硼氮互作對(duì)甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)、氮素吸收和籽粒產(chǎn)量的影響

王友強(qiáng)，趙哲，汪社亮，葉祥盛，劉清云，徐芳森

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/微量元素研究中心，武漢 430070；2.湖北省浠水縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黃岡 438000

油菜（Brassica napusL.）是我國(guó)重要的油料作物之一，主要用于人類食用油、動(dòng)物飼料和綠肥等，其中菜籽油在全國(guó)油料作物產(chǎn)油量的占比超過50%［1］。近年來隨著油菜產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，我國(guó)油菜種植面積每年約665.3 萬hm2，其種植產(chǎn)區(qū)主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江流域。目前我國(guó)油菜優(yōu)良品種籽粒產(chǎn)量高達(dá)2 048 kg/hm2，通過高產(chǎn)高效品種選育、養(yǎng)分綜合管理、病蟲草害綜合防治以及農(nóng)技配套措施的改良，我國(guó)油菜單產(chǎn)仍有巨大的增長(zhǎng)潛力［2］。

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，是限制作物產(chǎn)量的主要因素［3］。研究表明氮肥投入顯著提高了油菜籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)［4］，但低氮素利用效率的問題也越來越突出。因此，如何提高氮肥利用效率，減少氮肥投入是我國(guó)油菜綠色高效生產(chǎn)的重要目標(biāo)。同樣，硼是維管植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素［3］，在維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和花器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［5］。據(jù)報(bào)道，全世界80 多個(gè)國(guó)家地區(qū)的農(nóng)田中至少有132 種作物出現(xiàn)缺硼現(xiàn)象［6］。20 世紀(jì)70 年代，我國(guó)首次報(bào)道了油菜缺硼導(dǎo)致“花而不實(shí)”的現(xiàn)象［7］。油菜需硼量多，對(duì)硼缺乏敏感，施用硼肥是我國(guó)油菜主產(chǎn)區(qū)常用的施肥措施。然而，硼缺乏和毒害之間的濃度范圍狹窄，導(dǎo)致硼供應(yīng)不足或過量對(duì)油菜生產(chǎn)都會(huì)產(chǎn)生不利影響［8］。因此，研究油菜科學(xué)精準(zhǔn)施用硼肥的原理技術(shù)及其與其他養(yǎng)分肥料的優(yōu)化配合，對(duì)提高肥料利用率，促進(jìn)油菜綠色高效生產(chǎn)有重要的理論和實(shí)踐意義。

近年來，營(yíng)養(yǎng)元素間交互效應(yīng)研究成為熱點(diǎn)［9］。了解營(yíng)養(yǎng)元素之間的互作關(guān)系，有利于提高養(yǎng)分利用效率和改善作物生產(chǎn)。有研究指出，硼在固氮和硝酸鹽同化過程中起重要作用［10］。在煙草中，葉片和根系中硝酸鹽濃度的降低與低硼條件下硝酸鹽吸收速率降低有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，缺硼降低了煙草質(zhì)膜H+-ATP 酶活性，并促進(jìn)銨同化為天冬酰胺［11］。在油菜中，平衡硼和磷肥施用顯著提高了籽粒產(chǎn)量，并改善了根際土壤細(xì)菌群落的豐度和多樣性［12］。氮與其他元素交互效應(yīng)的生理分子機(jī)制已被廣泛報(bào)道，例如氮與磷［13］、鉀［14］、鋅［15］及鉬［16］等。然而，關(guān)于油菜中硼氮協(xié)同效應(yīng)的研究鮮有報(bào)道。在本研究中，我們利用水培體系探究了油菜硼氮交互效應(yīng)以及潛在的生理機(jī)制，并且通過2 a 的田間試驗(yàn)分析不同硼氮施肥配比對(duì)氮素吸收利用和籽粒產(chǎn)量的影響，闡明平衡硼和氮施用對(duì)油菜生產(chǎn)的協(xié)同效應(yīng)，并量化其最佳硼氮施肥配比，旨在為實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中硼氮養(yǎng)分綜合管理提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 油菜營(yíng)養(yǎng)液試驗(yàn)

