基于BSA-seq方法定位貴州高粱抗炭疽病害關(guān)鍵遺傳區(qū)段

陳滿靜 任艷 彭秋 李青風(fēng) 高杰 鄧小鋒

摘要：高粱炭疽病是威脅高粱生長(zhǎng)的主要病害之一，挖掘高粱抗炭疽病相關(guān)基因能夠?yàn)楦吡豢剐云贩N育種打下基礎(chǔ)。利用前期田間試驗(yàn)鑒定出的高粱高抗材料F41和高感材料B57進(jìn)行雜交構(gòu)建F2：3代分離群體，挑選高梁高抗炭疽病植株和高感炭疽病植株各30株，分別構(gòu)建2個(gè)極端性狀的DNA混合池，利用高通量測(cè)序技術(shù)與集團(tuán)分離分析法相結(jié)合的方法（BSA-seq）進(jìn)行全基因組重測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析，定位和抗性性狀相關(guān)的基因組區(qū)段。通過(guò)SNP-index及InDel-index方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析及對(duì)候選區(qū)域進(jìn)行基因注釋，共注釋到基因143個(gè)，其中非同義突變基因49個(gè)，移碼突變基因16個(gè)。研究結(jié)果為高粱抗炭疽病分子機(jī)制及抗性相關(guān)基因的克隆奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：高粱;炭疽病;抗性;候選區(qū)段;BSA-seq

中圖分類號(hào)：S435.14 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0028-07

收稿日期：2021-09-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2014BAD07B02-2-4）;黔農(nóng)科院青年基金（ 編號(hào)：[2018]57號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：陳滿靜（1991—），女，貴州三穗人，碩士，助理研究員，主要從事高粱作物栽培技術(shù)研究。E-mail：nkycmj@yeah.net。

通信作者：鄧小鋒，博士，助理研究員，主要從事高粱育種研究。E-mail：dixifor@yeah.net。

高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]作為全球重要的禾谷作物，其耐旱、耐瘠薄的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)深受種植人的喜愛(ài)。一直以來(lái)，高粱主要用于糧食、飼料和釀造加工業(yè)，近年來(lái)，以高粱為原料開(kāi)發(fā)綠色能源的研究也正在興起[1]。白酒釀造作為貴州省的主打產(chǎn)業(yè)，其原料就是有機(jī)酒用高粱，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全貴州省在2018年種植的高粱面積不少于8.67萬(wàn)hm2，其中有機(jī)高粱面積占總面積的50%[2]。高粱炭疽病是危害高粱生長(zhǎng)的主要病害之一，侵染源是禾生炭疽菌（Colletotrichum sublineolum P. Henn.，Kabát and Bubák）[3-4]，它能夠侵染高粱所有地上部分組織，包括高粱葉片、莖稈、花序等，病害嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生植株干枯死亡，感病品種生物學(xué)產(chǎn)量減產(chǎn)可達(dá)67%，在我國(guó)北方甚至能減產(chǎn)78%，嚴(yán)重影響高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。該病害易在高溫潮濕地區(qū)發(fā)生，但近年來(lái)其流行區(qū)域不斷擴(kuò)展，在貴州省的高粱栽種區(qū)均有發(fā)生。在炭疽病的防治措施中最穩(wěn)定可靠的方法是選育抗炭疽病高粱品種，但因炭疽病病株存在高度變異的生理小種，增加了抗性資源篩選與抗性選育的難度[8-9]。

