武夷山不同海拔梯度黃山松土壤有機(jī)氮解聚酶活性及其影響因素

元曉春,林惠瑛,曾泉鑫,陳文偉,陳俊明,許敬華,陳岳民,林開淼,2,*

1 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院, 福州 350007

2 武夷學(xué)院旅游學(xué)院, 武夷山 354300

3 福建戴云山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局, 德化 362500

氮是森林生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和生態(tài)系統(tǒng)功能維持的最重要限制因子之一[1],其主要來源于土壤有機(jī)氮(SON,占土壤總氮的90%以上)[2]。最早的土壤氮有效性礦化-固持作用理論(Mineralization-immobilization theory,MIT)認(rèn)為:“SON礦化決定生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)”[3]。但后期的研究發(fā)現(xiàn),SON由于分子量太大不能被植物和微生物有效吸收,必須在酶的作用下將含氮聚合物水解為小分子單體,才可以被植物和微生物同化和利用,這一過程被稱為“解聚作用”,并據(jù)此提出“解聚作用是控制生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的關(guān)鍵過程”[4]。目前,全球范圍內(nèi)有關(guān)氮循環(huán)的研究更多關(guān)注土壤無機(jī)氮的轉(zhuǎn)化(硝化作用、反硝化作用等)、含氮?dú)怏w(N2O、NO等)排放、不同氣候帶礦質(zhì)氮保持機(jī)制以及養(yǎng)分供應(yīng)等內(nèi)容[5—6]。然而,作為直接控制無機(jī)氮來源的“瓶頸”[7],SON解聚作用的研究卻長期嚴(yán)重滯后。

受限于SON的解聚作用目前無法直接觀測,研究人員只能嘗試尋找代用指標(biāo)來間接表征。SON的解聚作用本質(zhì)上是在解聚酶的作用下將SON大分子聚合物進(jìn)行水解,生成氨基酸、氨基糖、核酸等可以被微生物和植物直接或間接利用的小分子單體的過程[4,7]。因此,SON解聚酶是解聚作用強(qiáng)度和方向的關(guān)鍵控制因子,其活性的變化是目前用來表征解聚作用的有效指標(biāo)[8—9]。SON解聚酶并不是某一種酶,而是能夠?qū)⑼寥篮蠓肿泳酆衔镏鸩剿獾囊幌盗忻竅7]。參與SON解聚作用的酶主要是蛋白酶,其次是幾丁質(zhì)酶、木質(zhì)素酶和肽聚糖酶[7, 9]。因?yàn)橹参锖臀⑸餁報(bào)w是SON的主要組分,其化學(xué)組成包括蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、木質(zhì)素和肽聚糖,而蛋白質(zhì)占植物和微生物細(xì)胞氮的60%[10]。即使有研究表明,微生物可以直接吸收、礦化部分小分子蛋白質(zhì)[11],但大多數(shù)蛋白質(zhì)在跨膜運(yùn)輸之前必須經(jīng)過蛋白酶參與的解聚作用[9]。溫帶或北方森林的已有研究表明中、低海拔土壤總碳[12],微生物[13],土壤質(zhì)地和土壤pH[14]是影響SON解聚酶活性的主要因素。然而,目前對(duì)亞熱帶森林中、高海拔SON解聚酶活性的分布規(guī)律及其影響因素尚不明確。