油菜硼氮互作水培試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營(yíng)養(yǎng)生物學(xué)課題組光照培養(yǎng)室中進(jìn)行。光照培養(yǎng)室的溫度設(shè)置為22 ℃，光照周期為16 h（光照）/8 h（黑暗），光照強(qiáng)度為300～320 μmol/（m2·s），濕度為60%～75%。試驗(yàn)以甘藍(lán)型油菜品種Westar 10為研究材料。試驗(yàn)中選取大小一致的油菜種子，用1%NaClO 滅菌處理15 min 后再用純水將種子表面沖洗干凈，然后在4 ℃下用超純水（電導(dǎo)＞18.25 MΩ）浸泡12 h，之后將浸泡過后的種子均勻播種到育苗浮漂上催芽。7 d 后將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至盛有10 L 營(yíng)養(yǎng)液的黑色塑料盆中培養(yǎng)15 d。營(yíng)養(yǎng)液試驗(yàn)中的大量元素營(yíng)養(yǎng)液采用Hoagland 配方，微量元素營(yíng)養(yǎng)液采用Arnon 配方。缺氮處理導(dǎo)致減量的鉀和鈣用KCl和CaCl2來補(bǔ)充，每隔4 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液pH維持在5.8左右。

設(shè)置2 個(gè)氮供應(yīng)水平（0.12 和6 mmol/L NO3-）和2 個(gè)硼供應(yīng)水平（0.25 和25 μmol/L H3BO3），進(jìn)行完全交互處理，包括N0.12B0.25、N0.12B25、N6B0.25和N6B25，共計(jì)4 個(gè)處理。試驗(yàn)中每盆營(yíng)養(yǎng)液中移植54株油菜作為1 個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理進(jìn)行4 次獨(dú)立重復(fù)，并采用隨機(jī)完全區(qū)組排列。培養(yǎng)第15 天時(shí)，收獲油菜根系和地上部樣品，然后置于烘箱中105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。將烘干后的樣品研磨成粉末，用于氮含量的測(cè)定。另外，將新鮮的油菜根和葉分別取樣，然后快速放入液氮中，最后儲(chǔ)存到-80 ℃冰箱中，用于生理和分子指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 大田小區(qū)試驗(yàn)

本試驗(yàn)起始于2017 年9 月至2019 年5 月在湖北省武穴市梅川鎮(zhèn)郭坦村進(jìn)行。種植期間的氣溫和降水量數(shù)據(jù)由武穴市梅川鎮(zhèn)氣象局提供，第一（2017-2018）和第二（2018-2019）生長(zhǎng)季平均氣溫分別為15.6 和15.7 ℃，總降水量分別為859.6 和335.5 mm。試驗(yàn)點(diǎn)前茬作物為水稻，0～20 cm深的土壤基本理化性質(zhì)為：pH 5.18，有機(jī)質(zhì)37.16 g/kg，總氮1.06 g/kg，堿解氮103.3 mg/kg，Olsen-P 21.7 mg/kg，有效硼0.12 mg/kg。

試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)氮肥施用水平（純N：0、60、180、240 kg/hm2）和4 個(gè)硼肥施用水平（硼砂：0、4.5、9、18 kg/hm2），進(jìn)行不完全交互試驗(yàn)，共計(jì)11 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4 次。試驗(yàn)小區(qū)大小為4.0 m×1.2 m，供試油菜品種為Westar 10（簡(jiǎn)稱W10），進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。試驗(yàn)以尿素（46% N）、過磷酸鈣（12%P2O5）、氯化鉀（60% K2O）和硼砂（12% B）為肥源，其中氮肥70%作基肥、30%作越冬肥，磷肥、鉀肥和硼肥全部基施。田間生產(chǎn)管理按當(dāng)?shù)貙?shí)際生產(chǎn)措施進(jìn)行，并適時(shí)防治病蟲害。在油菜苗期和抽薹期，將取回的樣品清洗后于105 ℃殺青30 min，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱取干質(zhì)量，計(jì)算干物質(zhì)累積量。將樣品粉碎、混勻，裝入自封袋待測(cè)。成熟期，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的6株油菜，按莖稈、角果殼和籽粒進(jìn)行取樣，用于不同組織部位養(yǎng)分含量測(cè)定，最后小區(qū)剩余油菜全部收獲測(cè)實(shí)產(chǎn)。