為研究高粱抗炭疽病機(jī)制，定位抗性相關(guān)基因，獲得穩(wěn)定的抗性品種，眾多學(xué)者對(duì)各類高粱抗性材料進(jìn)行了分子連鎖標(biāo)記和抗性基因定位分析。相關(guān)的研究顯示，控制高粱抗炭疽病性狀的基因有呈顯性，也有呈隱性，并且許多材料如 SC414-12E、SC748-5、HC136、Bk7的抗性都受主效數(shù)量性狀座位（QTL）控制[7，10-15]。通過(guò)對(duì)這些材料進(jìn)行遺傳分析和連鎖分析后得出抗性主效位點(diǎn)，如利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）方法和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）方法對(duì)材料SC748-5進(jìn)行關(guān)聯(lián)標(biāo)記，得到1個(gè)主效位點(diǎn)，位于5號(hào)染色體上，基因長(zhǎng)度為1.8 cM;又如利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）方法對(duì)抗性材料HC136進(jìn)行關(guān)聯(lián)標(biāo)記，得到1個(gè)主效位點(diǎn);再如單核苷酸多態(tài)性（SNP）法標(biāo)記的Bk7中的抗性性狀主效位點(diǎn)有2個(gè)，位于7號(hào)染色體48.7 Mb區(qū)間，接近著絲粒;SC414-12E 同樣利用SNP標(biāo)記方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)后，得到3個(gè)主效位點(diǎn)，分別位于4、5、7號(hào)染色體上。此外，許多學(xué)者利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）方法將抗性位點(diǎn)進(jìn)行基因組定位[16-18]。如Cuevas等通過(guò)GWAS方法分析材料群體SAP，在染色體1號(hào)與5號(hào)上挖掘出5個(gè)與抗性性狀相關(guān)的位點(diǎn)，位點(diǎn)注釋分別為Sobic01G37720葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、Sobic01G379400過(guò)氧化物酶、obic05G172300：F-box結(jié)構(gòu)域、Sobic05G182400蛋白酪氨酸激酶、obic05G228400咪唑甲合成[16];Cuevas等對(duì)NPGS Sudan core collection群體進(jìn)行GWAS分析，得到4個(gè)抗性為點(diǎn)，位于2號(hào)染色體上[17];而在2019年，Cuevas等對(duì)NPGS Ethiopian sorghum collection進(jìn)行分析后得到3個(gè)抗性位點(diǎn)，位于9號(hào)染色體上，位點(diǎn)注釋為Sobic09G012500復(fù)制蛋白A：DNA結(jié)合亞基內(nèi)含子區(qū)、Sobic09G012900：亮氨酸重復(fù)序列、Sobic09G013300：R基因[18]。

集團(tuán)分離分析法（BSA）技術(shù)是能夠快速準(zhǔn)確地尋找與質(zhì)量性狀基因連鎖分子標(biāo)記的主要途徑之一，其方法在不同作物農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因挖掘上取得了較大進(jìn)展。曾維英等利用高通量測(cè)序技術(shù)與集團(tuán)分離分析法相結(jié)合（BSA-seq）的方法挖掘到12個(gè)大豆抗豆卷葉螟候選基因[19];張之昊等基于BSA-seq技術(shù)定位到了大豆突變體中控制黃622的多小葉的1對(duì)不完全顯性基因[20]。本研究在前期試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用BSA技術(shù)快速挖掘貴州高粱抗炭疽病害關(guān)鍵遺傳區(qū)段，為進(jìn)一步分子連鎖標(biāo)記開(kāi)發(fā)和育種應(yīng)用及研究高粱對(duì)植物真菌葉部病害的抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用2019年田間鑒定出來(lái)的高抗炭疽病高粱材料F41與高感炭疽病高粱材料B57雜交，得到F2：3群體種子，群體共約500個(gè)株系。炭疽菌菌株收集于貴州省惠水縣好花紅鄉(xiāng)試驗(yàn)地，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離培養(yǎng)，配制炭疽菌侵染的高粱種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建極端混合池 將F41與B57雜交得到的F2：3群體種子全部播種于貴州省黔南州惠水縣好花紅鄉(xiāng)（26°0′39.29″N，106°34′25.80″E），該區(qū)域常年溫度高、雨水充沛，適合真菌病害的接種試驗(yàn)。播種時(shí)群體內(nèi)的每個(gè)株系種植為1個(gè)小區(qū)，在拔節(jié)期后進(jìn)行炭疽病病菌接種，2次重復(fù)。接種時(shí)在每個(gè)單株的喇叭口中投4～5粒種子，同時(shí)田間種植高感材料作為誘導(dǎo)行，2周后田間觀察鑒定，確定高感和高抗材料的純合株小區(qū)，從純合小區(qū)各取30株極端抗性單株葉片和極端感性單株葉片構(gòu)建子代高抗混合池和高感混合池。對(duì)2個(gè)親本和2個(gè)混合池進(jìn)行重測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析，定位與抗性性狀相關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)段。