海拔梯度變化對(duì)地球化學(xué)和生物的元素循環(huán)起著重要的作用[15],其調(diào)節(jié)溫度和降水梯度,同時(shí)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分以及土壤微生物群落等土壤特性發(fā)生自然變化[16]。武夷山國家自然保護(hù)區(qū)擁有全球同緯度現(xiàn)存面積最廣、保存最完整的亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)[17],是亞熱帶東南大陸海拔梯度最大的區(qū)域。與溫帶相比,雖然亞熱帶森林土壤相對(duì)氮飽和,但是該區(qū)域高溫多雨,植被生產(chǎn)力旺盛,對(duì)氮養(yǎng)分的需求更高[18],SON解聚作用的變化對(duì)亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的影響可能比溫帶地區(qū)更大。研究區(qū)海拔高350—2161 m,該區(qū)海拔變化提供了一系列土壤特性以檢驗(yàn)SON解聚酶活性是如何受海拔影響。為排除不同植被類型的影響,我們選取海拔1200—2000 m的黃山松林作為研究對(duì)象,探究武夷山不同海拔梯度下黃山松SON解聚酶活性變化,并闡明不同海拔梯度下調(diào)節(jié)SON解聚酶活性的關(guān)鍵因素,以期預(yù)測環(huán)境變化對(duì)亞熱帶中、高海拔區(qū)SON解聚作用的影響。該研究有助于提高我們對(duì)土壤氮循環(huán)機(jī)理的認(rèn)識(shí),同時(shí)對(duì)預(yù)測環(huán)境變化對(duì)SON解聚的影響,認(rèn)知亞熱帶黃山松林土壤有效氮保持和生產(chǎn)力的維持機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于江西省武夷山國家自然保護(hù)區(qū)(27°48′11″—28°00′35″ N,117°39′30″—117°55′47″ E),海拔高350—2161 m,屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。年平均氣溫約14.2 ℃,年平均降水量約2583 mm,年平均濕度約84%,年平均蒸發(fā)量約778 mm,年平均無霜期為231 d[19]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用典型樣地調(diào)查法,于2014年10月,根據(jù)保護(hù)區(qū)內(nèi)黃山松的實(shí)際生長及分布情況,選取海拔1200—2000 m之間的黃山松林作為研究對(duì)象。每200 m設(shè)置1個(gè)間隔,共設(shè)置了5個(gè)海拔梯度(包括2000、1800、1600、1400、1200 m)。每個(gè)海拔梯度設(shè)置3個(gè)樣方,共設(shè)置15個(gè)20 m×20 m的樣方,樣方之間設(shè)有10 m以上的隔離帶,用于防止樣地之間相互干擾[19]。

采用“S”型5點(diǎn)取樣法采樣,于2019年7月,在每個(gè)樣方內(nèi)的表層土壤(0—10 cm)隨機(jī)選取5個(gè)土芯。相同海拔梯度的土壤樣品在去除石礫、碎屑以及植物根系后混合成一個(gè)均勻樣,將土壤樣品裝入塑料自封袋用冰袋保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室處理。將每個(gè)樣品分成2組,一組為鮮土,過2 mm篩后測定土壤酶活性、微生物生物量和土壤可溶性有機(jī)質(zhì)；另一組為風(fēng)干土用于測定其他土壤理化性質(zhì)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

土壤酶活性的測定:采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒測定,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。在最佳反應(yīng)條件下,采用比色法對(duì)SON解聚酶活性進(jìn)行測定。其中,堿性蛋白酶(ALPT)、酸性蛋白酶(ACPT)和中性蛋白酶(NPT)分別取0.02 g風(fēng)干土,用0.2 M Tris(pH=8.0)提取,磁力攪拌器攪拌均質(zhì)化后,混勻后在40 ℃下水浴30 min,采用福林酚比色法測定[22]；幾丁質(zhì)酶(Chi)通過取0.10 g風(fēng)干土,用0.05 M醋酸鈉(pH=5.0)提取,混勻后在37 ℃下培養(yǎng)24 h,采用二甲氨基苯甲醛比色法測定[23]；漆酶(Lac)通過取0.02 g風(fēng)干土,用0.1 M酒石酸鈉(pH=5)提取,在37 ℃下震蕩反應(yīng)10 min,冰浴5 min,采用ABTS氧化法測定[24]；錳過氧化物酶(MnP)通過取0.20 g風(fēng)干土,用0.1 M酒石酸鈉(pH=5)提取,混勻后在25 ℃下培養(yǎng)3 h,采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[25]；谷氨酰胺酶(GLS)通過取0.10 g風(fēng)干土,用0.05 M Tris(pH=8.6)提取,混勻后在37 ℃下培養(yǎng)2 h,采用奈氏比色法測定[26]；亮氨酸氨基肽酶(LAP)通過取0.05 g風(fēng)干土,用0.2 M Tris(pH=8.0)提取,攪拌均勻后在37 ℃下培養(yǎng)1 h,采用對(duì)硝基苯胺比色法測定[27]。所測定酶的底物及特征吸收峰如表1所示。

