亞磷酸脫氫酶作為篩選標(biāo)記基因在水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

劉同同，劉詩琦，袁麗麗，王創(chuàng)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/微量元素研究中心/

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游耕地保育重點實驗室，武漢 430070

建立在重組DNA 技術(shù)基礎(chǔ)上的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，幫助研究者將內(nèi)源或外源目的基因轉(zhuǎn)入植物［1］、動物［2］和微生物［3-4］中。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展，對人類經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活條件的改善做出了重要貢獻(xiàn)。作為最重要的糧食作物之一，利用遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行水稻品種改良日趨成為研究重點［5-6］。目前，常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是迄今為止應(yīng)用最早、研究最深入、應(yīng)用最廣泛且技術(shù)相對成熟的轉(zhuǎn)基因方法［7］。

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，為了從大量的受體細(xì)胞中快速準(zhǔn)確地篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，人們會將篩選標(biāo)記基因和目的基因共同導(dǎo)入受體細(xì)胞［8-9］。因此，發(fā)展安全高效且易于操作的篩選標(biāo)記基因成為基因工程研究的熱點之一。微生物遺傳轉(zhuǎn)化中常使用抗藥性基因和營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因進(jìn)行篩選［3］。除了應(yīng)用以上基因，動物遺傳轉(zhuǎn)化中還會使用熒光標(biāo)記基因進(jìn)行篩選［10］。目前植物遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用的篩選標(biāo)記主要有抗生素抗性基因和抗除草劑基因［11-12］，但是當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物創(chuàng)制完成后，篩選標(biāo)記基因?qū)⑹ダ脙r值，甚至存在潛在的危害［13-15］，主要表現(xiàn)在以下幾方面：（1）轉(zhuǎn)基因植物在開放環(huán)境下有可能與野生雜草發(fā)生自然雜交，使雜草對現(xiàn)有除草劑產(chǎn)生免疫作用；（2）篩選標(biāo)記基因可能傳播其他生物體抗性基因。但是當(dāng)創(chuàng)制完成轉(zhuǎn)基因植物后，篩選標(biāo)記基因?qū)⑹ダ脙r值，甚至其存在會造成生態(tài)失衡，可能會產(chǎn)生“超級害蟲”；（3）轉(zhuǎn)基因作物加工成的食品中攜帶篩選標(biāo)記基因，可能對人和動物的健康有害。因此，提高轉(zhuǎn)基因植物篩選標(biāo)記基因安全性成為研究熱點，使用無爭議的生物安全標(biāo)記基因是直接又有效的解決策略［16］。

磷是植物生長所必需的大量元素之一，但是植物只能利用五價的正磷酸鹽（phosphate，Pi）作為磷源。亞磷酸鹽（phosphite，Phi）是一種三價的磷酸鹽，可以通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被植物體吸收，但是不能被植物代謝。因此，Phi 不能作為一種植物磷源供植物生長，甚至?xí)χ参锏纳L發(fā)育產(chǎn)生抑制作用［17］。與植物不同，自然界中部分微生物含有亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），能夠?qū)⑽盏腜hi 氧化為Pi，進(jìn)而參與生理代謝。因此，這些微生物能夠吸收和利用Phi作為磷源。最早的ptxD基因克隆于假單胞菌WM88中［18］，隨后，Hirota 等［19］從羅爾斯通菌4506（Ralstoniasp.strain 4506）中分離得到活性更高的亞磷酸脫氫酶基因（ptxDR4506）。前期研究中，筆者所在研究團(tuán)隊利用定向進(jìn)化技術(shù)改造了ptxDR4506基因，獲得了催化效率更高的亞磷酸脫氫酶基因（ptxDQ），轉(zhuǎn)化ptx-DQ基因的水稻和擬南芥，能在低磷和正常供磷條件下，吸收和利用Phi為磷源［20］。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，建立以ptxDQ作為篩選標(biāo)記基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為開發(fā)安全高效的篩選標(biāo)記基因用于作物遺傳轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試粳稻品種為中花11（Oryza sativaL.ssp.japonicacv.Zhonghua 11，ZH11）。水稻表達(dá)載體為pCAMBIA1300 和pTF101-Ubi，其篩選標(biāo)記分別為潮霉素抗性基因（Hyg）和草銨膦抗性基因（Bar）。所用大腸桿菌菌株為DH5α，農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