1.2.2 混合池DNA提取與測(cè)序 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取法將2個(gè)親本的葉片樣品及2個(gè)極端混合池的葉片樣品的DNA提取出來(lái)，將不同群體的DNA逐一等量混合后構(gòu)建4個(gè)混合池，分別是2個(gè)親本（編號(hào)為F41、B57）的高抗混合池和高感混合池，待DNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)合格之后，交由北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行樣品文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序，利用Illunima Casava 1.8進(jìn)行堿基識(shí)別分析，測(cè)序參數(shù)為雙端測(cè)序，讀長(zhǎng)為150 bp，參考基因組為Sorghum_bicolor_JGI_v3.1.1版本的高粱基因組，具體操作流程見(jiàn)圖1。

1.2.3 信息分析 將構(gòu)建的樣品文庫(kù)上機(jī)測(cè)序得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)（raw reads），過(guò)濾后得到待分析測(cè)序數(shù)據(jù)（clean reads），將clean reads通過(guò)BWA軟件與高粱基因組進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)clean reads的比對(duì)結(jié)果，利用GATK軟件檢測(cè)和過(guò)濾得到檢測(cè)樣品與參考基因組之間高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)和序列插入與缺失（InDel）位點(diǎn)。

利用歐式距離法（Euclidean distance，簡(jiǎn)稱ED）和SNP-index法計(jì)算與性狀關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域。歐式距離是通過(guò)混池間存在的顯著差異標(biāo)記來(lái)評(píng)估與性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域的方法[21]。SNP-index是通過(guò)混池間的基因型頻率存在的顯著差異標(biāo)記來(lái)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的方法[21-22]，用Δ（SNP-index）值統(tǒng)計(jì)。

通過(guò)BLAST軟件[23]對(duì)SNP和InDel結(jié)果的交集區(qū)域中可編碼基因進(jìn)行深度注釋，準(zhǔn)確挖掘高粱抗炭疽病選候選基因區(qū)段。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

利用Illunima HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)2個(gè)子代極端混合池和2個(gè)親本進(jìn)行全基因組重測(cè)序，過(guò)濾后得到40 Gbp高質(zhì)量的clean reads數(shù)據(jù)，Q30≥93.55%，GC含量在42.44%～43.32%之間，插入片段長(zhǎng)度呈正態(tài)分布，樣品與參考基因組平均比對(duì)效率為97.23%，基因組平均覆蓋深度約為18.50X，基因組覆蓋率約為95.42%（至少覆蓋1X）（表1）。研究結(jié)果表明，該數(shù)據(jù)符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 SNP和InDel變異檢測(cè)與注釋

通過(guò)SNP檢測(cè)分析，親本之間共獲得1 520 997個(gè)SNP，其中非同義突變的SNP共29 661個(gè)，混合池之間共獲得1 095 653個(gè)SNP，引起非同義突變的SNP共19 086個(gè);通過(guò)InDel檢測(cè)，親本之間共獲得323 821個(gè)小片段插入與缺失（small InDel）;混合池之間共獲得229 420個(gè)small InDel（圖2）。

2.3 SNP關(guān)聯(lián)分析

對(duì)SNP進(jìn)行過(guò)濾之后得到質(zhì)量高的可信SNP位點(diǎn)754 261個(gè)。采用ED算法和SNP-index算法對(duì)這些位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