1.3 葉片光合指標(biāo)測(cè)定

在大田油菜抽薹期，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜6 株，利用便攜式光合系統(tǒng)儀CIRAS-3（PP Systems，美國(guó)）從10：00 到14：00 測(cè)定完全展開葉片凈光合速率。參數(shù)設(shè)置如下：葉面溫度25 ℃；相對(duì)濕度60%～70%；CO2含量400 μmol/mol；光強(qiáng)1 200 μmol/（m2·s）；氣體流速300 mL/min。

1.4 氮含量及氮代謝酶活性測(cè)定

1）氮含量測(cè)定。采用H2SO4-H2O2方法將待測(cè)樣品消解，用連續(xù)流動(dòng)分析儀（AA3，SEAL Analytical GmbH）測(cè)定消解液中的氮素濃度。

2）硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性測(cè)定。使用試劑盒測(cè)定（科銘，中國(guó)蘇州）油菜不同組織部位中的NR 和GS 活性，具體步驟參照說明書進(jìn)行。其中NR 的單位（U/g）定義：每小時(shí)1 g 鮮質(zhì)量樣品中催化產(chǎn)生1 μmol NO2-的量為1 個(gè)NR 活力單位；GS 的單位（U/g）定義：1 g 組織在反應(yīng)體系中每30 min 使540 nm 下吸光值變化0.01 定義為1 個(gè)GS活力單位。

1.5 基因表達(dá)分析

使用Trizol 試劑（Invitrogen）提取樣品中總RNA，詳細(xì)步驟參考試劑說明書。將提取的總RNA按照TRUEscript RT kit with gDNA Eraser（Aidlab，中國(guó)北京）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄，從而獲得cDNA 的第1 條鏈。通過QuantstStudio 6 Flex 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)），使用Abclonal 2 × Universal SYBR Green Fast qPCR Mix Kit（Abclonal，中國(guó)武漢）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）。EF-1α作為內(nèi)參基因，并通過2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔΔCT=（CT目標(biāo)基因-CTEF-1α）處理組-（CT目標(biāo)基因-CTEF-1α）對(duì)照組。分析油菜中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族1（NRT1）和家族2（NRT2）關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)水平的變化。表1中列出了相關(guān)基因引物信息。

表1 本研究中qRT-PCR分析所用引物Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis in this study

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，使用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和可視化。數(shù)據(jù)的顯著性分析采用單因素方差分析（LSD test）和雙因素方差分析（?ídák’s test）。

2 結(jié)果與分析

2.1 硼氮配施對(duì)田間油菜生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響

為探究硼氮配施對(duì)油菜田間生產(chǎn)的影響，我們?cè)?017―2019 年設(shè)置了不同硼氮施肥配比處理（表2）。研究結(jié)果表明，在苗期、抽薹期和成熟期，隨著氮肥施用量的增加，地上部生物量顯著增加；硼肥施用顯著提高了地上部生物量，但與氮肥施用量密切相關(guān)。統(tǒng)計(jì)分析也表明硼和氮肥施用顯著影響了油菜不同生育時(shí)期生物量的累積，且兩者之間存在顯著的交互作用（P＜0.05）。在低氮（60 kg/hm2）條件下，油菜全生育時(shí)期生物量的累積在不同硼肥施用量間差異不顯著；在正常氮（180 kg/hm2）條件下，不施硼嚴(yán)重抑制了油菜不同生育時(shí)期地上部生物量的積累，且隨著生育時(shí)期的延長(zhǎng)，硼肥處理效果越來越顯著；在高氮（240 kg/hm2）條件下，當(dāng)硼肥施用量達(dá)到18 kg/hm2時(shí)，成熟期地上部生物量的累積有下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，相比于單一施用氮肥和硼肥，硼氮配施顯著促進(jìn)了不同生育時(shí)期生物量的累積。

