高粱抗性淀粉輔助治療胃癌的研究

南姝利 尚世龍 曾憲鵬 南喜平

摘要：高粱抗性淀粉對于多種疾病有治療作用，通過體內(nèi)及體外試驗(yàn)共同驗(yàn)證其輔助抑制腫瘤增殖的作用，評價高粱抗性淀粉與羅米地辛聯(lián)合應(yīng)用對胃癌的治療作用。結(jié)果表明，在體內(nèi)試驗(yàn)中，羅米地辛組腫瘤抑制率為34.6%，高粱抗性淀粉+羅米地辛組腫瘤抑制率為44.1%，高粱抗性淀粉+羅米地辛組對裸鼠腫瘤組織的增殖速度抑制更加明顯;在體外試驗(yàn)中，抗性淀粉+羅米地辛模型組與羅米地辛組相比同樣表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的能力，2組藥物將SGC-7901細(xì)胞周期阻滯在G1期，其機(jī)制是通過降低腫瘤細(xì)胞中STAT5A、cyclin-D1蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。綜合以上結(jié)果可以推斷高粱抗性淀粉可增強(qiáng)羅米地辛抑制胃癌增殖的作用，達(dá)到輔助治療胃癌的目的。

關(guān)鍵詞：高粱抗性淀粉;羅米地辛;胃癌;腫瘤增殖

中圖分類號： R735.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0168-05

收稿日期：2021-08-20

基金項(xiàng)目：吉林省科學(xué)技術(shù)廳技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（編號：20190301066NY）;長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號：2020KJ002）。

作者簡介：南姝利（1989—），女，吉林公主嶺人，碩士，講師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制及治療藥物研究。E-mail：597616988@qq.com。

通信作者：南喜平，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail：xpnan001@163.com。

高粱是我國重要的糧食作物之一，其不但具有很高的食用價值，同時兼具藥用價值。中醫(yī)認(rèn)為高粱性味甘平、微寒，有和胃健脾、消積、清熱利濕、活血散瘀、解毒消癰等功效[1-2]。因此，我國古往今來都有利用高粱治療腹瀉[3]、消化不良[4]等疾病的例子。隨著人們對飲食健康重視程度的不斷增高，高粱制品走上了越來越多人的餐桌，人們對高粱的研究也更加深入，其新的藥用價值也被慢慢發(fā)覺。研究表明，高粱可用于治療慢性疾病，如高血壓、高血脂[1]、糖尿病[5]，對絕經(jīng)肥胖[6]、腫瘤[7]等疾病也有治療作用。高粱中的有效成分有很多，主要包括多酚類化合物、植物甾醇、甘蔗脂肪醇、淀粉等，通過前期對高粱淀粉的研究表明，高粱淀粉依據(jù)其消化特點(diǎn)可以大致分為快速消化淀粉、慢速消化淀粉及抗性淀粉（resistant starch，RS）[8]。目前已有研究證明抗性淀粉對腸道腫瘤[9]、胰腺癌[10]、宮頸癌[11]等腫瘤的預(yù)防和治療具有一定作用。高粱抗性淀粉根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為4類，分別為RS1、RS2、RS3、RS4[12]，其總體特點(diǎn)是在腸道內(nèi)不易被消化分解，而是通過腸道微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌x產(chǎn)物排出體外。因此與給予其他類淀粉相比，機(jī)體攝入抗性淀粉后，會大大降低其轉(zhuǎn)化為葡萄糖進(jìn)入機(jī)體的機(jī)會。而腫瘤細(xì)胞的能量來源主要是葡萄糖，葡萄糖的含量直接影響腫瘤細(xì)胞的存活[13]。腫瘤內(nèi)葡萄糖減少可以有效阻斷腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，以致“餓死”腫瘤細(xì)胞[14]。由此可見，在腫瘤患者的飲食中添加高粱抗性淀粉制作的食物可以起到輔助治療腫瘤的作用。