根據(jù)ED算法關(guān)聯(lián)閾值判定，共得到2個(gè)與高粱抗炭疽病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，關(guān)聯(lián)值分布見(jiàn)圖3，區(qū)域所注釋到的基因總長(zhǎng)度為1.30 Mb，共包含154個(gè)基因，其中非同義突變位點(diǎn)的基因共49個(gè);根據(jù)SNP-index算法關(guān)聯(lián)閾值判定，共得到4個(gè)與高粱抗炭疽病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，關(guān)聯(lián)分布見(jiàn)圖4，區(qū)域注釋到的基因總長(zhǎng)度為6.77 Mb，共包含896個(gè)基因，其中非同義突變位點(diǎn)的基因共179個(gè)。2種關(guān)聯(lián)分析方法取交集，得到1個(gè)交集區(qū)域，區(qū)域總長(zhǎng)度為1.30 Mb，共包含154個(gè)基因（表2）。

2.4 InDel關(guān)聯(lián)分析

對(duì)InDel位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)濾，得到質(zhì)量高的可信InDel位點(diǎn)170 725個(gè)。同樣采用ED算法和SNP-index算法對(duì)這些位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)ED算法和 SNP-Index 算法分析得到的結(jié)果取交集，共得到2個(gè)區(qū)域，區(qū)域總長(zhǎng)度為1.82 Mb，共包含基因213個(gè)（表3）。

2.5 候選區(qū)段篩選與基因注釋

本研究將SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與InDel關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)后取交集，最終鎖定高粱抗炭疽病的候選區(qū)域在5號(hào)染色體上，候選區(qū)域基因全長(zhǎng)為 1.30 Mb，共有基因154個(gè)。利用GO[24]、KEGG[25]等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行注釋后，共143個(gè)基因被注釋，其中非同義突變基因有49個(gè)，移碼突變基因有16個(gè)。

2.5.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)能夠?qū)⑷澜缢信c定位基因有關(guān)的研究結(jié)果進(jìn)行匯總，利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)可以在生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)方面對(duì)基因和基因產(chǎn)物進(jìn)行分類注釋。為明確候選基因在細(xì)胞上的位置、分子的功能和參與生物學(xué)進(jìn)程，將候選區(qū)域154個(gè)基因進(jìn)行GO功能注釋，有86個(gè)基因分別被注釋到10個(gè)細(xì)胞組分、7個(gè)分子功能和14個(gè)生物學(xué)進(jìn)程中，分類結(jié)果見(jiàn)圖5?；蛟诩?xì)胞組分中主要存在于細(xì)胞膜以及細(xì)胞器膜中;基因在分子功能中主要發(fā)揮催化、轉(zhuǎn)錄以及信號(hào)傳遞等功能;在基因生物學(xué)進(jìn)程中主要參與免疫過(guò)程、代謝過(guò)程與生物調(diào)節(jié)等。結(jié)合以上結(jié)果，說(shuō)明高粱炭疽病脅迫下高粱的抗病響應(yīng)可能有生物膜修復(fù)、逆境中相關(guān)的催化代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)與蟲害信息的傳遞等。

2.5.2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析 生物體中的生物學(xué)功能是由基因之間的相互協(xié)調(diào)來(lái)完成的，代謝通路（Pathway）代表不同基因間相同的作用通路，而KEGG是收集Pathway的公共數(shù)據(jù)庫(kù)。為了進(jìn)一步解讀候選基因的功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選基因區(qū)段進(jìn)行Pathway富集分析，154個(gè)候選基因被注釋到的基因數(shù)為30個(gè)，這30個(gè)基因所參與的代謝通路主要為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體合成、核苷酸合成、RNA降解與碳代謝等（圖6）。表明當(dāng)高粱受到炭疽病病菌侵害時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)傳導(dǎo)病害信號(hào)的響應(yīng)，體內(nèi)合成代謝增加，產(chǎn)生各種蛋白酶與核酸等物質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行RNA等分解代謝抵御炭疽病病菌的入侵。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用BSA-seq方法快速挖掘到高粱抗炭疽病關(guān)鍵遺傳區(qū)段，通過(guò)對(duì)材料全基因組重測(cè)序共挖掘得到1個(gè)與抗性性狀相關(guān)的候選區(qū)域，位于5號(hào)染色體上，關(guān)聯(lián)區(qū)域總長(zhǎng)度為1.30 Mb，對(duì)候選區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，共注釋到基因143個(gè)，經(jīng)過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，這一關(guān)鍵遺傳區(qū)段內(nèi)的基因可能在高粱抗炭疽病害過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)抗性基因的克隆與分子研究奠定了基礎(chǔ)。