表1 SON解聚酶的種類、縮寫、相應(yīng)底物和特征吸收峰

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(Tukey)檢驗(yàn)不同海拔梯度間土壤環(huán)境因子和土壤特性以及SON解聚酶活性的差異顯著性(α=0.05)。采用R軟件4.0.2將SON解聚酶活性與土壤環(huán)境因子、理化性質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算并繪圖。利用Canaco 5.0軟件進(jìn)行冗余分析,探究海拔梯度下環(huán)境因子和土壤特性對(duì)SON解聚酶活性的影響。其他繪圖由Origin 2018軟件完成,圖表中數(shù)據(jù)為平均值(標(biāo)準(zhǔn)差),n=3。

2 結(jié)果

2.1 不同海拔梯度下的土壤環(huán)境因子和理化性質(zhì)

除土壤DON含量外,其他的土壤環(huán)境因子和理化性質(zhì)在不同海拔梯度下均存在顯著的差異(P<0.05)。從海拔1200—2000 m,ST隨海拔升高顯著降低,而SM顯著增加(P<0.05)。SOC,TN、DOC和MBC隨海拔升高呈波浪式起伏,均在海拔1600 m顯著增加(P<0.05),在海拔1800 m降低,到海拔2000 m再次增加(表2)。此外,土壤pH在海拔1800 m顯著升高,而MBN在海拔2000 m顯著增加(P<0.05)。

表2 不同海拔梯度下土壤環(huán)境因子和理化性質(zhì)

2.2 不同海拔梯度下的SON解聚酶活性

SON解聚酶活性在不同海拔梯度下均存在顯著差異(P<0.05),并存在3種不同的變化趨勢。從海拔1200—2000 m,ALPT、NPT、Lac和LAP活性隨海拔升高顯著增加(P<0.05)；ACPT和Chi活性隨海拔升高先增后降,在海拔1800 m處達(dá)到最高值,到海拔2000 m顯著降低(P<0.05)。相比于其他海拔,Mnp和GLS在海拔1800 m顯著降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同海拔梯度對(duì)黃山松SON解聚酶活性的影響

2.3 不同海拔梯度下的土壤礦質(zhì)氮含量

圖2 不同海拔梯度對(duì)黃山松土壤礦質(zhì)氮的影響

2.4 不同海拔梯度下SON解聚酶活性的影響因素

圖3 不同海拔梯度黃山松SON解聚酶活性與土壤環(huán)境因子、理化性質(zhì)的相關(guān)分析

圖4 不同海拔梯度黃山松SON解聚酶活性的冗余分析

3 討論

3.1 不同海拔梯度下溫度、水分和微生物等因素對(duì)黃山松SON解聚酶活性的影響

本研究中土壤溫度和含水率是不同海拔梯度下SON解聚酶活性最大的兩個(gè)影響因素(表3)。已有不少試驗(yàn)性增溫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),增溫會(huì)抑制土壤酶活性[28—29]。一般來說,溫暖環(huán)境下的土壤微生物會(huì)分泌較少的酶[28],由于酶的催化效率將隨著溫度的升高而增加[30]。因此,在解聚等量SON的前提下,低溫度的高海拔區(qū)可能需要分泌更多的SON解聚酶。同樣,土壤蛋白酶活性對(duì)土壤水分具有強(qiáng)烈生物依賴性[31]。近期一項(xiàng)meta分析也表明含水率增加可刺激氮循環(huán)酶活性[32],原因在于含水率增加會(huì)降低酶的固定化并增加其擴(kuò)散速率[33]。反過來,干旱則抑制土壤酶活性[33],同時(shí)降低土壤酶催化效率[34]。相反,Chi與ST、SM的夾角接近90°,說明幾丁質(zhì)酶幾乎不受溫度和含水率的調(diào)節(jié)(圖4)。據(jù)研究報(bào)道,幾丁質(zhì)酶具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,溫度通常在小于60 ℃時(shí)均能保持很好的穩(wěn)定性[35]。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Chi與所測的土壤環(huán)境因子和理化性質(zhì)均無顯著的相關(guān)性(圖3)。而本研究中幾丁質(zhì)酶隨海拔升高而增加,但在海拔2000 m顯著降低(圖1),推測其主要是由于幾丁質(zhì)酶需求的降低所致,由于高海拔區(qū)甲殼類動(dòng)物或甲殼類物質(zhì)分布較少。