由表2可知，隨著施氮量的增加（0～240 kg/hm2），油菜籽粒產(chǎn)量顯著增加。在低氮（60 kg/hm2）條件下，不同硼肥施用量之間未觀察到顯著的產(chǎn)量變異；在正常氮（180 kg/hm2）條件下，硼肥施用顯著增加了2017―2019年的油菜產(chǎn)量，在硼肥施用量為4.5 kg/hm2時(shí)，籽粒產(chǎn)量達(dá)到最大值；在高氮（240 kg/hm2）條件下，隨著硼肥施用量的增加（4.5～18 kg/hm2），油菜產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與不施氮（0 kg/hm2）和不施硼（0 kg/hm2）處理相比，硼氮配合施用使油菜產(chǎn)量提高了177.8%～772.4%。雙因素統(tǒng)計(jì)分析也說明了硼氮之間存在極顯著的交互作用（P＜0.01）。

表2 硼氮配施對(duì)2017―2019年兩季田間試驗(yàn)油菜不同時(shí)期生物量及產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of N and B fertilizers co-application on the seed yield and biomass of rapeseed at different growth stages in 2017―2019 field experiments

2.2 硼氮配施對(duì)油菜抽薹期光合作用的影響

在抽薹期，測(cè)定了油菜葉片光合能力對(duì)不同硼氮配施處理的響應(yīng)（圖1），結(jié)果表明，缺氮導(dǎo)致油菜葉片凈光合速率顯著降低，隨著氮肥施用量的增加，凈光合速率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，表明氮肥缺乏和過量都不利于油菜葉片進(jìn)行光合作用。在低氮（60 kg/hm2）條件下，硼肥施用對(duì)光合作用具有一定的改善作用，在施用硼肥9 kg/hm2時(shí)凈光合速率最大，但在2018―2019 生長(zhǎng)季并未發(fā)現(xiàn)顯著差異；在正常氮（180 kg/hm2）條件下，不施硼肥（0 kg/hm2）嚴(yán)重抑制了油菜光合作用，隨著硼肥施用量的進(jìn)一步增加（4.5～18.0 kg/hm2），硼肥顯著提高了油菜葉片光合速率，但不同硼處理間差異不顯著；在高氮（240 kg/hm2）條件下，與正常氮相比，高氮投入會(huì)降低油菜葉片的光合速率，并且配合高硼施用會(huì)進(jìn)一步抑制了2017―2018 年油菜葉片的光合速率。通過對(duì)兩年結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明硼和氮施肥處理對(duì)油菜葉片光合速率影響極顯著（P＜0.001），且硼氮之間存在極顯著的交互作用（P＜0.001）。此外，硼氮配施對(duì)油菜抽薹期光合作用和生物量的影響與成熟期產(chǎn)量表現(xiàn)相似，說明抽薹期生物量的累積對(duì)于成熟期產(chǎn)量至關(guān)重要。

圖1 硼氮肥配施對(duì)2017－2019年兩季田間試驗(yàn)抽薹期油菜葉片凈光合速率的影響Fig.1 Effects of N and B fertilizers co-application on net photosynthetic rate of rapeseed leaves at bolting stage in 2017－2019 field experiments