前人通過(guò)連鎖分析研究顯示，高粱抗炭疽病的主效位點(diǎn)位于4、5、7、9號(hào)染色體上[25-27]。如高抗材料SC748-5的抗性主效位點(diǎn)位于5號(hào)染色體上約42.5 cM（60.77 Mbp）的位置，材料SC112-14的主效位點(diǎn)位于5號(hào)染色體上55.0～56.1 cM區(qū)間內(nèi)，材料SC414-12E的1個(gè)抗性相關(guān)位點(diǎn)位于5號(hào)染色體上116.90～118.10 cM區(qū)間內(nèi)。此外全基因組關(guān)聯(lián)分析也顯示高粱抗炭疽病的一些抗性基因位于5號(hào)染色體上65 193 948、66 491 767、71 578 176、65 136 879～65 137 882 bp位置上[18，28]。

本研究結(jié)果顯示，高粱抗性材料F41的抗性位點(diǎn)位于5號(hào)染色體上3 200 000～4 750 000 bp區(qū)間內(nèi)，不同于以上任何抗性位點(diǎn)或基因的位置。同時(shí)，已報(bào)道的高粱5號(hào)染色體上抗炭疽病的抗性基因富集區(qū)域位于53.81～62.16、64.53～66.87 Mbp區(qū)間[27，29]，因此F41的位點(diǎn)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的炭疽病抗性位點(diǎn)，其中的相關(guān)基因是新發(fā)現(xiàn)的抗性相關(guān)基因。該新位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為研究炭疽病抗性機(jī)制及新抗性基因聚合奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用BSA-seq方法挖掘到了與高粱抗炭疽病相關(guān)的遺傳基因區(qū)段，但未進(jìn)一步對(duì)候選區(qū)段進(jìn)行基因篩選。后續(xù)試驗(yàn)中，將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及大群體連鎖分析對(duì)候選區(qū)段基因進(jìn)行鑒定，定位到具體抗性基因。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄧小鋒，陳滿靜，曹紹書，等. 貴州糯質(zhì)高粱GBSSI基因型的鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（5）：13-18.

[2]王小波. 貴州醬香型白酒用粱狀況及對(duì)策分析[C]//谷糧商務(wù)信息網(wǎng)，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所.谷糧網(wǎng)2019年第六屆中國(guó)高粱產(chǎn)業(yè)高峰論壇會(huì)刊集.仁懷：中國(guó)高粱產(chǎn)業(yè)高峰論壇，2019：34-39.

[3]徐秀德，劉志恒. 高粱病蟲害原色圖鑒[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2013.

[4]Erpelding J E，Prom L K. Variation for anthracnose resistance within the Sorghum germplasm collection from Mozambique，Africa[J]. Plant Pathology Journal，2006，5（1）：28-34.

[5]Thomas M D. Development of leaf anthracnose and its effect on yield and grain weight of Sorghum in west Africa[J]. Plant Disease，1996，80（2）：151.

[6]徐 婧，姜 鈺，胡 蘭，等. 高粱抗炭疽病資源篩選及病情與產(chǎn)量損失的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，52（22）：4079-4087.

[7]鄧小鋒，彭 秋，李青風(fēng)，等. 高粱炭疽病抗性機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：68-74.

[8]Chala A，Tronsmo A M，Brurberg M B. Genetic differentiation and gene flow in Colletotrichum sublineolum in Ethiopia，the centre of origin and diversity of Sorghum，as revealed by AFLP analysis[J]. Plant Pathology，2011，60（3）：474-482.

[9]Felderhoff T J，McIntyre L M，Saballos A，et al. Using genotyping by sequencing to map two novel anthracnose resistance loci in Sorghum bicolor[J]. Genes Genomes Genetics，2016，6（7）：1935-1946.

