失荅剌知丸對血管性癡呆大鼠海馬區(qū)NMDA受體表達(dá)的影響

王佩佩 ，孫惠敏，曹麗翠，劉 麗，李占濤，王娜琳，賈孟輝 ，3，王曉麗*

（1.銀川市第一人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750001；2.寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是以缺血性腦血管病為基礎(chǔ)引起的廣泛持續(xù)性的腦損害，主要癥狀為學(xué)習(xí)記憶功能減退，伴或不伴有語言、視空間能力及情感或者人格障礙等的癡呆綜合征，是僅次于阿爾海默茨病的第二大類癡呆疾患［1］。研究發(fā)現(xiàn)，臨床中30%的腦卒中患者3 年內(nèi)易進(jìn)展為血管性認(rèn)知功能障礙［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，老年人患缺血性腦血管疾病逐年增加，并發(fā)血管性癡呆的發(fā)病率呈上升趨勢，患病率為1.1%～3.0%，嚴(yán)重影響著老年患者的身心健康和生活質(zhì)量，同時給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上探討失荅剌知丸改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠78只，2～3個月齡，體質(zhì)量（200±50）g；購于并統(tǒng)一飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)SPF 級動物實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食和飲水；常規(guī)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 尼莫地平（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，規(guī)格：每片20 mg，國藥準(zhǔn)字H20003010），臨用時研細(xì)加蒸餾水配制濃度為1.08 mg/ml的混懸液。失荅剌知丸藥物組成：柴胡31 g，黑訶子31 g，蘆薈62 g，失荅剌知（延胡索）6 g，石菖蒲6 g，番鹽6 g，沙哈木罕荅里（藥西瓜）9 g，阿里公（松蕈）9 g，安息香9 g，撒額冰（阿魏）9 g，干姜9 g，蓽茇9 g，胡椒9 g，白芥子9 g，蕓香9 g，巴豆霜9 g。根據(jù)人與大鼠用藥的換算關(guān)系，將以上藥物水煎至含生藥量為2.03 g/ml 的濃縮液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 Bio-swamp 兔多克隆抗體NR1（貨號：PAB43205-P，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；ABclonal兔多克隆抗體NR2B（批號：A0924，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Bio-swamp 生物素標(biāo)記的山羊抗兔（貨號：PAB160011，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；mini protean 3 電泳儀（cellBIO-RAD）；MK3 酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），Centrifuge 5424R 離心機(jī)（德國艾本德股份公司），Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）。

2 方 法

2.1 血管性癡呆模型建立方法 采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法（2-VO）制備大鼠血管性癡呆模型。術(shù)前大鼠禁食，自由飲水。腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定在實(shí)驗(yàn)臺，頸部去毛消毒，沿頸部皮膚正中線剪開，頓性分離頸總動脈，用4號絲線行頸總動脈結(jié)扎，拉緊絲扣，阻斷血流20 min 后放松絲扣再灌注10 min，再次阻斷血流20 min，第2 次再灌注后觀察30 min，局部組織縫合。手術(shù)后予以青霉素腹腔內(nèi)注射，預(yù)防傷口感染。通過Morris水迷宮法試驗(yàn)，記錄每只大鼠平均逃避潛伏期，求得假手術(shù)組平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，平均逃避潛伏期大于此值的大鼠判為學(xué)習(xí)記憶功能障礙，造模成功。

2.2 分組與給藥 78 只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組6只、假手術(shù)組18只、模型組18只、尼莫地平組18只、失荅剌知丸組18只。空白組不予手術(shù)操作，假手術(shù)組只分離頸總動脈，模型組及用藥組采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備大鼠血管性癡呆模型。各組大鼠造模成功后均按10 ml/kg 劑量給藥，失荅剌知丸組予含生藥濃度2.03 g/ml 的失荅剌知丸藥液灌胃，尼莫地平組予濃度1.08 mg/ml的尼莫地平混懸液灌胃，空白組、假手術(shù)組和模型組給予等容積生理鹽水灌胃，同一時間給藥，每日2 次。除空白組外，余4 組根據(jù)灌胃15 d、30 d、45 d時間點(diǎn)分別處死動物6只。

2.3 Western blot 法檢測海馬區(qū) NR1 和 NR2B 受體蛋白表達(dá) 麻醉大鼠，輕取大鼠海馬區(qū)腦組織，將腦組織剪細(xì)小碎片，加入裂解液，勻漿裂解后的樣品4 ℃12 000 g 離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量后用SDS-PAGE 法行蛋白分離，再行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，室溫下將膜用5%的脫脂牛奶封閉2 h，封閉液稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。第二日室溫下TBST 洗膜3次，每次5 min，之后加入1∶3 000 稀釋二抗，室溫下孵育30 min 后，用TBST 洗膜3 次，每次5 min。ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測后將膜置于發(fā)光檢測儀中檢測，用TANONGIS 軟件讀取條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析，多組間比較，當(dāng)方差齊時用LSD法比較，方差不齊時用Dunnett’s T3 法比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

