甲苯咪唑在團(tuán)頭魴體內(nèi)的物料平衡研究

胥寧，鄭全輝，劉永濤，周順，楊移斌，董靖，楊秋紅，艾曉輝

1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；

2.湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，武漢 430223；3.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025

甲苯咪唑（mebendazole，MBZ）屬于苯并咪唑類藥物，具有高效廣譜殺蟲性質(zhì)，對哺乳動物毒性低，廣泛應(yīng)用于人和動物消化道寄生蟲病的驅(qū)殺。1998 年MBZ被發(fā)現(xiàn)對平鲉單殖吸蟲具有良好的治療效果［1］，之后逐步應(yīng)用于水產(chǎn)寄生蟲的驅(qū)殺［2］。MBZ 進(jìn)入魚體之后，在一定時間內(nèi)會殘留在魚的可食性組織中，通過食物鏈可能會進(jìn)入人體之中。已有試驗(yàn)表明，苯并咪唑類藥物對人體具有一定的毒性作用，在使用此類藥物的過程中也曾出現(xiàn)過不良反應(yīng)，例如出現(xiàn)麻疹、過敏性休克和腦炎綜合征［3］。1994-2003 年間，我國報(bào)道了43例由MBZ 引起的腦病綜合癥病例，引起了社會的廣泛關(guān)注［4］。鑒于MBZ 的毒性作用，世界各國已經(jīng)制定了MBZ 在馬、羊等動物各組織中最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）。我國規(guī)定MBZ 在羊/馬的肝臟、腎臟、肌肉和脂肪中的MRL 分別為400、60、60 和60 μg/kg［5］。歐盟也制定了類似的MRL 標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定MBZ 及代謝物在綿羊、山羊和馬屬動物的肝臟、腎臟、肌肉和脂肪中的MRL 為400、60、60 和60 μg/kg［6］。國際食品法典委員會（CAC）規(guī)定MBZ 在畜產(chǎn)品肌肉中的MRL為60 μg/kg［7］。

雖然MBZ 已經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中批準(zhǔn)使用，但是并沒有相關(guān)規(guī)范限定其在水產(chǎn)品中的MRL。為了制定MBZ在魚體的MRL，必須明確其在魚體的吸收、分布以及排泄物和組織中MBZ 及代謝物回收量，即物料平衡。通過物料平衡研究，不僅可以深入了解藥物在動物體內(nèi)的處置過程［8］，還能提供代謝物組成和消除路徑等信息，進(jìn)而確定具有藥理活性或毒性的代謝物［9］。但是，目前MBZ 在魚體中的物料平衡研究還未見相關(guān)報(bào)道。因此，筆者選擇我國主要養(yǎng)殖品種團(tuán)頭魴作為研究對象，開展MBZ 的物料平衡研究，旨在為獸藥MBZ 在魚體中的MRL 的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

健康團(tuán)頭魴24 尾，體質(zhì)量（461.5±52.3）g，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所試驗(yàn)基地提供。試驗(yàn)前在6 個水族箱（100 cm×60 cm×80 cm）內(nèi)暫養(yǎng)1周，飼喂不加抗菌藥物的全價飼料。試驗(yàn)用水為曝氣48 h 的自來水，連續(xù)充氧，保持水中溶氧大于5.0 mg/L，pH為7.5～8.0，溫度25 ℃。

1.2 藥品和試劑

1）藥品。10%的甲苯咪唑溶液購自武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司；MBZ、羥基甲苯咪唑（hydroxy mebendazole，MBZ-OH）、氨基甲苯咪唑（amino mebendazole，MBZ-NH2）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

2）化學(xué)試劑。乙腈、甲酸（純度88%）、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純（購自美國J.T.Baker 公司）；二甲亞砜（色譜純，美國Tedia 公司）；肝素鈉（購自上海惠興生化試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，購自上海國藥集團(tuán)）。