消化系統(tǒng)腫瘤是影響人類健康的重大殺手之一，其中胃癌的發(fā)病率在我國更是極高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞洲國家的胃癌患者占全球胃癌患者的73%，而我國胃癌患者則占全球的50%[15]。目前臨床上用于胃癌治療的方法主要是通過手術(shù)，但遺憾的是并非所有人都可以通過手術(shù)的方式得到治療，部分患者需要使用藥物進(jìn)行治療，化療藥物的類型主要包括烷化劑類藥物、抗腫瘤抗生素、抗腫瘤激素類藥物、金屬鉑類藥物、抗代謝藥物、抗腫瘤植物藥、分子靶向藥物等[16]。這些藥物均有各自特點(diǎn)也有很多不良反應(yīng)，因此如何能夠找到更加安全、有效的抗腫瘤藥物或輔助治療藥物仍然是腫瘤治療的研究重點(diǎn)。

通過之前研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物羅米地辛具有明顯抑制腫瘤的作用，本試驗(yàn)于2020年10月至2021年8月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)觀察羅米地辛對胃癌增殖的抑制作用，同時對比聯(lián)合使用高粱抗性淀粉前后羅米地辛在胃癌治療中的作用，從而推斷高粱抗性淀粉在胃癌治療中是否具有輔助作用，為高粱抗腫瘤產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物與細(xì)胞 SPF級雄性BALB/c 裸小鼠30只，4周齡，體質(zhì)量（20±1） g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，恒溫、恒濕、無菌條件下飼養(yǎng)。SGC-7901細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅細(xì)胞庫購得。

1.1.2 試劑 高粱抗性淀粉實(shí)驗(yàn)室自制;羅米地辛購置于美國MCE公司;BCA 蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Cell Counting Kit-8試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購置于碧云天生物技術(shù)有限公司;DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國 Gibco公司;Anit-STAT5a 抗體、Anti-Cyclin D1抗體購于Abcam公司。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微鏡（奧林巴斯公司）;酶標(biāo)儀（瑞士TECAN集團(tuán)公司）;電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad中國公司）;超速冷凍離心機(jī)（貝克曼集團(tuán)有限公司）;細(xì)胞孵育箱（SANYO 公司）;流式細(xì)胞儀（Bio-Rad 中國公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 裸鼠胃癌模型制備及給藥 將培養(yǎng)瓶中SGC-7901細(xì)胞經(jīng)胰酶消化清洗后配制適量細(xì)胞懸液在每只裸鼠的肋部（右肋）皮下接種5×106個細(xì)胞，將30只裸鼠隨機(jī)分為3組，分別為對照組、羅米地辛組、高粱抗性淀粉+羅米地辛組。接種3 d后開始給藥，羅米地辛組、高粱抗性淀粉+羅米地辛組給予 1 mg/kg羅米地辛治療1次，對照組給予 20 mg/kg 的二甲基亞砜（DMSO）生理鹽水[17]。此外，為觀察高粱抗性淀粉對羅米地辛治療作用的影響，對照組和羅米地辛組裸鼠飼料中添加高粱淀粉，而高粱抗性淀粉+羅米地辛組裸鼠飼料中添加高粱抗性淀粉，根據(jù)文獻(xiàn)[18]，各組裸鼠飼料配比情況如表1所示。

1.3.2 腫瘤體積及抑制率的計(jì)算方法 接種腫瘤細(xì)胞后每隔3 d用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長、寬以計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算公式如下：體積=0.52×長軸×短軸2。

各組裸鼠給藥21 d后脫頸處死，剝離出腫瘤包塊后稱質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率計(jì)算公式如下：

腫瘤抑制率=對照組腫瘤質(zhì)量-給藥組腫瘤質(zhì)量對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥 將細(xì)胞培養(yǎng)分為3組：對照組、羅米地辛組、抗性淀粉+羅米地辛組。通過查閱文獻(xiàn)[19]，具體分組如表2所示。

1.3.4 給藥濃度及時間確定 為了確定羅米地辛的給藥劑量，通過查閱前期文獻(xiàn)，本試驗(yàn)按照梯度選取5個濃度：0、2、4、8、16 μg/L 作為初始給藥濃度，96孔板培養(yǎng)細(xì)胞孵育24 h后分別加入5個濃度藥物，通過Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，選擇細(xì)胞存活率介于70%～80%的濃度為給藥濃度。給藥濃度確定后再次鋪板孵育后給藥，給藥后0、6、12、24、48 h 5個時間點(diǎn)分別再次通過Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，同樣選擇細(xì)胞存活率介于70%～80%的時間點(diǎn)，選定給藥時間。