[10]Erpeldi J E，Prom L K. Evaluation of Malian Sorghum germplasm for resistance against anthracnose[J]. Plant Pathology Journal，2004，3（2）：65-71.

[11]Erpelding J E，Wang M L. Response to anthracnose infection for a random selection of Sorghum germplasm[J]. Plant Pathology Journal，2007，6（2）：127-133.

[12]Prom L K，Erpelding J E，Montes-Garcia N. Chinese Sorghum germplasm evaluated for resistance to downy mildew and anthracnose[J]. Communications in Biometry and Crop Science，2007，2（1）：26-31.

[13]Erpelding J E. Field evaluation of anthracnose disease response for the Sorghum germplasm collection from the Kayes region of Mali[J]. Tropical and Subtropical Agroecosystems，2008（8）：291-296.

[14]Erpelding J E. Anthracnose disease response for photoperiod-insensitive Ethiopian germplasm from the US sorghum collection[J]. World Journal of Agricultural Science，2009，5（6）：707-713.

[15]Singh M，Chaudhary K，Boora K S.RAPD-based SCAR marker SCA 12 linked to recessive gene conferring resistance to anthracnose in sorghum[Sorghum bicolor （L.） Moench][J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，114（1）：187-192.

[16]Cuevas H E，Prom L K，Rosa-Valentin G.Population structure of the NPGS Senegalese sorghum collection and its evaluation to identify new disease resistant genes[J]. PLoS One，2018，13（2）：e0191877.

[17]Cuevas H E，Prom L K，Cruet-Burgos C M. Genome-wide association mapping of anthracnose （Colletotrichum sublineolum） resistance in NPGS Ethiopian sorghum germplasm[J]. Genes Genomes Genetics，2019，9（9）：2879-2885.

[18]Cuevas H E，Prom L K.Evaluation of genetic diversity，agronomic traits，and anthracnose resistance in the NPGS Sudan sorghum core collection[J]. BMC Genomics，2020，21（1）：88.

[19]曾維英，賴振光，孫祖東，等. 基于BSA-Seq和RNA-Seq方法鑒定大豆抗豆卷葉螟候選基因[J]. 作物學(xué)報(bào)，2021，47（8）：1460-1471.

[20]張之昊，王 俊，劉章雄，等. 基于BSA-Seq技術(shù)挖掘大豆中黃622的多小葉基因[J]. 作物學(xué)報(bào)，2020，46（12）：1839-1849.

[21]Hill J T，Demarest B L，Bisgrove B W，et al. MMAPPR：mutation mapping analysis pipeline for pooled RNA-seq[J]. Genome Research，2013，23（4）：687-697.

[22]Fekih R，Takagi H，Tamiru M，et al. MutMap+：genetic mapping and mutant identification without crossing in rice[J]. PLoS One，2013，8（7）：e68529.

[23]Altschul S F，Madden T L，Schffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（17）：3389-3402.

[24]Ashburner M，Ball C A，Blake J A，et al. Gene Ontology：tool for the unification of biology[J]. Nature Genetics，2000，25（1）：25-29.

[25]Kanehisa M，Goto S，Kawashima S，et al. The KEGG resource for deciphering the genome[J]. Nucleic Acids Research，2004，32：277-280.

[26]Cuevas H E，Prom L K，Erpelding J E.Inheritance and molecular mapping of anthracnose resistance genes present in sorghum line SC112-14[J]. Molecular Breeding，2014，34（4）：1943-1953.

[27]Burrell A M，Sharma A，Patil N Y，et al. Sequencing of an anthracnose-resistant sorghum genotype and mapping of a major QTL reveal strong candidate genes for anthracnose resistance[J]. Crop Science，2015，55（2）：790-799.

[28]Cuevas H E，Prom L K，Cooper E A，et al. Genome-wide association mapping of anthracnose （Colletotrichum sublineolum） resistance in the US sorghum association panel[J]. The Plant Genome，2018，11（2）：99-112.

[29]Patil N Y，Klein R R，Williams C L，et al. Quantitative trait loci associated with anthracnose resistance in sorghum[J]. Crop Science，2017，57（2）：877-890.