1.3 試驗(yàn)采樣

6 尾團(tuán)頭魴分別飼養(yǎng)于6 個40 L 的玻璃容器中，固定每個容器中水的體積為20 L。MBZ 以20 mg/kg 劑量灌服給藥，分別在給藥后0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 d收集魚體生活環(huán)境的水樣1 L，每次收集完水樣之后，棄去剩余的水，置換相同體積的干凈水。在第8 天水樣采完之后，用經(jīng)0.5%的肝素潤洗的10 mL 的注射器從背主動脈采集每尾魚的血液，放入15 mL 離心管中，稱總質(zhì)量，然后以4 000 r/min 離心5 min，獲得血漿。接著用剪刀采集所有的鱗片和鰓；隨后用鑷子和剪刀采集所有的皮膚；打開腹腔采集心、肝、脾、腎、腸、膽、鰾和性腺，之后用手術(shù)刀和鑷子將背部的肌肉與骨骼分離，將腹部和尾部的肌肉從骨骼上剔下；最后采集完成之后，剩余的骨骼和頭部為剩余組織。對每種組織分別稱質(zhì)量，并且記錄，然后保存于-20 ℃，待檢測。

1.4 樣品處理

1）水中MBZ 及代謝物的提取。水樣20 mL，加入內(nèi)標(biāo)MBZ-d3，終質(zhì)量濃度為10 μg/L，過經(jīng)3 mL甲醇和3 mL 水活化的60 mg HLB 小柱（Waters 公司，美國），3 mL 去離子水洗，抽干。5 mL 甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈?，再加? mL 體積比為1∶1 的甲醇和0.01%甲酸水的混合液進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 的有機(jī)濾膜過濾，濾液供液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS）檢測。

2）血漿和組織中MBZ 及代謝物的提取。將勻漿冷凍的樣品室溫下自然解凍。稱取組織約1 g 或血漿1 mL（不足1 g 的組織，以實(shí)際質(zhì)量用于提取），于15 mL 具塞離心管中，準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)MBZ-d3，渦旋振蕩混合30 s，加入提取溶液乙腈10 mL，無水硫酸鎂0.75 g，氯化鈉0.25 g，渦旋振蕩提取1 min，7 000 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到另1 個15 mL 的離心管中，加入100 mg C18和中性氧化鋁粉（m：m= 1∶1），渦旋振蕩30 s，10 000 r/min 離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移到另1 個15 mL 的離心管中，在45 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL 50%的甲醇水溶液（含0.1% 的甲酸）復(fù)溶，10 000 r/min 離心5 min，過0.22 μm的有機(jī)濾膜，放于1.5 mL的進(jìn)樣瓶中，待測。

1.5 LC-MS/MS測定MBZ及代謝物的濃度

本試驗(yàn)樣品的測定都在LC-MS/MS（包括Suryeyor MS Pump Plus，Suryeyor Autosampler Plus，Thermo TSQ Quantum Access MAX）上完成，采用Thermo LCquan 2.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。LC-MS/MS參數(shù)如下：

液相色譜流動相的水相為pH 3.9 的10 mmol/L乙酸銨，有機(jī)相含5 mmol/L 乙酸銨、甲醇及乙腈，甲醇與乙腈的體積比為1∶9。

色譜柱為C18柱，150 mm×2.1 mm，粒徑3 μm。流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動相梯度如下：0～1 min，水相比例是10%；1～3 min，水相比例上升至50%，5 min 后上升至90%，維持到7 min，然后逐漸降低，到10 min 時降到10%。優(yōu)化的質(zhì)譜條件為霧化氣溫度338 ℃，鞘氣40 mL/min，輔助氣5 mL/min，離子傳輸管350 ℃，各個化合物的定量離子和定性離子見表1。

表1 甲苯咪唑及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of mebendazole and its metabolites

1.6 檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。配制MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH 的質(zhì)量濃度梯度均分別為1、2、5、10、20、50 和100 μg/L，內(nèi)標(biāo)MBZ-d3的質(zhì)量濃度均為10 μg/L，進(jìn)行HPLC-MS-MS分析。分別以各藥物與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），各藥物與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）精密度和準(zhǔn)確度的測定。藥物設(shè)定高中低3個質(zhì)量濃度（1、10、50 μg/L），添加基質(zhì)（肝、腎、肌肉、皮、血漿和鰓），用本文“1.4”中2）方法處理后，測定藥物質(zhì)量濃度，與添加質(zhì)量濃度相比獲得回收率?；|(zhì)添加樣品分為5 批，連續(xù)3 d 測定計(jì)算精密度。由于心、脾、腸、膽、鰾、鱗和性腺所得空白基質(zhì)較少，不能滿足檢測方法的建立要求。因此脾中藥物濃度的定量采用肝臟中的標(biāo)準(zhǔn)曲線；心、腸、鰾、鱗和性腺采用肌肉中的標(biāo)準(zhǔn)曲線；膽中藥物濃度采用血液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的適用性