1.2 載體構(gòu)建

首先用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ分別對2個載體進(jìn)行酶切，然后用AxygPrep DNA 凝膠回收試劑盒（康寧生命科學(xué)有限公司）回收線性化的載體。同時，利用PCR 擴(kuò)增我們前期改良的亞磷酸脫氫酶基因ptx-DQ［20］，引物序列ptxDQ-F：tgcaggtcgactctagagATGAAGCCGAAGGTGGTCCT，ptxDQ-R：tcgagctcggtacccgggTTAGGCGGCCTTCACGCCTGGGT，基因全長1 008 bp。按照無縫克隆試劑盒（蘇州神洲基因有限公司）的說明步驟，將PCR 產(chǎn)物和線性化載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入中大腸桿菌菌株DH5α中。利用菌液PCR 進(jìn)行陽性克隆篩選并測序驗證，然后將載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因過程

1）水稻愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖。挑選飽滿且無病菌感染的ZH11 水稻種子，表面滅菌后在水稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基R1（NB+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 g/L 脯氨酸+0.3 g/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+4.0 g/L非特膠）上誘導(dǎo)愈傷。挑選健康的愈傷組織于繼代培養(yǎng)基（R1+0.5 g/L 谷氨酰胺）上培養(yǎng)2周。將長到一定大小的水稻愈傷顆粒挑出，放入OD 值為0.5 的農(nóng)桿菌菌懸液中侵染30 min，然后將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上25 ℃暗培養(yǎng)2.5 d。水稻愈傷組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NB，由N6大量元素、B5微量元素和有機(jī)物配制而成。N6 培養(yǎng)基中包括：28 mmol/L KNO3、2.9 mmol/L KH2PO4、3.5 mmol/L（NH4）2SO4、1.1 mmol/L CaCl2、0.75 mmol/L MgSO4。B5 培養(yǎng)基中包括：4.5 μmol/L KI、48.5 μmol/L H3BO3、59.2 μmol/L MnSO4、12.4 μmol/L ZnSO4、1 μmol/L Na2MoO4、0.1 μmol/L CuSO4、0.1 μmol/L CoCl2。有機(jī)物包括：1 mg/L 鹽酸吡哆醇（VB6）、1 mg/L 煙酸、10 mg/mL 鹽酸硫胺素（VB1）及10 mg/mL 肌醇。

2）水稻愈傷組織的篩選。將愈傷組織取出，清洗干凈后置于選擇培養(yǎng)基（R1+篩選劑）上篩選陽性愈傷，其中亞磷酸鹽篩選培養(yǎng)基Phi-1（將R1 培養(yǎng)基中的2.9 mmol/L KH2PO4替換成1.5 mmol/L H3PO3+0.5 mmol/L KH2PO4），Phi-2（將R1 培養(yǎng)基中的 2.9 mmol/L KH2PO4替換成 3 mmol/L H3PO3+0.5 mmol/L KH2PO4）均無需額外添加抗生素。pCAMBIA1300-PtxDQ菌液侵染后的愈傷組織分別用50 mg/L 潮霉素、Phi-1 和Phi-2 進(jìn)行篩選，PTF101-PtxDQ菌液侵染后的愈傷組織分別用25 mg/L 草銨膦、Phi-1 和Phi-2 進(jìn)行篩選。14 d 更換1次培養(yǎng)基，經(jīng)過3輪選擇培養(yǎng)后統(tǒng)計篩選效率。

挑取生理狀態(tài)良好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（NB +0.5 g/L 脯氨酸+0.5 g/L 谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+30 g/L 山梨醇+8.0 g/L 瓊脂）中，26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約30 d，待幼苗長至5 cm 左右轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（NB+20 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂）中培養(yǎng)2 周左右，獲得轉(zhuǎn)基因水稻幼苗。