2.3 硼氮配施對(duì)油菜成熟期氮素吸收累積以及氮素收獲指數(shù)的影響

由圖2 可知，隨著氮肥施用量的增加，莖稈、角果殼和籽粒中氮素累積量顯著增加。在低氮（60 kg/hm2）條件下，施硼提高了2017―2018 年各組織部位氮素累積量，但在2018―2019 年差異并不顯著；在正常氮（180 kg/hm2）條件下，隨著硼肥施用量的增加地上部氮素總累積量先增加后下降，在施硼量為4.5～9 kg/hm2時(shí)氮素吸收積累顯著升高。值得注意的是，不施硼（0 kg/hm2）嚴(yán)重限制了氮素在籽粒中的累積，說明硼缺乏減少了氮素在籽粒中的分配比例，而增加了莖稈、角果殼等營(yíng)養(yǎng)器官中的分配比例；在高氮（240 kg/hm2）條件下，隨著硼肥用量的增加，各組織部位中氮素累積呈顯著下降的趨勢(shì)，表明高氮配高硼不利于氮素在成熟期各組織部位的積累?？傊?，硼氮配施交互效應(yīng)顯著（P＜0.01），促進(jìn)了氮素在不同組織部位的累積以及氮素向籽粒中分配。

圖2 硼氮肥配施對(duì)2017－2019年兩季田間試驗(yàn)成熟期氮素在油菜不同組織中累積量的影響Fig.2 Effects of N and B fertilizers co-application on the N accumulation in different tissues of rapeseed at maturity in 2017－2019 field experiments

進(jìn)一步分析氮素收獲指數(shù)（表3），結(jié)果表明不施氮（0 kg/hm2）和低氮（60 kg/hm2）條件下，氮素收獲指數(shù)顯著提高，但不同硼處理間差異不顯著；在正常氮（180 kg/hm2）條件下，不施硼（0 kg/hm2）和高硼（18 kg/hm2）均對(duì)氮素收獲指數(shù)具有顯著的抑制作用，這與氮素吸收累積結(jié)果相一致。因此，適宜的硼肥用量可顯著改善氮肥利用效率，進(jìn)而增加籽粒產(chǎn)量。值得注意的是，硼氮配施對(duì)氮素收獲指數(shù)的影響在2017―2018 年生長(zhǎng)季存在極顯著的交互作用（P＜0.01），但在2018―2019 年無顯著差異（P＞0.05）。

表3 硼氮配施對(duì)2017－2019年兩季田間試驗(yàn)油菜成熟期氮素收獲指數(shù)的影響Table 3 Effects of N and B fertilizers co-application on the N harvest index of rapeseed at maturity in 2017－2019 field experiments

2.4 不同硼氮供應(yīng)水平對(duì)水培油菜苗期生物量及氮素累積量的影響

大田小區(qū)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硼氮之間存在顯著的交互效應(yīng)，為了進(jìn)一步分析其潛在的生理機(jī)制，我們利用營(yíng)養(yǎng)液體系設(shè)置了2 個(gè)氮水平和2 個(gè)硼水平的交互處理。如圖3 所示，在不同供氮（0.12 和6 mmol/L）水平下，根系生物量隨著硼水平的增加分別提高了2.8倍和1.1 倍。增加硼供應(yīng)顯著提高了正常氮條件下油菜地上部的生物量，而在低氮條件下差異不顯著（圖3 A 和B）。此外，在缺氮條件下，增加硼供應(yīng)造成油菜根冠比顯著增加了2.1 倍（圖3 C）。結(jié)果表明在長(zhǎng)期硼缺乏條件下，根系生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，與氮素供應(yīng)水平無關(guān)。對(duì)于氮素吸收累，研究發(fā)現(xiàn)在不同氮水平（0.12 和6 mmol/L）下，正常供硼顯著增加了根系中的氮素積累（圖3 D）。然而，在低氮（0.12 mmol/L）條件下，地上部的氮素積累沒有顯著變化（圖3 E）。與低氮低硼處理（0.12 mmol/L N+0.25 μmol/L B）相比，在氮硼供應(yīng)充足（6 mmol/L N+25 μmol/L B）的情況下，根和地上部的氮素積累量顯著增加了5.0 和10.7 倍。值得注意的是，減少硼供應(yīng)改善了低氮（0.12 mmol/L）條件下油菜根系氮素吸收能力，但抑制了正常氮（6 mmol/L）水平根系氮素吸收能力（圖3 F），這些結(jié)果說明不合理的硼氮配比不利于油菜生長(zhǎng)以及氮的吸收累積。另外，雙因素統(tǒng)計(jì)分析也表明硼和氮處理間差異顯著，且具有極顯著的交互作用（P＜0.01）。

