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    希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白找尋及其生物信息學分析

    2022-04-01 15:25:08陳光建覃悅韓長志
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2022年5期
    關鍵詞:生物信息學

    陳光建 覃悅 韓長志

    摘要:希金斯炭疽菌是一種半活體營養(yǎng)型植物炭疽病原真菌,能夠侵染多種十字花科植物引起的炭疽病,特別是引起蔬菜炭疽病的重要病原。胞吞在真菌侵染植物過程中發(fā)揮著重要作用,該作用一般同具有NPFxD基序的蛋白受體介導有關,然而,目前有關該炭疽菌中胞吞作用相關蛋白尚未明確。基于前人已報道的構(gòu)巢曲霉中NPFxD蛋白序列,通過關鍵詞搜索以及Blastp比對等方法對希金斯炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行NPFxD蛋白找尋,明確該菌中存在2個NPFxD蛋白序列,根據(jù)蛋白同源性,分別命名為ChMYO1、ChGBP2。同時,對這2個蛋白序列開展了保守結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性、信號肽、亞細胞定位以及二級結(jié)構(gòu)等生物信息學分析。結(jié)果表明,ChMYO1、ChGBP2蛋白亞細胞定位情況不同,前者定位在質(zhì)膜,后者定位在核內(nèi);兩者在親疏水性、最高氨基酸殘基和其位置等均有著一定差異;兩者均無明顯的信號肽序列;兩者均含有無規(guī)則卷曲、α螺旋、β卷曲,而缺乏TM螺旋。此外,對多個不同真菌中NPFxD基序同源蛋白序列開展遺傳關系分析,明確希金斯炭疽菌中的NPFxD基序蛋白與炭疽菌屬中其他病菌中的蛋白具有較高的同源性,本研究為進一步研究炭疽菌屬NPFxD基序蛋白的功能提供了理論參考。

    關鍵詞:胞吞作用;希金斯炭疽菌;NPFxD基序蛋白;生物信息學

    中圖分類號: S436.3;S432.4+4文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2022)05-0035-06

    收稿日期:2021-06-08

    基金項目:云南省“興滇英才支持計劃”青年人才專項(編號:YNWR-QNBJ-2020-188);國家自然科學基金(編號:31960211)。

    作者簡介:陳光建(1987—),男,云南大理人,碩士研究生,從事資源利用與植物保護研究,E-mail:357053147@qq.com;共同第一作者:覃 悅(1992—),男,云南昆明人,碩士研究生,從事資源植物保護與利用研究,E-mail:453276403@qq.com。

    通信作者:韓長志,博士,教授,從事經(jīng)濟林木病害生物防治與真菌分子生物學研究。E-mail:hanchangzhi2010@163.com。

    希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc)是半活體營養(yǎng)型植物炭疽病原真菌,能夠侵染多種十字花科蔬菜引起炭疽病,是生產(chǎn)上危害蔬菜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病原菌[1]。前人研究主要集中在生物防治菌株篩選、外源酚酸類物質(zhì)對羥基苯甲酸(PHBA)控制進化轉(zhuǎn)化以及一些不同營養(yǎng)元素(氮、硅、鉀等)控制病害等方面[2]。近年來,隨著該菌全基因序列的公布[3],國內(nèi)外學者展開了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號路徑相關蛋白的研究,同時,筆者所在研究團隊前期也對該菌中的PITP[4]、RGS[5]、14-3-3[6]、septin[7]、AC[8]以及CAZymes等蛋白進行找尋及其生物信息學分析等研究工作[9]。此外,國內(nèi)諸多學者對該菌中的轉(zhuǎn)化子基因功能開展了研究[10-11]。對于希金斯炭疽菌在侵染十字花科植物過程中,上述效應分子或分泌蛋白如何發(fā)揮作用尚不清楚。前人研究發(fā)現(xiàn),胞吞(endocytosis)在生物細胞內(nèi)部和周圍環(huán)境之間進行信號通訊過程中發(fā)揮著重要作用[12]。不同生物可以釋放出一組不同的外膜囊泡,這些囊泡作為運輸載體,將效應分子和毒力因子傳遞給宿主細胞。囊泡的形態(tài)情況是通過各種蛋白質(zhì)模塊(復合物)的形成而實現(xiàn)[13],通過釀酒酵母中NPFxD基序蛋白突變試驗,明確Stex22p是實現(xiàn)物質(zhì)攝取的重要蛋白[14]。因此,推測NPFxD基序蛋白在希金斯炭疽菌侵染植物過程中具有重要的作用,特別是對于不同效應分子或分泌蛋白輸出到植物中具有重要的功能。