1.4 轉(zhuǎn)化植株分子檢測

TPS 法提取基因組DNA，取50 mg 轉(zhuǎn)基因植物葉片，加入500 μL TPS 抽提液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，1 mol/L KCl）研磨成勻漿后，75 ℃金屬浴孵育30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清于新的離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min，12 000 r/min 離心10 min，去除上清，加入500 μL 75% 乙醇漂洗沉淀2 次，室溫放置10 min 風(fēng)干表面殘留乙醇，加30 μL 滅菌ddH2O 溶解沉淀。

以轉(zhuǎn)基因植物的DNA 作為模板，使用ptxDQ引物（ptxDQ-F 和ptxDQ-R）和康為世紀(jì)2×EsTaqMaster Mix 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 程序根據(jù)說明書進(jìn)行設(shè)置。通過瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增出的條帶，條帶大小1 008 bp的為陽性植株。

1.5 水稻的營養(yǎng)液培養(yǎng)實驗

選取飽滿的水稻種子，浸泡在適量體積的1%硝酸溶液中，于黑暗的28 ℃培養(yǎng)箱中破休眠12 h，純水沖洗后，于黑暗的28 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽2～3 d，直到大部分種子完全露白。將種子播種于育苗盆中培養(yǎng)10 d，挑選長勢一致的幼苗，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)盒中，5 d 更換1 次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液按照國際水稻研究所水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)配方Y(jié)oshida solution 配制，主要包括1.425 mmol/L NH4NO3、0.513 mmol/L K2SO4、0.998 mmol/L CaCl2、1.643 mmol/L MgSO4、0.25 mmol/L Na2SiO3、0.009 mmol/L MnCl2、0.075 μmol/L（NH4）6Mo7O24、0.019 μmol/L H3BO3、0.155 μmol/L CuSO4、0.152 μmol/L ZnSO4、0.125 mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ）。在對PtxDQ轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行篩選時，移苗后使用的營養(yǎng)液中將323 μmmol/L NaH2PO4·2H2O 替換為323 μmmol/L H3PO3，處理約20 d 觀察水稻生長情況。溫室光照周期為12 h 光照/12 h 黑暗，光照強(qiáng)度為3 000 lx，白天培養(yǎng)溫度為30 ℃，夜間培養(yǎng)溫度為22 ℃。

1.6 水稻葉面噴施亞磷酸鹽試驗

按照本文“1.4”方法中描述的步驟育苗培養(yǎng)10 d，將幼苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)容器中，使用Yoshida solution 繼續(xù)培養(yǎng)。移苗之后對水稻葉片噴施不同濃度的H3PO3，共設(shè)置了4 個H3PO3濃度，分別為0、100、200、400 mmol/L。每3 d 噴施1 次，處理12 d 后，對水稻表型進(jìn)行拍照和統(tǒng)計生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞磷酸鹽對水稻愈傷組織生長的影響

分別利用野生型水稻ZH11 和前期研究中創(chuàng)制的ptxDQ超表達(dá)水稻種子誘導(dǎo)愈傷組織。將長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移至不用磷源的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)14 d，觀察亞磷酸鹽對水稻愈傷組織生長的影響。正常供磷的培養(yǎng)基中，野生型愈傷組織和ptxDQ超表達(dá)愈傷組織均能正常生長且沒有顯著差異（圖1A、B）。當(dāng)把培養(yǎng)基中無機(jī)磷酸鹽替換為不同濃度的亞磷酸鹽時，野生型愈傷組織停止生長，并最終發(fā)生褐化（圖1A）。相反，ptxDQ超表達(dá)的愈傷組織在供給不同亞磷酸鹽的條件下均能正常生長（圖1A）。此外，不同濃度亞磷酸供應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)基因愈傷的平均質(zhì)量顯著高于野生型愈傷組織（圖1B）。結(jié)果表明，ptxDQ基因作為篩選標(biāo)記基因配合亞磷酸鹽的體系（ptxDQ/Phi）可用于篩選水稻抗性愈傷組織。