圖3 硼氮交互處理對(duì)水培油菜苗期干物質(zhì)質(zhì)量（A，B）、根冠比（C）、氮素累積量（D，E）和根系氮素吸收能力（F）的影響Fig.3 Effects of B and N interaction treatment on dry matter weight（A，B），root/shoot ratio（C），the N accumulation（D，E）and root N uptake capacity（F）of rapeseed seedlings in the hydroponic experiment

2.5 不同硼氮供應(yīng)水平對(duì)水培油菜苗期氮代謝相關(guān)酶活性的影響

為探究硼氮交互處理是否會(huì)影響氮同化代謝過程，我們測(cè)定了不同氮硼交互處理下硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性（圖4）。與低硼（0.25 μmol/L）處理相比，增加硼供應(yīng)顯著提高了不同氮水平下油菜根系NR 和GS 活性，這表明充足的硼供應(yīng)對(duì)于維持油菜苗期根系氮素代謝的重要性。與低氮低硼（0.12 mmol/L N+0.25 μmol/L B）處理相比，在氮和硼供應(yīng)充足（6 mmol/L N+25 μmol/L B）的情況下，根系NR 和GS 活性分別提高了2.0 和6.2 倍（圖4 A、C）。在正常氮條件下（6 mmol/L），葉片NR和GS活性隨硼供應(yīng)水平的增加而顯著增加。然而，在低氮條件下（0.12 mmol/L），不同硼處理間葉片NR 和GS 活性差異不顯著。同樣，與低氮低硼（0.12 mmol/L N + 0.25 μmol/L B）處理相比，在氮和硼充足（6 mmol/L N+25 μmol/L B）的情況下，葉片NR 和GS 活性分別增加了62.2%和75.4%（圖4 B、D）。通過雙因素方差分析進(jìn)一步表明不同硼氮處理對(duì)氮代謝酶活性具有顯著的交互作用（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，與缺氮或缺硼相比，平衡硼和氮素供給顯著改善了油菜苗期氮素同化代謝過程。

圖4 硼氮交互處理對(duì)水培油菜苗期根系和葉片中硝酸還原酶（A，B）和谷氨酰胺合成酶（C，D）的影響Fig.4 Effects of B and N interaction treatment on nitrate reductase（A，B）and glutamine synthase（C，D）in root and leaf of rapeseed seedlings in the hydroponic experiment

2.6 不同硼氮供應(yīng)水平對(duì)水培油菜苗期氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的影響

鑒于硼氮交互處理對(duì)油菜氮素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有顯著的影響，我們分析了氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。如圖5 所示，基因NRT1.1s、NRT1.5s、NRT2.2s和NRT2.5s主要在油菜根中表達(dá)且在不同硼處理間差異顯著。在低氮（0.12 mmol/L）條件下，減少硼供應(yīng)顯著提高了基因NRT1.5s、NRT2.2s和NRT2.5s的表達(dá)水平，這表明低氮低硼處理有利于提高氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，提高了根系氮素吸收能力。在這些基因中，NRT2.5s受缺氮誘導(dǎo)表達(dá)尤為顯著，在低氮脅迫下促進(jìn)油菜氮素吸收過程中發(fā)揮主要功能。在正常氮（6 mmol/L）條件下，硼缺乏顯著抑制了基因NRT1.1s、NRT1.5s和NRT2.2s的表達(dá)水平，造成根和地上部氮素積累量顯著減少。統(tǒng)計(jì)分析也進(jìn)一步明確硼氮處理對(duì)氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)具有顯著的影響，且交互作用極顯著（P＜0.001）?？傊?，平衡硼和氮供給顯著改善了氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖5 硼氮交互處理對(duì)水培油菜苗期根系和葉片中NRT家族基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of B and N interaction treatment on the expression level of NRT family genes in the root and leaf of rapeseed seedlings in the hydroponic experiment

