PCR熒光探針?lè)z測(cè)4種生殖道病原體的結(jié)果分析

劉意,馮霞,李宇,魏虹娟，張立麗,何盼,婁金麗(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069)

引起性傳播疾病的主要病原體包括淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae, NG)、解脲脲原體(Ureaplasmaurelyticum，Uu)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, CT)、單純皰疹病毒-2型(herpes simplex virus,HSV-2)等[1]，雖引起疾病臨床表現(xiàn)各不相同，但可造成男性尿道炎、附睪炎、前列腺炎等及女性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎盆腔炎甚至流產(chǎn)等危害[2-3]，部分人群表現(xiàn)為無(wú)癥狀而被忽視，造成上行感染及并發(fā)癥。選取靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法可為治療預(yù)案提供支持?，F(xiàn)就首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院2021年1—8月采集的生殖道分泌物及血液樣本，采用PCR熒光探針?lè)?、培養(yǎng)法、膠體金法、酶聯(lián)法進(jìn)行NG、Uu、CT及HSV-2抗體項(xiàng)目檢測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2021年1月—2021年8月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染中心性病門診就診者1 738例。男性907例，年齡18～63歲，平均年齡37歲；女性831例，年齡16～59歲，平均年齡34歲。臨床診斷主要為梅毒、尖銳濕疣、查體及疑似淋病、尿道炎、陰道炎、生殖器皰疹。共采集宮頸分泌物644例、陰道分泌物187例、尿道分泌物907例、血液標(biāo)本227例。患者及家屬均知情同意。

1.2標(biāo)本采集 男性尿道拭子：采樣前1～2 h不要排尿，使用無(wú)菌拭子伸入尿道2～4 cm處輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)3～5 s，取出拭子放入無(wú)菌收集管中保存。女性宮頸拭子：采樣前，使用棉球?qū)m頸外黏液拭去，使用陰道窺器暴露子宮頸口，用無(wú)菌棉拭子插入患者的子宮頸內(nèi)口與鱗狀上皮細(xì)胞交界處旋轉(zhuǎn)15～20 s后取出，放入無(wú)菌收集管中保存。女性陰道拭子：避開月經(jīng)期，使用無(wú)菌棉拭子采集陰道分泌物，將無(wú)菌棉拭子放入無(wú)菌收集管中保存。血液標(biāo)本：用普通采血管采集。

1.3試劑及儀器 PCR熒光探針試劑盒(湖南圣湘公司)，NG、Uu(培養(yǎng)法)試劑盒(安圖生物公司)，CT(膠體金法)試劑盒(上海凱創(chuàng)公司)，HSV-2型(酶聯(lián)法)試劑(Trinity Biotech Plc公司)；7500熒光PCR儀(ABI公司)，全自動(dòng)酶聯(lián)儀(Tecan公司)，全自動(dòng)生物質(zhì)譜分析儀(BRUKER公司)。

1.4PCR熒光探針?lè)?樣本收集管中加入1 mL無(wú)菌生理鹽水，棉拭子反復(fù)擠壓，作為待測(cè)樣本。按比例加入反應(yīng)液及酶混合液備用，分別加入陰、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控品及待測(cè)樣本，加入核酸釋放劑進(jìn)行加樣處理，瞬時(shí)離心后，按說(shuō)明書規(guī)定儀器設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為目標(biāo)基因的Ct參考值為38，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的Ct參考值為40。

1.5培養(yǎng)法

1.5.1NG培養(yǎng) 將采集的分泌物標(biāo)本立即分區(qū)接種巧克力培養(yǎng)基中，將平皿放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)48 h培養(yǎng)后如有濕潤(rùn)、光滑、水滴樣半透明菌落，挑取菌落加入基質(zhì)液中，將樣品板放入全自動(dòng)生物質(zhì)譜分析儀中進(jìn)行檢測(cè)，按照數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜鑒定結(jié)果。

1.5.2Uu培養(yǎng) 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：因分解尿素使指示劑變色，若指示劑由黃轉(zhuǎn)紅，判為陽(yáng)性。

