐度的最主要因子，這與干旱區(qū)研究結(jié)果完全不同。主要應(yīng)與東部平原礦區(qū)水分充足，其他因子未受限制有關(guān)。不同環(huán)境因子對(duì)微生物群落組成和功能基因豐度的影響十分復(fù)雜，可能相互抵消或協(xié)同，從而掩蓋了環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)之間的真實(shí)關(guān)系。

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析可揭示土壤微生物菌屬間相互作用。圖6中網(wǎng)絡(luò)特征顯示微生物組間相互作用以及所涉及物種變化，尤其是富集和稀有菌門的變化。群落的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)其生態(tài)功能的重要因素，網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性較高時(shí)，易對(duì)生物地球化學(xué)功能產(chǎn)生正面影響，進(jìn)而使得微生物群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。復(fù)墾網(wǎng)絡(luò)中存在一些蜂窩特征，有效地促進(jìn)不同物種間的溝通并提升對(duì)采礦干擾的響應(yīng)能力。隨著復(fù)墾時(shí)長(zhǎng)的增加，網(wǎng)絡(luò)亦趨于復(fù)雜且連接更加緊密，具備更高的干擾耐受性。未來應(yīng)持續(xù)關(guān)注農(nóng)田MBC，PPO及外來碳源輸入，操控并調(diào)節(jié)固碳菌類群和固碳基因豐度，促進(jìn)復(fù)墾土壤固碳潛力，提升礦區(qū)生態(tài)碳匯功能。

4 結(jié) 論

(1)復(fù)墾年限顯著地影響了土壤pH，DOC，MBC，BG和CAT酶活性的變化。

(2)復(fù)墾年限顯著地影響了固碳相關(guān)菌門的豐度，如酸桿菌門()、擬桿菌門()、藍(lán)細(xì)菌()、厚壁菌門()和變形菌門()，但不同處理組12種固碳基因的信號(hào)強(qiáng)度并無顯著差異。

(3)復(fù)墾土壤固碳相關(guān)菌門和功能基因豐度與土壤pH，DOC，MBC，PPO，BG酶活性等呈顯著相關(guān)(<0.05)。尤其與碳源的相關(guān)性，為操控環(huán)境因子從而改變富集和稀有固碳菌門及其功能基因豐度，提升農(nóng)田固碳潛力提供理論依據(jù)。