表3 冗余分析中影響因子的解釋率

除了溫度和含水率,MBC是影響SON解聚酶重要的因素之一(圖4)。眾所周知,土壤中的解聚酶主要是由細(xì)菌、真菌等土壤微生物分泌,微生物生物量的變化必然會(huì)影響土壤SON解聚酶的分泌量,進(jìn)而影響SON的解聚作用[13]。土壤微生物對(duì)環(huán)境變化十分敏感[36],近期一項(xiàng)全球尺度的meta分析表明,熱帶和亞熱帶地區(qū)土壤微生物生物量隨海拔升高而增加,與土壤有機(jī)碳和全氮濃度呈顯著正相關(guān)[15]。本研究中MBC和MBN隨海拔升高而增加,MBC隨海拔升高呈波浪式增長,在海拔1600 m和2000 m達(dá)到波峰值,并顯著高于其他海拔(P<0.05,表2),這將有利于SON解聚酶的分泌。由于ALPT、NPT、Lac和LAP與土壤ST、SM以及MBC最為密切,與ST呈顯著負(fù)相關(guān),與SM、MBC呈顯著正相關(guān)(圖3,圖4)。這直接導(dǎo)致了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、漆酶和亮氨酸氨基肽酶4種解聚酶活性隨海拔升高逐漸增加的分布規(guī)律,并在海拔2000 m顯著增加(圖1)。

此外,多數(shù)研究表明土壤pH值會(huì)影響土壤酶活性[14, 33, 37]。在本研究中盡管土壤pH在海拔1800 m顯著升高(表2),并與部分SON解聚酶存在顯著的相關(guān)性(圖3)。但相比于其他因素,土壤pH值對(duì)SON解聚酶的解釋率很低(表3)?？赡茉蛟谟陂L期的環(huán)境塑造下,酶產(chǎn)生了功能性適應(yīng)[37]。Puissant等[37]最近的一項(xiàng)研究表明,亮氨酸氨基肽酶活性的最佳pH值接近天然土壤pH值,酶的最適pH值會(huì)向源土壤pH值方向移動(dòng)。本研究也發(fā)現(xiàn),亮氨酸氨基肽酶與pH沒有顯著的相關(guān)性(圖3)。Luo等[38]在北京縉云山350—500 m海拔梯度馬尾松的研究同樣發(fā)現(xiàn),土壤酶活性對(duì)溫度和含水率更敏感,與土壤pH無密切聯(lián)系。

3.2 不同海拔梯度下有機(jī)底物和礦質(zhì)氮對(duì)黃山松SON解聚酶活性的影響

圖5 海拔梯度對(duì)黃山松SON解聚酶活性的影響示意圖

4 結(jié)論

SON解聚酶活性在不同海拔梯度下受多種因素的綜合影響,其中溫度和含水率是影響SON解聚酶活性兩大最重要的因素。盡管溫度對(duì)SON解聚酶活性的負(fù)效應(yīng)大于含水率對(duì)SON解聚酶活性的正效應(yīng),但是其他因素,如微生物生物量碳、礦質(zhì)氮含量同樣對(duì)SON解聚酶活性有很強(qiáng)的正效應(yīng),因此不同海拔梯度下環(huán)境因子累計(jì)的正效應(yīng)大于負(fù)效應(yīng)。相比于有機(jī)底物,下游無機(jī)氮循環(huán)中礦質(zhì)氮對(duì)SON解聚酶活性產(chǎn)生了重要的影響。當(dāng)?shù)V質(zhì)氮缺乏時(shí),沒有刺激酶的生產(chǎn),反而降低了酶活性,盡管這不符合微生物代謝的經(jīng)濟(jì)學(xué)理論,但表明了在亞熱帶中、高海拔區(qū)SON解聚酶合成容易受到有效氮資源的限制。

致謝：感謝曾嘉鴻對(duì)本文寫作的幫助。