1.5.3CT檢測(cè)(膠體金法) 向樣品處理管中加入6滴溶液A，采集的分泌物標(biāo)本加入處理管中不斷旋轉(zhuǎn)并在管壁擠壓拭子，使液體不斷被擠出，重復(fù)2 min。加入6滴溶液B，旋轉(zhuǎn)并擠壓拭子，盡量使液體流出，然后按感染物品的處理方法將拭子丟棄，將樣品處理管中已處理的樣品滴加2～3滴至檢測(cè)試劑盒的加樣孔中，在15 min后判斷結(jié)果。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為除質(zhì)控線外，在檢測(cè)線出現(xiàn)紅線。

1.5.4HSV-2型抗體檢測(cè)(酶聯(lián)法) 將采集后血液樣本離心后放至加樣架，將試劑分別放至固定位置，按照全自動(dòng)酶聯(lián)儀工作站編制檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為cut-off值=校準(zhǔn)品平均吸光度值×校正因子，ISR值=患者血清樣本吸光度值/cut-off值，ISR值≥1.10為陽(yáng)性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 24.0軟件進(jìn)行。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同方法檢測(cè)Uu結(jié)果比較 478例用PCR熒光探針與培養(yǎng)法共同檢測(cè)Uu，其中，男性176例，女性302例。PCR熒光探針?lè)z測(cè)陽(yáng)性率38.7%(185/478)，培養(yǎng)法陽(yáng)性率39.96%(191/478)，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.16，P>0.05), 兩種方法符合率91.21%(436/478)，陽(yáng)性符合率87.43%(167/191)，陰性符合率93.73%(269/287)。見表1。

表1 PCR熒光探針?lè)ê鸵后w培養(yǎng)法結(jié)果比較

2.2不同方法檢測(cè)CT結(jié)果比較 654例用PCR熒光探針與膠體金法共同檢測(cè)CT，其中，男性369例，女性285例。PCR熒光探針?lè)z測(cè)陽(yáng)性率7.34%(48/654)，膠體金法陽(yáng)性率3.21%(21/654)，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.15，P<0.001), 兩種方法符合率95.26%(623/654)，陽(yáng)性符合率90.48%(19/21)，陰性符合率95.42%(604/633)。見表2。

表2 PCR熒光探針?lè)ê湍z體金法結(jié)果比較

2.3不同方法檢測(cè)NG結(jié)果比較 379例用PCR熒光探針與培養(yǎng)法共同檢測(cè)NG，其中，男性274例，女性105例。PCR熒光探針?lè)z測(cè)陽(yáng)性率9.50%(36/379)，培養(yǎng)法陽(yáng)性率7.65%(29/379)，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.83，P>0.05), 兩種方法符合率98.15%(372/379)，陽(yáng)性符合率100%(29/29)，陰性符合率98%(343/350)。見表3。

表3 PCR熒光探針?lè)ê团囵B(yǎng)法結(jié)果比較

2.4不同方法檢測(cè)HSV-2型結(jié)果比較 227例用PCR熒光探針與酶聯(lián)法共同檢測(cè)HSV-2型，其中，男性91例，女性136例。PCR熒光探針?lè)z測(cè)陽(yáng)性率3.52%(8/227)，酶聯(lián)法陽(yáng)性率10.57%(24/227)，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.61，P<0.05), 兩種方法符合率92.51%(210/227)，陽(yáng)性符合率33.33%(8/24)，陰性符合率99.51%(202/203)。見表4。