水中MBZ、MBZ-OH 和MBZ-NH2定量限均可達(dá)到0.05 μg/L，血漿和組織中MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2均可以達(dá)到1 μg/kg。本試驗(yàn)獲得的MBZ、MBZ-OH 和MBZ-NH2的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y=0.1596x+1.0756 ，y=0.4387x-0.5571 ，y=0.2023x-0.07911。在1～100 μg/kg 線性良好，R值大于0.998。MBZ 及代謝產(chǎn)物在水中回收率在92.1%～107.9%，在團(tuán)頭魴組織和血漿中回收率在78.6%～103.1%，日內(nèi)和日間變異系數(shù)都在10%以內(nèi)（表2）。在基質(zhì)中各個化合物定量和定性離子均無干擾，滿足定量的要求。

表2 甲苯咪唑及其代謝產(chǎn)物在團(tuán)頭魴血漿及組織中回收率、日內(nèi)和日間變異系數(shù)Table 2 The recoveries，inter-day RSD，and between-day RSD of mebendazole and its metabolites in plasma and tissues of blunt snout bream（Megalobrama amblycephala）

2.2 MBZ及代謝物在團(tuán)頭魴各個組織中的回收量

本研究中，由于未檢測到其他代謝物，故MBZ的回收量以MBZ、MBZ-OH 和MBZ-NH2量的總和計(jì)。魚處死之后，從心、肝、脾、鰓、腎、腸、膽、鰾、鱗、肌肉、皮膚、血液和性腺中的回收量可達(dá)3 332.26～5 345.52 μg，占總回收量的39.45%～52.84%，占總給藥量的13.74%～23.74%（表3）。其中腸中的回收量最高，可達(dá)1 248.29～2 892.77 μg，占總回收量的17.99%～26.51%，占總給藥量的5.18%～12.85%。剩余組織中的回收量為987.22～1 907.19 μg，占總回收量的15.68%～25.50%，占總給藥量的5.19%～11.40%。水中的回收量在1 561.95～4 623.15 μg，占總回收量的23.78%～43.00%，占總給藥量的6.44%～21.88%。總的回收量在6 295.50～10 983.41 μg，回收率在27.09%～51.24%，平均為42.64%（表3）。

表3 甲苯咪唑在團(tuán)頭魴體內(nèi)和水中的回收情況Table 3 The recovery of mebendazoleinblunt snoutbream（Megalobrama amblycephala）and in water

3 討 論

3.1 MBZ在團(tuán)頭魴中的代謝規(guī)律

本研究結(jié)果表明，MBZ經(jīng)口服之后，在團(tuán)頭魴體內(nèi)主要是以MBZ、MBZ-OH 和MBZ-NH2形式存在。而對大鼠［10］、狗［11］和人［12］的MBZ 的代謝研究表明，MBZ 的主要代謝產(chǎn)物也為2-氨基-1H-苯并咪唑-5-苯基甲酮（MBZ-NH2）和甲基5-［（1-羥基-1-苯基）甲基-1H-苯并咪唑-2-基］氨基甲酸酯（MBZOH），其中，MBZ-NH2為MBZ 的氨基羧酸甲酯基水解之后的化合物，MBZ-OH 則是MBZ 的酮基被還原產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。在Meuldermans 等［13］的體外研究中發(fā)現(xiàn)，MBZ在豬、大鼠和狗的肝中主要代謝物為MBZ-OH，分別占總放射性活度的50%、58%和93%，代謝物MBZ-NH2也出現(xiàn)在豬肝的提取物中。另外Baliharová 等［14］在體外研究中也發(fā)現(xiàn)，MBZ 主要有2個代謝途徑，一是可以在大鼠、狗、山羊、綿羊、馬和牛的肝組織亞細(xì)胞成分中生成MBZ-OH；二是可以在馬和人的肝細(xì)胞中生成MBZ-NH2。這些研究表明，MBZ 在人和動物體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為MBZ-OH 和MBZ-NH2。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)MBZ 經(jīng)藥浴給予團(tuán)頭魴之后，主要代謝物也為MBZ-OH 和MBZ-NH2［15］。由此表明MBZ 在魚體中的代謝物的生成與給藥途徑無關(guān)。