3 討 論

近年來，甘藍(lán)型油菜硼和氮營(yíng)養(yǎng)的生理和分子機(jī)制得到廣泛研究［17-18］，但硼與氮之間的互作關(guān)系以及背后的生理機(jī)制鮮有研究報(bào)道。

根系是植物從土壤獲取氮素營(yíng)養(yǎng)的主要器官，發(fā)達(dá)的根系有利于養(yǎng)分物質(zhì)的吸收利用［19］。油菜通過促進(jìn)主根伸長(zhǎng)和增加側(cè)根密度來響應(yīng)低氮脅迫［20］。不同的是，缺硼更容易造成根系生長(zhǎng)發(fā)育受阻，根尖生長(zhǎng)點(diǎn)壞死［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氮或高氮條件下，油菜苗期根系生長(zhǎng)發(fā)育均受到缺硼抑制。然而，缺硼對(duì)地上部的影響主要發(fā)生在正常供氮條件下。這些結(jié)果表明油菜根系對(duì)硼缺乏的響應(yīng)要優(yōu)先于缺氮，同時(shí)增加氮供應(yīng)水平會(huì)加劇地上部缺硼反應(yīng)。本研究表明，硼氮交互處理對(duì)油菜氮素吸收累積存在顯著的影響。與單一硼或氮養(yǎng)分供給相比，硼氮配合供給顯著提高了油菜根系氮素吸收能力和累積量，這可能與硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)水平的增強(qiáng)以及氮同化代謝的改善顯著相關(guān)。此外，增加硼供應(yīng)濃度顯著提高了不同氮水平下根系中氮素吸收，這表明硼在維持根系生長(zhǎng)、促進(jìn)氮素吸收過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明硼缺乏降低了煙草中根系硝酸鹽的吸收速率［11］。但是，我們研究發(fā)現(xiàn)減少硼供應(yīng)對(duì)低氮脅迫下根系氮素吸收能力有一定的改善作用，低氮低硼處理下硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因NT2.2s和NRT2.5s的表達(dá)水平的增強(qiáng)進(jìn)一步確認(rèn)了這一結(jié)果。NRT2 家族基因已經(jīng)被證明在根系響應(yīng)低氮脅迫促進(jìn)硝酸鹽吸收中發(fā)揮重要的功能［22］。盡管在低氮低硼處理中氮吸收相關(guān)基因的表達(dá)水平有所改善，但受限于缺硼對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響，我們并未發(fā)現(xiàn)氮素累積量在根系中顯著增加。然而，隨著氮水平的增加，硼缺乏顯著抑制了硝酸鹽吸收基因NRT2.2s和NRT1.1s的表達(dá)水平，導(dǎo)致根系氮素吸收顯著降低。此外，硼缺乏促進(jìn)了低氮條件下氮素木質(zhì)部裝載基因NRT1.5的表達(dá)，而在正常氮條件下表現(xiàn)出相反的結(jié)果。這表明低氮配低硼可能會(huì)增加氮從根到地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致低氮條件下地上部氮累積量在不同硼水平之間差異不顯著。這些結(jié)果表明硼供應(yīng)水平顯著影響了油菜氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，并且硼氮之間存在顯著的交互作用。植物吸收硝酸鹽必須經(jīng)過一系列同化反應(yīng)，最終才能被植物利用［3］。本研究結(jié)果表明，硼和氮素在油菜氮代謝過程中表現(xiàn)出顯著的交互效應(yīng)，硼氮配合供給顯著改善了油菜根系中NR和GS的活性。對(duì)于地上部的生長(zhǎng)而言，硼缺乏對(duì)生物量、氮吸收和氮代謝的負(fù)面影響只在正常供氮的情況下觀察到。這表明增加氮素供應(yīng)水平會(huì)進(jìn)一步加劇油菜地上部缺硼癥狀。總而言之，與低氮或低硼相比，硼氮平衡供給顯著改善了氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝酶活性，共同促進(jìn)了油菜的生長(zhǎng)和發(fā)育。