    本研究基于前人已報道的構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中NPFxD基序蛋白序列[15],利用關鍵詞搜索及同源序列比對等方法,在希金斯炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中開展序列找尋,同時,利用SMART、TMHMM以及Protscale、SignalP、TargetP等生物信息學分析軟件,明確該菌中NPFxD基序蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、信號肽以及亞細胞定位情況,此外,對不同真菌中與希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白同源蛋白序列開展遺傳關系分析,以期為進一步開展該菌中胞吞作用研究提供重要的理論基礎,也為進一步實現(xiàn)核桃炭疽病病菌相關胞吞蛋白研究提供重要的理論指導。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    構(gòu)巢曲霉中NPFxD基序蛋白myo5、gbp2的序列。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白找尋

    在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對“NPFxD”和“NPFxD-mediated endocytosis”等關鍵詞進行搜索,并以構(gòu)巢曲霉中NPFxD基序為參考,選擇默認的參數(shù)用Blastp進行比對分析,然后,在NCBI上明確該菌中NPFxD的蛋白登錄號等基本信息。

    1.2.2 保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預測

    利用SMART網(wǎng)站[16]對NPFxD基序蛋白中所具有的保守結(jié)構(gòu)域進行預測,利用TMHMM Server v. 2.0[17]和HMMTOP version 2.0[18]等分析跨膜結(jié)構(gòu)域。

    1.2.3 理化性質(zhì)分析

    根據(jù)Protscale[19]對NPFxD基序蛋白開展理化性質(zhì)分析。

    1.2.4 蛋白質(zhì)信號序列分析

    利用SignalP 5.0[20]開展蛋白信號肽預測;利用TargetP 1.1[21]明確蛋白的轉(zhuǎn)運肽。

    1.2.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

    利用PHD[22]預測程序明確蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成情況。

    1.2.6 亞細胞位置分析

    利用ProtComp v9.0[23]預測蛋白的亞細胞定位情況。

    1.2.7 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

    基于希金斯炭疽菌(C. higginsanum)中NPFxD基序蛋白序列,利用Blastp軟件進行同源序列比對,獲得不同真菌中同源蛋白序列,然后,利用ClustalX[24]軟件開展多重比對分析研究,再利用MEGA X[25]采用鄰近法構(gòu)建發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白找尋

    首先,利用EMBOSS fuzzpro軟件開展希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白序列的找尋[26],得到34條含有NPFxD的蛋白序列。然后,基于構(gòu)巢曲霉中NPFxD基序蛋白序列[27],利用Blastp比對已經(jīng)獲取的NPFxD基序蛋白開展比對分析,篩選得出共 1 177 條同源序列,同時,利用關鍵詞搜索,并未得到相關蛋白序列。對上述所獲得序列,進一步整合分析,并去除重復數(shù)據(jù)和對比篩選,結(jié)果表明,與構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)同源的C. higginsanum中含有NPFxD基序蛋白質(zhì)序列共2條(表1),其蛋白ID分別為CH063_04448、CH063_04465。根據(jù)同源序列相互關系的分析結(jié)果,將上述序列分別命名為ChMYO1、ChGBP2。

    2.2 保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預測

    對上述2個NPFxD基序蛋白開展保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果表明,ChMYO1含有MYSc保守結(jié)構(gòu)域,而ChGBP2含有RRM保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。進一步分析,MYSc結(jié)構(gòu)域作為ATP酶分子馬達,肌肉收縮由肌球蛋白和肌動蛋白之間的周期性相互作用組成,推測該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诎套饔玫膶崿F(xiàn)發(fā)揮著重要功能;RRM結(jié)構(gòu)域則是在許多已知的或應該結(jié)合單鏈RNA的真核蛋白質(zhì)都包含一個或多個拷貝的大約90個氨基酸的推定RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。同時,開展TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域分析,明確上述2個NPFxD基序蛋白均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域,而根據(jù)HMMTOP分析,明確ChMYO1具有1個跨膜結(jié)構(gòu)域,起始位置為71、終止位置為90。由于不同的跨膜結(jié)構(gòu)域預測軟件所的結(jié)果不盡相同,有待于進一步通過試驗驗證得以明確。