失荅剌知丸對血管性癡呆大鼠NR1、NR2B 蛋白表達(dá)的影響見表1、圖1、圖2。

圖1 各組NR1蛋白表達(dá)條帶圖

圖2 各組NR2B蛋白表達(dá)條帶圖

表1 失荅剌知丸對VD大鼠NR1、NR2B蛋白表達(dá)的影響 （，n=6）

表1 失荅剌知丸對VD大鼠NR1、NR2B蛋白表達(dá)的影響 （，n=6）

注：與空白組、假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與尼莫地平組15 d 比較，③P＞0.05；與尼莫地平組30 d比較，④P＜0.05；與尼莫地平組45 d比較，⑤P＜0.05

NR2B 0.38±0.021 0.37±0.015 0.34±0.027①0.49±0.019②0.55±0.012②⑤組 別空白組假手術(shù)組模型組尼莫地平組失荅剌知丸15 d NR1 0.33±0.012 0.34±0.011 0.30±0.024①0.54±0.010②0.55±0.011②③NR2B 0.38±0.021 0.42±0.018 0.33±0.007①0.59±0.039②0.66±0.081②③30 d NR1 0.33±0.012 0.30±0.009 0.27±0.010①0.42±0.009②0.51±0.032②④NR2B 0.38±0.021 0.39±0.026 0.21±0.036①0.50±0.016②0.54±0.009②④45 d NR1 0.33±0.012 0.32±0.013 0.25±0.020①0.37±0.012②0.46±0.030②⑤

結(jié)果顯示：與空白組、假手術(shù)組比較，模型組NR1、NR2B 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，尼莫地平組和失荅剌知丸組NR1、NR2B 蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；尼莫地平組15 d 和失荅剌知丸組15 d NR1、NR2B 蛋白的表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）；與尼莫地平組 30 d、45 d 比較，失荅剌知丸組30 d、45 d NR1、NR2B蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。

4 討 論

血管性癡呆的發(fā)病過程及病理機(jī)制極為復(fù)雜，突觸傳遞信息功能損傷是VaD 學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知障礙的重要原因［4］，突觸功能改善被認(rèn)為是減輕VaD 學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能損傷的有效作用機(jī)制［5］。NMDA 是與突觸可塑性誘導(dǎo)密切相關(guān)的一種離子型谷氨酸受體，對突觸可塑性的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，參與學(xué)習(xí)和記憶的產(chǎn)生和維持功能［6］。NMDA 受體主要包括3 種亞型，分別是NR1，NR2（NR2A、NR2B、NR2C、NR2D）和NR3（NR3a、NR3b），廣泛分布在中樞海馬部位，其亞基NR1 和NR2B 與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降與NR1基因缺失相關(guān)，說明小鼠學(xué)習(xí)能力的損害由NR1基因缺失導(dǎo)致；同時電生理離體結(jié)果證實(shí)，小鼠學(xué)習(xí)能力障礙與NR1基因缺失引起小鼠前額葉腦區(qū)LTP受損密切相關(guān)［7］。宮曉洋等［8］研究證實(shí)，經(jīng)滋補(bǔ)脾陰方治療脾陰虛癡呆組大鼠后其記憶與學(xué)習(xí)能力提升，其可能的作用機(jī)制是滋補(bǔ)脾陰方使NR1 蛋白表達(dá)量增加，從而起到抗癡呆、抗衰老的作用。NR2B 基因缺失可以損害學(xué)習(xí)記憶能力，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)NR2B受體發(fā)現(xiàn)小鼠突觸電位的易化、學(xué)習(xí)能力和信息保留能力均較前明顯改善［9］。研究證實(shí)，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與NR2B 亞基表達(dá)減少相關(guān)，給予上調(diào)NR2B 亞基表達(dá)的藥物可使長時程作用增強(qiáng)，從而改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［10］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論和上述研究結(jié)果基本一致，失荅剌知丸能上調(diào)血管性癡呆大鼠的NR1和NR2B蛋白的表達(dá)。

清·劉智《天方性理》記載：“腦是為百脈之總原，而百體之知覺運(yùn)動皆賴焉?！保?1］回醫(yī)理論認(rèn)為人體的生命活動、感覺和運(yùn)動、思維和心理皆由腦主宰，且詳細(xì)記載人體的總覺、回憶、思慮、判斷、識記等五種不同思維活動的發(fā)生，與大腦的腦前、腦前之后、腦中、腦中之后和腦后不同結(jié)構(gòu)區(qū)域依次相對應(yīng)。回醫(yī)理論認(rèn)為血管性癡呆的主要病因病機(jī)由稟性衰敗、四液質(zhì)（腦白液質(zhì)、腦黑液質(zhì)、腦黃液質(zhì)、腦紅液質(zhì)）失調(diào)、腦偏干和腦偏濕所致，治療原則以芳香開竅醒神為主，且用藥多以熱性、干性的芳香藥為主。失荅剌知丸方出自《回回藥方》“眾風(fēng)門”篇，本研究組前期研究證實(shí)失荅剌知丸能改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［12］，其改善學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本文在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上觀察失荅剌知丸對血管性癡呆大鼠NMDA 受體（NR1、NR2B）的表達(dá)，結(jié)果顯示失荅剌知丸能改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其可能作用機(jī)制是上調(diào)NR1、NR2B蛋白的表達(dá)。