本研究結(jié)果表明，不同的硼氮配施處理對(duì)油菜生長(zhǎng)發(fā)育、養(yǎng)分吸收以及產(chǎn)量形成有不同程度的影響，適宜的硼氮配施有顯著的正向增效作用。前人研究表明氮和硼肥施用顯著提高了油菜籽粒產(chǎn)量［17，23］，這與本研究結(jié)果相一致。然而，我們進(jìn)一步證明了硼肥施用效果與土壤氮素供應(yīng)水平顯著相關(guān)，且硼氮之間存在顯著的交互效應(yīng)。在低氮（60 kg/hm2）條件下，不同硼施用水平對(duì)油菜苗期、薹期和成熟期地上部生物量以及籽粒產(chǎn)量的影響較小，這與我們水培苗期試驗(yàn)結(jié)果相一致。在氮素脅迫環(huán)境下，土壤氮素供應(yīng)水平是產(chǎn)量形成的關(guān)鍵限制因子，而對(duì)硼需求量較小［24］。但在正常氮（180 kg/hm2）條件下，不施硼（0 kg/hm2）顯著抑制了氮素吸收累積以及向種子中的再分配。在成熟期，油菜籽粒中的氮素主要來自營(yíng)養(yǎng)器官中氮素再分配［25］。本研究結(jié)果表明減少氮肥供應(yīng)水平提高了油菜氮素收獲指數(shù)，而不施硼肥顯著降低了氮素收獲指數(shù)，這與缺硼抑制油菜庫(kù)器官（籽粒）的發(fā)育緊密相關(guān)［5］。因此，適宜硼肥供應(yīng)不僅促進(jìn)了氮素吸收，還改善了成熟期氮素向籽粒中的分配，進(jìn)而提高油菜籽粒產(chǎn)量。

值得注意的是，高氮（180 kg/hm2）配施高硼（18 kg/hm2）顯著降低了氮素吸收累積量，造成減產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。這表明平衡硼氮供應(yīng)對(duì)油菜生長(zhǎng)發(fā)育和籽粒產(chǎn)量的形成至關(guān)重要。同時(shí)，也說明硼肥最佳施用水平范圍極窄，缺乏或過量都不利于油菜生產(chǎn)［8］。在抽薹期，適宜硼氮配施顯著提高了油菜葉片光合作用能力，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期生物量的累積，這對(duì)成熟期產(chǎn)量的形成提供了保證［26］。另外，田間試驗(yàn)受到外界環(huán)境影響較大，研究結(jié)果表明2017―2018 年不同硼氮配施處理效果明顯優(yōu)于2018―2019 年，這可能與2018―2019 年降水量顯著低于2017―2018 年有關(guān)?？偠灾?，油菜苗期水培試驗(yàn)以及大田施肥配比試驗(yàn)都表明硼氮養(yǎng)分之間存在著顯著的交互作用。優(yōu)化硼氮施肥配比是促進(jìn)油菜綠色高效生產(chǎn)的重要措施之一。在本研究田間生產(chǎn)條件下，油菜適宜氮肥推薦用量為180～240 kg/hm2，同時(shí)搭配4.5～9 kg/hm2的硼砂施用量，可以最大限度地提高油菜增產(chǎn)潛力。