    2.3 亞細胞定位分析

    對C. higginsanum中NPFxD基序蛋白進行亞細胞定位分析,結(jié)果表明,ChMYO1亞細胞定位在質(zhì)膜,而ChGBP2蛋白定位在核內(nèi)(表2)。一般而言,生物中發(fā)揮胞吞作用的蛋白經(jīng)過質(zhì)膜內(nèi)陷并形成膜包被的囊泡, 進而實現(xiàn)生理功能,本研究中ChMYO1亞細胞定位在質(zhì)膜可以較好地解釋其功能,而ChGBP2蛋白定位在核內(nèi),尚不清楚胞吞作用蛋白定位在核內(nèi)的原因,推測其還具有其他生物學功能,從而更好地發(fā)揮其內(nèi)吞作用的實現(xiàn)。

    2.4 理化性質(zhì)及疏水性預測

    ChMYO1與ChGBP2蛋白在酸堿性氨基酸組成和不帶電荷的極性R基氨基酸、非極性R基氨基酸組成方面均存在著一定差異,其中,前者中堿性氨基酸殘基K(賴氨酸)、不帶電荷的極性R基氨基酸殘基G(甘氨酸)的比例較高,均為11.30%,而后者中不帶電荷的極性R基氨基酸殘基G所占比例最高,為27.30%(表3)。

    同時,ChMYO1與ChGBP2蛋白在相對分子質(zhì)量、理論等電點、正電荷氨基酸殘基數(shù)、負電荷氨基酸殘基數(shù)、原子質(zhì)量以及分子式不穩(wěn)定性系數(shù)、總的平均親水性脂肪族氨基酸指數(shù)等方面也具有一定的差異,盡管如此,兩者仍具有一定的相似性,其中,兩者在不穩(wěn)定性系數(shù)方面數(shù)值均小于40,為穩(wěn)定蛋白;兩者的總平均親水性(GRAVY)數(shù)值均小于0,屬于親水性蛋白(表4)。此外,C. higginsianum中ChMYO1與ChGBP2蛋白在親疏水性、最高氨基酸殘基和其位置等均有著一定差異,前者親水性最強氨基酸殘基、疏水性最強氨基酸殘基分別為D(天冬氨酸)、V(纈氨酸),后者親水性最強氨基酸殘基、疏水性最強氨基酸殘基分別為S(半胱氨酸)、F(苯丙氨酸)(表5)。

    2.5 轉(zhuǎn)運肽及信號序列特征

    經(jīng)過TargetP分析,C. higginsianum中ChMYO1、ChGBP2均未獲得有效的轉(zhuǎn)運肽定位情況(表6),通過SignalP分析發(fā)現(xiàn),ChMYO1、ChGBP2均沒有明顯的信號序列(表7)。轉(zhuǎn)運肽(transit peptide)作為一種12~60個氨基酸殘基的前導序列,其作用在于引導在細胞溶質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)輸入線粒體和葉綠體。本研究中并未獲得ChMYO1、ChGBP2有效的轉(zhuǎn)運肽定位情況,表明上述蛋白并不具有輸入到線粒體和葉綠體等功能,這與胞吞作用發(fā)揮的功能相一致。同時,作為發(fā)揮胞吞作用的蛋白而言,并不具有分泌蛋白特性,因此,與此次所預測的結(jié)果——不含有明顯的信號肽的預測結(jié)果相符合。

    2.6 二級結(jié)構(gòu)預測

    對C. higginsianum中ChMYO1、ChGBP2的二級結(jié)構(gòu)組成情況進行分析,結(jié)果表明,上述NPFxD基序蛋白均含有明顯的無規(guī)則卷曲、α螺旋、β卷曲,且均沒有TM螺旋,進一步對上述蛋白二級結(jié)構(gòu)組成展開分析,明確ChMYO1中含有α螺旋的比例高達39%,而ChGBP2中則含有比較多的無規(guī)則卷曲,占比為60%(圖2)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)指多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定的構(gòu)象,即肽鏈主鏈骨架原子的空間位置排布,不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈。對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析,有助于明確其發(fā)揮重要作用的構(gòu)象結(jié)構(gòu),本研究發(fā)現(xiàn)ChMYO1與ChGBP2并不具有相同或相似的蛋白二級結(jié)構(gòu)組成,推測其具有不同的功能。