1.3.5 細(xì)胞增殖檢測 將培養(yǎng)瓶中SGC-7901細(xì)胞經(jīng)胰酶消化清洗后配制適量細(xì)胞懸液，均勻吸取0.5 mL細(xì)胞懸浮液加入24孔板的每個孔中，每組設(shè)置3個副孔，培養(yǎng)24 h后按照不同分組分別給藥。給藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7 d，1～7 d中每日分別收集每組細(xì)胞，通過Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，最后繪制7 d細(xì)胞增殖曲線。

1.3.6 細(xì)胞周期檢測 將培養(yǎng)瓶中SGC-7901細(xì)胞經(jīng)胰酶消化清洗后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，使用細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒按照使用說明分別加入試劑后，用錫紙包裹避光，放置于37 ℃細(xì)胞孵箱中孵育30 min，隨即放入冰盒避光保存。采用488 nm激發(fā)波長通過流式細(xì)胞儀檢測各組樣品細(xì)胞周期。

1.3.7 Western Blot 法分析蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)瓶中SGC-7901細(xì)胞經(jīng)胰酶消化清洗后配制適量細(xì)胞懸浮液，均勻吸取1 mL細(xì)胞懸浮液加入6孔板中，每組設(shè)置2個副孔，孵育24 h后分組給藥，按照給藥時間繼續(xù)培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基并清洗3次，刮下細(xì)胞提取蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒對各組樣品進(jìn)行蛋白定量，將定量后的樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交、顯影后觀察結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯著性差異采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組裸鼠胃癌組織增殖情況比較

腫瘤接種后檢查成瘤狀態(tài)，所有被接種裸鼠體內(nèi)均成瘤。觀察發(fā)現(xiàn)，成瘤裸鼠進(jìn)食情況、活動情況及精神狀態(tài)與未成瘤前無明顯差別。給藥過程中每隔 3 d 測量裸鼠皮下腫瘤長、寬，計(jì)算腫瘤體積后進(jìn)行記錄，最終繪制出各組裸鼠腫瘤體積增長曲線。如圖1所示，與對照組腫瘤體積相比，羅米地辛組和高粱抗性淀粉+羅米地辛組腫瘤體積均顯著降低（P<0.05）。給藥結(jié)束后剝離出腫瘤包塊，分組稱質(zhì)量后計(jì)算腫瘤抑制率。如表3所示，羅米地辛組腫瘤抑制率為34.6%，高粱抗性淀粉+羅米地組腫瘤抑制率為44.1%（P<0.05）。以上試驗(yàn)結(jié)果說明單獨(dú)給予羅米地辛以及高粱抗性淀粉聯(lián)合羅米地辛對于腫瘤增殖均有抑制作用，其中高粱抗性淀粉聯(lián)合羅米地辛對腫瘤增殖抑制作用更為顯著，高粱抗性淀粉對于羅米地辛的抗腫瘤作用起到增強(qiáng)作用。

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較

為確定羅米地辛的給藥劑量和給藥時間，通過Cell Counting Kit-8試劑盒檢測SGC-7901細(xì)胞存活率，最終確定羅米地辛給藥濃度為4 μg/L、給藥時間為24 h。為了驗(yàn)證高粱抗性淀粉和羅米地辛對胃癌細(xì)胞增殖的影響，本試驗(yàn)通過觀察各組細(xì)胞7 d內(nèi)的增殖情況進(jìn)行驗(yàn)證。按照試驗(yàn)分組觀察3組細(xì)胞1～7 d的增殖情況，并且通過Cell Counting Kit-8試劑盒進(jìn)行檢測。記錄數(shù)據(jù)后繪制7 d細(xì)胞增殖曲線，如圖2所示，羅米地辛組、抗性淀粉+羅米地辛組與對照組相比細(xì)胞增殖速度明顯減慢，且與時間呈正相關(guān)（P<0.05），抗性淀粉+羅米地辛組細(xì)胞增殖受抑制程度更為顯著。