圖1 亞磷酸鹽對水稻愈傷組織生長的影響Fig.1 The effect of phosphite on the growth of rice callus

2.2 ptxDQ作為篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化效率分析

為了比較ptxDQ/Phi 篩選體系與目前常用的水稻篩選體系間的差異，將ptxDQ基因分別裝載于pCAMBIA1300 和pTF101-Ubi 載體中，獲得pCAMBIA1300-PtxDQ和pTF101-PtxDQ載體（圖2A）。利用pCAMBIA1300-PtxDQ載體侵染水稻愈傷組織后，使用潮霉素和亞磷酸鹽分別篩選轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織。與此類似，利用pTF101-PtxDQ載體侵染水稻愈傷組織后，使用草銨膦和亞磷酸鹽分別篩選轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織。篩選結(jié)果表明，潮霉素和草銨膦作為篩選劑時，均能獲得有效的抗性愈傷，其中潮霉素篩選得到的抗性愈傷生長較快，而草銨膦篩選的陽性愈傷生長較慢（圖2B）。2 個不同濃度的亞磷酸鹽篩選的抗性愈傷生長沒有顯著差異，其生長速度介于潮霉素和草銨膦之間（圖2B）。進(jìn)一步比較潮霉素、草銨膦和亞磷酸鹽作為水稻轉(zhuǎn)基因的篩選效率發(fā)現(xiàn)，潮霉素作為篩選劑時，陽性愈傷獲得率為34.67%，而草銨膦作為篩選劑時，陽性愈傷獲得率僅14.33%（表1）。亞磷酸鹽作為篩選劑時，亞磷酸鹽濃度為1.5 mmol/L 時篩選效率為44.37%，亞磷酸鹽濃度為3 mmol/L時篩選效率為47.28%（表1）。

圖2 抗性愈傷組織的篩選Fig.2 The screening experiment of resistant callus

表1 不同篩選條件下水稻愈傷組織的篩選效率Table 1 Screeing rate of rice callus under different screening conditions

2.3 亞磷酸鹽篩選陽性轉(zhuǎn)基因水稻

獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株，在T1代和T2代還需要繼續(xù)篩選純合體。為了驗證ptxDQ/Phi 體系是否能高效廉價地篩選陽性水稻幼苗，將獲得的T1代ptx-DQ超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻種子發(fā)芽后，移栽至亞磷酸鹽替換正磷酸鹽的營養(yǎng)液中。培養(yǎng)20 d 后，野生型（WT）對照由于不能利用亞磷酸鹽作為磷源，不能在該營養(yǎng)液中生長（圖3A）。T1代ptxDQ超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)生明顯的分化，一部分幼苗能正常生長，另一部分幼苗與野生型對照類似，不能正常生長（圖3A）。利用PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，正常生長的幼苗均是轉(zhuǎn)基因陽性植株；相反，不能正常生長的植株則是陰性分離植株（圖3B），這說明亞磷酸鹽可以用來篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 亞磷酸鹽對轉(zhuǎn)基因水稻生長的影響Fig.3 The effect of phosphite on the growth of transgenic rice

2.4 葉面噴施亞磷酸篩選轉(zhuǎn)基因水稻

葉面噴施除草劑可用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因材料在溫室和田間的篩選。將培養(yǎng)10 d 的幼苗轉(zhuǎn)移至正常營養(yǎng)液中培養(yǎng)，葉面噴施不同濃度的亞磷酸鹽（圖4A）。結(jié)果顯示，隨著亞磷酸鹽濃度的增加，野生型水稻生長受到顯著抑制，而ptxDQ轉(zhuǎn)基因水稻噴施亞磷酸酸鹽后生長不受影響（圖4B、C），說明噴施亞磷酸鹽也可以用于篩選ptxDQ的轉(zhuǎn)基因水稻。

圖4 葉面噴施亞磷酸鹽對轉(zhuǎn)基因水稻生長的影響Fig.4 The effect of spraying phosphite on the growth of transgenic rice