    2.7 遺傳關系分析

    以C. higginsianum的ChMYO1、ChGBP2蛋白序列作為“種子序列”,在NCBI數(shù)據(jù)庫中開展同源序列搜索,并下載,進一步利用Clust X及MEGA X軟件對上述序列進行遺傳關系分析,結(jié)果顯示,在與ChMYO1、ChGBP2同源的18條蛋白序列中,分別以ChMYO1、ChGBP2為中心,明顯地分為兩大類(圖3),說明上述NPFxD基序蛋白序列存在明顯的異源關系,這與上述所開展的保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位以及理化性質(zhì)分析結(jié)果相一致。同時,從遺傳關系中可以看出,該菌中的NPFxD基序蛋白與來自于C. tofieldiae、C. sublineola等病菌中的蛋白具有較近的親緣關系(圖3)。

    3 討論與結(jié)論

    3.1 討論

    植物病原絲狀真菌中的胞吞作用,對于其菌絲尖部的快速沿伸具有重要作用。前人研究表明,稻瘟菌中的內(nèi)吞作用,一般是通過運輸Pmk1 MAPK途徑的上游膜受體而作用于黏附細胞的產(chǎn)生和侵染等[28],作為同為半活體營養(yǎng)型的希金斯炭疽菌,推測其也采用該胞吞作用機制從而調(diào)控著菌絲生長。隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的公布[3],國內(nèi)外學者對其致病相關基因開展了諸多解析工作,主要涉及G蛋白信號途徑中相關蛋白,如PITP[4]、PLC[29]、RGS[5]、septin[7]、GPCR[30]等蛋白找尋及其基本理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)以及功能特征等。然而,對于上述蛋白如何實現(xiàn)其功能作用的發(fā)揮,尚未見學術報道。本研究利用NPFxD基序搜索,共獲得了34個蛋白序列,并進一步基于構(gòu)巢曲霉中的胞吞作用蛋白進行同源比對,最終獲得ChMYO1、ChGBP2 2個NPFxD基序蛋白,這2個蛋白在保守結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位以及理化性質(zhì)、遺傳關系方面均具有明顯的差異性,其在功能上除具有胞吞作用外,是否也具有其他功能方面的差異性,均有待于后續(xù)生物學試驗驗證。同時,其他32個具有NPFxD基序蛋白是否具有胞吞作用,其功能如何,尚不清楚,有待于進一步研究明確。特別是在希金斯炭疽菌侵染植物過程中,具有NPFxD基序蛋白如何協(xié)同發(fā)揮其功能,均有待于今后進一步明確。

    3.2 結(jié)論

    本研究通過關鍵詞搜索以及Blastp比對找尋,明確了C. higginsianum中具有2個與構(gòu)巢曲霉中胞吞作用蛋白同源的NPFxD基序蛋白,其蛋白ID分別為CH063_04448、CH063_04465。同時,根據(jù)HMMTOP、TMHMM程序?qū)λ@取的NPFxD基序蛋白開展跨膜結(jié)構(gòu)域預測解析,結(jié)果表明,ChMYO1含有MYSc保守結(jié)構(gòu)域,而ChGBP2則含有RRM保守結(jié)構(gòu)域。對上述蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)以及親疏水性等特征進行分析,明確了上述2個NPFxD基序蛋白在理化性質(zhì)、亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)組成以及親疏水性方面均存在著一定的差異性。ChMYO1與ChGBP2蛋白在親疏水性、最高氨基酸殘基和其位置等均有著一定差異,前者親水性最強氨基酸殘基、疏水性最強氨基酸殘基分別為D(天冬氨酸)、V(纈氨酸),后者親水性最強氨基酸殘基、疏水性最強氨基酸殘基分別為S(半胱氨酸)、F(苯丙氨酸)。ChMYO1亞細胞定位在質(zhì)膜,而ChGBP2蛋白定位在核內(nèi)。上述NPFxD基序蛋白均含有明顯的無規(guī)則卷曲、α螺旋、β卷曲,且均沒有TM螺旋,進一步對上述蛋白二級結(jié)構(gòu)組成展開分析,明確ChMYO1中含有α螺旋的比例高達39%,而ChGBP2中則含有比較多的無規(guī)則卷曲,比例為60%。此外,對于上述蛋白同源序列開展遺傳關系分析明確希金斯炭疽菌中上述NPFxD基序蛋白與C. tofieldiae、C. sublineola等炭疽菌屬病菌中的同源蛋白之間的親緣關系比較相近。上述研究為今后進一步解析該菌以及其他炭疽菌屬中的NPFxD基序蛋白功能打下了理論基礎。

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