3.2 MBZ在團(tuán)頭魴中的分布和排泄規(guī)律

本研究中，MBZ 及代謝物主要分布于團(tuán)頭魴的腸、肝及剩余組織，在腸中回收藥物以藥物原形為主，表明在給藥之后大部分MBZ 沒有被吸收進(jìn)入體內(nèi)。此結(jié)果與MBZ 在大鼠中的代謝研究結(jié)果類似。大鼠口服0.06～10 mg/kg 的14C-MBZ 之后，大部分藥物從胃腸道中回收，主要由未代謝的藥物原形組成，另外只有1%的放射性活度可以在血液中檢測到［10］。魚類的糞便和尿很難收集到，且魚的糞尿都排泄到水中，所以我們以水中藥物的回收量作為排泄物中的回收量。本研究中，MBZ 在水中的回收量為1 561.95～4 623.15 μg，占總回收量的32.32%。在人類中，MBZ 主要通過糞便排泄，只有9%的藥物是通過尿液排泄。在給藥后2～4 h，血液中藥物的質(zhì)量濃度只達(dá)到了27～42 μg/L［6］。在大鼠中，MBZ主要也是通過糞便排泄，回收量可達(dá)70%～90%，并且原形藥物占絕大部分。在給藥后1 h，大鼠的肝臟中未代謝的MBZ 占到了15%；4 h 之后，原形藥物的百分比下降到了1%［10］。在綿羊體內(nèi)，MBZ在糞便中的回收量可達(dá)73.1%，尿液中的回收量只有10.8%［6］。由此可見，MBZ 在人、大鼠和綿羊體內(nèi)，絕大部分是通過糞便排出體外，且回收百分比明顯高于團(tuán)頭魴，這可能與動物間的不同排泄機(jī)制有關(guān)。

3.3 MBZ在動物體中的回收

本研究中，MBZ 在團(tuán)頭魴體內(nèi)的回收率只有42.64%，明顯低于其他動物［6］。在其他動物中，研究者是采用放射性標(biāo)記法對MBZ 進(jìn)行藥物代謝和安全性評價，其物料平衡研究結(jié)果中的回收量都較高。這可能是由于，放射性同位素（14C 和3H）標(biāo)記的藥物被用于試驗(yàn)，采用特定的儀器檢測各個組織和排泄物中的放射性活度，從而達(dá)到了較高的回收率［8］。但是，此方法涉及到放射性物質(zhì)的安全管理等問題，需要特定的實(shí)驗(yàn)室和儀器才能完成，成本高昂，一般實(shí)驗(yàn)室無法完成。所以，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部標(biāo)準(zhǔn)《動物性食品中獸藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)規(guī)范（試行）》中做出了相應(yīng)的規(guī)定，對于已經(jīng)確定每日容許攝入量的獸藥，如果冷試驗(yàn)（采用非放射性標(biāo)記的藥物進(jìn)行試驗(yàn)）證明藥物的代謝行為與已知在其他靶動物的代謝行為（靶組織，殘留標(biāo)示物種類及含量與已知靶動物中類似）相同，只要將100%的每日容許攝入量按比例分配到全部組織+蛋/奶，根據(jù)WHO推薦的食物消費(fèi)系數(shù)，推導(dǎo)出各種組織和蛋/奶的MRL即可。如果冷試驗(yàn)證明藥物的代謝行為與已知在有關(guān)動物的代謝行為（靶組織，殘留標(biāo)示物種類及含量，殘留標(biāo)示物與總殘留比率）不同，則應(yīng)進(jìn)行放射性標(biāo)記藥物在靶動物中的殘留標(biāo)示物消除試驗(yàn)，之后建立MRL。本研究發(fā)現(xiàn)，MBZ 在魚體中的主要代謝產(chǎn)物與人和畜牧動物相同，除MBZ-OH 和MBZ-NH2外沒有檢測到其他代謝產(chǎn)物。因此，可以用非放射性標(biāo)記的MBZ 進(jìn)行物料平衡試驗(yàn)。雖然回收率比較低，但是明確了其在魚體的吸收、分布和排泄情況，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的目的。