3 討 論

生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，實現(xiàn)了異源或同源優(yōu)良基因到受體植物的快速轉(zhuǎn)化，并通過篩選標(biāo)記基因?qū)ο嚓P(guān)性狀進(jìn)行選擇。目前常用的抗生素類、抗除草劑類的篩選標(biāo)記基因有助于目標(biāo)植株的高效篩選，但它們對自然環(huán)境和人類健康存在的潛在危險逐漸顯露。因此，亟需挖掘更高效、靈敏和綠色安全的新型標(biāo)記基因［16-22］。

通過改變細(xì)胞代謝途徑，利用一些特別的營養(yǎng)物質(zhì)，比如亞磷酸鹽和氰胺等，改造微生物可以抑制發(fā)酵過程中雜菌的污染，同時避免使用抗生素對環(huán)境的危害［11］。與此類似，亞磷酸脫氫酶作為篩選標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于玉米、煙草和棉花等作物的轉(zhuǎn)基因過程，但是以上報道的亞磷酸脫氫酶來自于假單胞菌WM88 中［21］。與ptxDWM88相比，羅爾斯通菌4506 中的亞磷酸脫氫酶基因ptxD4506具有更高活性［19］。本研究使用的亞磷酸脫氫酶基因(ptxDQ)是利用定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)一步提高了ptxD4506 催化效率的突變蛋白基因。之前的研究證明，ptxDQ建立了ptxDQ/Phi 的植物磷利用系統(tǒng)，能賦予擬南芥和水稻高效利用亞磷酸鹽的能力［20］，這與國內(nèi)外的相關(guān)報道［21-24］總體一致。

ptxDQ作為選擇標(biāo)記基因的優(yōu)點主要有：（1）篩選方式簡單，節(jié)約篩選成本。在遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，將選擇培養(yǎng)基中的磷酸鹽替換成亞磷酸鹽即可達(dá)到篩選抗性愈傷組織的目的。對于攜帶ptxDQ選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，可以通過在培養(yǎng)體系中添加亞磷酸鹽或者葉面噴施亞磷酸鹽的方法，篩選出陽性轉(zhuǎn)基因植株。（2）不同于抗生素和除草劑類的負(fù)向篩選系統(tǒng)，亞磷酸鹽達(dá)到篩選目的同時又促進(jìn)了愈傷的生長，屬于正向篩選系統(tǒng)。（3）低濃度的亞磷酸鹽作為一種食品防腐劑使用，對動植物幾乎沒有毒性，不會危害人類的健康。（4）目前農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因中使用的抗生素或除草劑的篩選方式，對于土壤和地下水資源均有一定程度的潛在威脅，過度使用必將引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。但是ptxDQ作為選擇標(biāo)記基因可以有效規(guī)避環(huán)境污染問題，暴露于土壤中的亞磷酸鹽幾個月就會被氧化為正磷酸鹽，不會對環(huán)境造成污染。雖然ptxDQ作為選擇標(biāo)記基因的優(yōu)勢明顯，但是仍有其劣勢，即在水稻愈傷組織抗性篩選時，Phi篩選條件下的愈傷組織長勢較差。

本研究中愈傷組織抗性篩選的結(jié)果表明，ptxDQ基因結(jié)合亞磷酸鹽體系不僅用于篩選水稻抗性愈傷，而且比傳統(tǒng)的潮霉素和草銨膦系統(tǒng)具有更高的篩選效率。此外，相比于抗生素、除草劑和甘露糖等篩選系統(tǒng)，亞磷酸鹽篩選系統(tǒng)更靈敏、更便捷、更綠色環(huán)保［21］。這種基于亞磷酸鹽作為篩選劑，ptxDQ作為篩選標(biāo)記基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，提高了轉(zhuǎn)基因篩選效率，降低了篩選標(biāo)記基因?qū)ψ匀画h(huán)境的安全隱患，可為目前農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究中存在的一些問題提供有效解決方案，在農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究及育種中具有使用潛力。