表4 PCR熒光探針?lè)ê兔嘎?lián)法結(jié)果比較

3 討論

本次PCR熒光探針和培養(yǎng)法檢測(cè)Uu、NG結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCR熒光探針?lè)z測(cè)Uu的檢出率與培養(yǎng)法相近(38.7%、39.96%)，與王勤婉等[3]研究一致。24例PCR熒光探針?lè)幮?、培養(yǎng)法陽(yáng)性的樣本中，3例培養(yǎng)出人型支原體。經(jīng)分析，同樣能分解尿素的還有微小支原體(Up)，Up也是引發(fā)支原體感染的一種病原體，因無(wú)法將Uu和Up區(qū)分開[4]，因此推測(cè)培養(yǎng)法檢測(cè)的有可能是Uu和Up兩種總的脲原體，并且有少數(shù)雜菌也可造成假陽(yáng)性。而PCR熒光探針?lè)ㄅ溆刑禺愋砸锟蛇M(jìn)行Uu單項(xiàng)檢測(cè)，兩種方法不一致結(jié)果需要使用能夠分型檢測(cè)的方法加以證實(shí)。

NG的檢出率略高于培養(yǎng)法，7例PCR熒光探針陽(yáng)性、培養(yǎng)法陰性樣本中，2例經(jīng)調(diào)查均確診為淋病，使用頭孢曲松8～13 d后復(fù)查為陽(yáng)性，分析為治療后死亡的病原體；5例尿急、尿痛，無(wú)明顯淋病癥狀，按淋病治療后癥狀消失，1個(gè)月后檢測(cè)陰性。

PCR熒光探針?lè)ê湍z體金法檢測(cè)CT中， PCR探針?lè)z出率高于膠體金法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞培養(yǎng)法是目前檢測(cè)CT的金標(biāo)準(zhǔn)，但在實(shí)際應(yīng)用中該種方法受采集、儲(chǔ)存、污染等原因影響較大[5]。膠體金法用于檢測(cè)抗原，檢測(cè)時(shí)間短且操作簡(jiǎn)單，在我國(guó)臨床上廣泛采用，但敏感性較低，且結(jié)果受分泌物采集方式、采集量多少及人工判讀結(jié)果誤差等諸多因素影響。Kelly等[6]研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)抗原CT敏感性及特異性分別為53%、99%，特異性強(qiáng)但敏感性低，而PCR核酸檢測(cè)特異性及敏感性高，分別為98%、99.4%。本次研究與以上數(shù)據(jù)基本相近，有2例核酸檢測(cè)陰性樣本繼續(xù)隨訪監(jiān)測(cè)中。

PCR熒光探針?lè)ê兔嘎?lián)法檢測(cè)HSV-2中，檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCR探針?lè)z出率低于酶聯(lián)法，與張立麗等[7]研究數(shù)據(jù)基本一致。酶聯(lián)法檢測(cè)既可證實(shí)既往感染，有利于回顧性診斷，同時(shí)也可用于恢復(fù)期或復(fù)發(fā)性皰疹的診斷。16例PCR探針?lè)幮?、酶?lián)法陽(yáng)性，說(shuō)明在現(xiàn)癥感染中PCR探針?lè)ǜ哂袃?yōu)勢(shì)。

PCR探針?lè)ㄔ跈z測(cè)隱匿感染和癥狀不明顯的淋病患者時(shí)優(yōu)于培養(yǎng)法[8]；檢測(cè)CT可提高亞臨床或無(wú)癥狀感染患者的檢出率，優(yōu)于膠體金法；檢測(cè)Uu雖特異性較高，但無(wú)法進(jìn)行藥物敏感性分析，不能指導(dǎo)臨床合理用藥，無(wú)法區(qū)分定植或其他分型支原體；HSV檢測(cè)更適用于現(xiàn)癥感染的檢測(cè)，不適用于既往或復(fù)發(fā)的診斷。PCR熒光探針?lè)ň哂忻舾行愿摺⒉僮鞣奖?、污染性低等?yōu)點(diǎn)[9]，單管取材即可檢測(cè)多種病原體檢測(cè)，并且可以尿液作為檢測(cè)樣本，無(wú)入侵式采樣方式更容易被接受,但僅依據(jù)核酸陽(yáng)性(PCR 探針?lè)z測(cè))進(jìn)行治療可能存在過(guò)度治療和抗菌藥物濫用的風(fēng)險(xiǎn)，還需結(jié)合臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)接觸史及多種方法判斷。