2.3 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布比較

為了驗(yàn)證高粱抗性淀粉和羅米地辛是如何抑制SGC-7901增殖的，本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了3組細(xì)胞的細(xì)胞周期。如表4所示，對照組中G1、S、G2期的細(xì)胞百分比分別為41.22%、37.34%、16.31%。羅米地辛組G1、S、 G2期的細(xì)胞百分比分別為60.24%、21.43%、18.33%，抗性淀粉+羅米地辛組G1、S、G2期的細(xì)胞百分比分別為62.47%、20.30%、17.23%。羅米地辛組和抗性淀粉+羅米地辛組的G1期細(xì)胞百分比有所上升（P<0.05）;S期細(xì)胞百分比則有所降低（P<0.05），G2期細(xì)胞百分比略有上升，但不存在顯著差異。通過本試驗(yàn)可以說明羅米地辛可以將SGC-7901細(xì)胞周期阻滯在G1期，而高粱抗性淀粉可以起到輔助作用。

2.4 各組細(xì)胞中STAT5A、cyclin-D1蛋白的表達(dá)比較

通過上述體內(nèi)和體外試驗(yàn)，筆者所在課題組明確了羅米地辛對胃癌增殖具有抑制作用，高粱抗性淀粉可以增強(qiáng)羅米地辛的作用。為進(jìn)一步明確羅米地辛在抑制胃癌增殖的過程中影響了哪些蛋白的表達(dá)，筆者所在課題組進(jìn)行了蛋白表達(dá)量的檢測。STAT5A是STATs家族中的一員，它在乳腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中的表達(dá)升高[20]，能促進(jìn)腫瘤增殖，其下游cyclin-D1同樣對腫瘤增殖有促進(jìn)作用[21]。通過Western Blot 試驗(yàn)檢測3組細(xì)胞中STAT5A、cyclin-D1蛋白表達(dá)情況，如圖3所示，羅米地辛組中STAT5A和cyclin-D1的表達(dá)均極顯著低于對照（P<0.01），抗性淀粉+羅米地辛組中2種蛋白表達(dá)與對照組相比降低更為明顯（P<0.01）。說明高粱抗性淀粉聯(lián)合羅米地辛對胃癌增殖的抑制作用是通過調(diào)控STAT5A、cyclin-D1的表達(dá)而發(fā)揮的。

3 討論與結(jié)論

在腫瘤發(fā)病率日趨升高的今天，人們沒有一刻停止對于腫瘤發(fā)生機(jī)制的探索，在我國胃癌作為一個惡性程度高、發(fā)病率高的腫瘤[22]，更加受到各界關(guān)注。研究胃癌的發(fā)生機(jī)制、治療藥物以及輔助治療藥物對于臨床開展胃癌治療具有積極意義。

羅米地辛是2011年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的抗腫瘤藥物，其對乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤都有較好的抑制作用[23]。本研究通過檢測給予羅米地辛前后裸鼠腫瘤增殖情況和SGC-7901細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期變化驗(yàn)證了羅米地辛對胃癌增殖具有顯著的抑制作用，此外還通過檢測細(xì)胞中STAT5A、cyclin-D1蛋白的表達(dá)情況推斷出羅米地辛抑制胃癌增殖可能與JAK2/STAT5信號通路相關(guān)。

高粱抗性淀粉是高粱中的有效成分，本研究通過體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)飼料中添加高粱抗性淀粉組的裸鼠與添加其他高粱淀粉組相比，在接受羅米地辛治療時腫瘤增殖速度降低更加明顯，這說明高粱抗性淀粉在羅米地辛治療胃癌時達(dá)到了輔助治療目的。

綜上所述，高粱抗性淀粉聯(lián)合羅米地辛可以更好地達(dá)到治療胃癌的目的，高粱抗性淀粉可以輔助治療胃癌，這為高粱產(chǎn)品的深加工與產(chǎn)品開發(fā)開辟了新的思路，同時也提供了理論依據(jù)。

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